JPH0373271B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、650U／ｇよりも高いプロテアーゼ
生産能及び3.5U／ｇよりも高いグルタミナーゼ
生産能を有する新規な麹菌及び育種法に関する。 〔技術の背景及び従来技術の説明〕 醤油は、アミノ酸の旨味を主体とする調味料で
あるために、醤油の醸造において、窒素の利用率
を向上してアミノ酸の生成量を多くすること、及
びグルタミン酸の生成量を向上することは重要な
ことであり、これらのことは醤油の醸造において
考慮されている。したがつて、醤油の醸造では、
強力なプロテアーゼ及びグルタミナーゼを生産し
うる麹菌を育種することは極めて重要なことであ
る。 これまでに醤油の醸造に使用されていた麹菌に
は、500〜650U／ｇの高いプロテアーゼ生産能を
有する菌株のグルタミナーゼ生産能は0.25〜
1.5U／ｇのように低いか、または3.0〜8.0U／ｇ
の高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株のプロ
テアーゼ生産能は100〜400U／ｇのように低いと
いう傾向があつた。 このために、これまでの醤油の醸造では、プロ
テアーゼ生産能の高い菌株を使用すると、醤油原
料の可溶性窒素の溶解利用率は向上するが、グル
タミナーゼ生産能が低いために諸味液汁における
グルタミン酸の生成が少なく、旨味の豊富な醤油
が得難い傾向があり、またグルタミナーゼ生産能
の高い菌株を使用すると、プロテアーゼ生産能が
低いために醤油原料の可溶性窒素の溶解利用率を
向上することができない。 これまでに、プロテアーゼ生産能及びグルタミ
ナーゼ生産能の高い優秀な麹菌を得るために、麹
菌の菌株を人工変異処理することが試みられたが
（特開昭57−174087号公報）、麹菌の人工変異処理
によつて麹菌のプロテアーゼ生産能またはグルタ
ミナーゼ生産能のどちらか一方だけを向上した菌
株を得ることはできるが、双方の生産能を共に向
上した菌株を得ることは非常に困難であつた。 本発明者らは、麹菌のプロテアーゼ生産能及び
グルタミナーゼ生産能の双方の向上した菌株を得
ることを企図して、多くの検討を行なつた結果、
アスペルギルス属に属する菌株、特にアスペルギ
ルス・ソーヤに属する菌株であつて、プロテアー
ゼ生産能の高い菌株と、グルタミナーゼ生産能の
高い菌株をプロトプラスト融合し、得られた融合
細胞を高張再生培地において培養すると、プロテ
アーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能の双方の高
い融合２倍体株が得られること、ここで得られた
融合２倍体株を親株として半数体化処理を行なう
と、親株に比べてプロテアーゼ生産能及びグルタ
ミナーゼ生産能の双方が高い菌株を育種をしうる
こと、およびこの半数体化処理によつて得られた
菌株の中に650U／ｇよりも高いプロテアーゼ生
産能及び3.5U／ｇよりも高いグルタミナーゼ生
産能を有する菌株のあることを見出し、これらの
知見にもとづいて本発明に到達したのである。 〔発明の目的及び発明の要約〕 本発明の目的は、プロテアーゼ生産能およびグ
ルタミナーゼ生産能の双方の酵素生産能の高い麹
菌を提供することにある。 本発明は、アスペルギルス属に属する菌株であ
つて、650U／ｇよりも高いプロテアーゼ生産能
及び3.5U／ｇよりも高いグルタミナーゼ生産能
を有することを特徴とする麹菌であり、また本発
明のもう１つの発明は、アスペルギルス・ソーヤ
に属する菌株であつて、プロテアーゼ生産能の高
い菌株及びグルタミナーゼ生産能の高い菌株のそ
れぞれの培養細胞からプロトプラストを得るこ
と、これらをプロトプラスト融合して、融合細胞
を得ること、該融合細胞を高張再生培地において
培養し、得られた培養物からプロテアーゼ生産能
及びグルタミナーゼ生産能の双方の酵素生産能の
高められた融合２倍体株を得ること、ここに得ら
れた融合２倍体株を半数体化処理をすることを特
徴とするアスペルギルス・ソーヤに属する菌株で
あつて、650U／ｇよりも高いプロテアーゼ生産
能及び3.5U／ｇよりも高いグルタミナーゼ生産
能を有する麹菌の育種法である。 〔発明の具体的な説明〕 本発明の、アスペルギルス属に属する菌株であ
つて、650U／ｇよりも高いプロテアーゼ生産能
及び3.5U／ｇよりも高いグルタミナーゼ生産能
を有する麹菌は、以下に述べる方法によつて育種
される。たとえば、アスペルギルス・ソーヤに属
する菌株を親株とした場合は、アスペルギルス・
ソーヤに属する菌株が育種され、またアスペルギ
ルス・オリゼーに属する菌株を親株とした場合
は、アスペルギルス・オリゼーに属する菌株が育
種され、さらにアスペルギルス・ニガーに属する
菌株を親株とした場合は、アスペルギルス・ニガ
ーに属する菌株が育種されるのである。また異な
る種同志を親株として育種することもできる。 本発明の麹菌を育種するに際して、先ずアスペ
ルギルス属に属する菌株であつて、高いプロテア
ーゼ生産能を有する菌株の分生胞子が栄養培地に
おいて培養され、これとは別に、アスペルギルス
属に属する菌株であつて、高いグルタミナーゼ生
産能を有する菌株の分生胞子が栄養培地において
培養される。 アスペルギルス属に属する菌株であつて、高い
プロテアーゼ生産能を有する菌株（親株）として
は、アスペルギルス属に属していて、高いプロテ
アーゼ生産能を有する菌株であれば、いかなるも
のであつても、これを使用することができる。し
たがつて、醤油、味噌または清酒の醸造に使用す
る麹菌の中から、プロテアーゼ生産能の高い菌株
を検索することによつて、上記の親株を容易に入
手することができるが、たとえば、アスペルギル
ス・ソーヤATCC 42249、アスペルギルス・ソー
ヤATCC 43250、アスペルギルス・ソーヤATCC
42251及びアスペルギルス・オリゼー460（FERM
−ＰNo.1149）の各菌株を使用することができる
が、これらの変種または変異株を使用することも
できる。 またアスペルギルス属に属する菌株であつて、
高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株（親株）
としては、アスペルギルス属に属していて、高い
グルタミナーゼ生産能を有する菌株であれば、い
かなるものであつても、これを使用することがで
きる。したがつて醤油、味噌または清酒の醸造に
使用する麹菌の中からグルタミナーゼ生産能の高
い菌株を検索することによつて、上記の親株を容
易に入手することができるが、たとえば、アスペ
ルギルス・ソーヤ262（FERM Ｐ−2128）、アス
ペルギルス・ソーヤ2165（FERM Ｐ−7280）及
びアスペルギルス・オリゼー（IAM2638）の各
菌株を使用することもできる。 上記の菌株（親株）の分生胞子を培養する栄養
培地は、麹菌が必要とする栄養源を含む培地であ
れば、いかなる培地であつてもこれを使用するこ
とができるが、たとえば、ツアベツク（Czapek）
培地に、0.5％の酵母エキス及び0.2％のカザミノ
酸を加え、pHを6.0に調整したものを、水で10倍
に希釈した培地（以下において「ツアベツク変形
培地」と略記する）、他の合成培地、半合成培地
あるいは天然培地を使用することができる。合成
培地における炭素源としては、グルコース、サツ
カロース等、窒素源としては硫酸アンモニウム、
硝酸アンモニウム等を使用することができ、また
天然培地における炭素源としては、割砕小麦、麦
皮等、窒素源としては、スキムミルク、脱脂大豆
等を使用することができる。さらに上記の培地
に、リン酸、カリウム、マグネシウム、カルシウ
ム等の無機塩類を加えることができ、さらにな
お、菌の生育に必要なアミノ酸、ビタミン等を必
要に応じて培地に添加することもできる。 通常の場合、培養は25〜35℃の温度において行
なわれ、ほとんどの発芽胞子の長さ（胞子とそこ
から伸びる菌糸の長さを合わせたもの）が、もと
の胞子（培養開始時）の外径の５〜15培に生育す
るのに充分な時間（通常、５〜15時間）、静置、
振とうまたは通気培養等の好気的条件において培
養する。 またこの培養は、固体培養によることもでき
る。固体培養を行なう場合、麦皮、小麦などの炭
素源、大豆などの窒素源、その他の有機質あるい
は無機質を原料とし、これらを蒸煮などの殺菌処
理をした後に、種菌を接種混合し、25〜38℃で、
発芽胞子の長さがもとの胞子外径の５〜15倍にな
るように生育するのに充分な時間、無菌的に培養
するのが好ましい。これらの培養において、発芽
胞子の長さが、もとの胞子外径の５倍未満である
と、この後に行なう麹菌のプロトプラストをほと
んど形成することができず、また15倍を超える
と、麹菌のプロトプラストの形成率が非常に低く
なるので好ましくない。 次に、こうして得られた培養細胞からプロトプ
ラストを得るには、上記各々の発芽胞子につい
て、10⁶〜10⁸個／ml（高張液）の濃度の発芽胞子
ケン濁液を調製し、各調製ケン濁液を等量混合
し、遠心分離して集菌したのち、これに予じめ無
菌処理した細胞壁溶解酵素を添加し処理するか、
又は各々の発芽胞子ケン濁液を遠心分離して集菌
したのち、これを最初、細胞壁溶解酵素を添加し
て処理を行い、次いで各処理液を等量混合するこ
とにより得られる。 ここに用いられる細胞壁溶解酵素としては、麹
菌の細胞壁を溶解する活性を有するものであれば
いずれもよく、セルラーゼ、β−１，３−グルカ
ナーゼ及びキチナーゼ等を単独、または混合して
用い、或いは一般に細胞壁溶解酵素として用いら
れている混合酵素等を用いることができる。本発
明者らが実験したところ、これらの酵素のうちβ
−１，３−グルカナーゼとキチナーゼを併用する
と、麹菌のプロトプラストの形成率を著しく高め
ることが判明したので、上記２つの酵素を併用す
ることが好ましい。 上記キチナーゼとしては、キチナーゼ活性を有
する酵素剤が用いられ、例えば米国ICN社製キチ
ナーゼNo.100466、米国シグマ社製キチナーゼNo.Ｃ
−6137、生化学工業社販売キチナーゼ・フアンガ
ル（fungal）No.100290等が挙げられる。 またβ−１，３−グルカナーゼとしてはキリン
ビール社製、ザイモリアーゼ（Zymolyase）
5000、同60000及び本発明者らが微生物バチラ
ス・サーキユランスIAM1165及びストレプトマ
イセス0143（FERM Ｐ−7276）のそれぞれの培
養液から調製した２つの粗酵素等が挙げられる
が、特に後者の２つの粗酵素が好ましい。 上記バチラス・サーキユランスIAM1165から
調製した粗酵素及びストレプトマイセス0143株か
ら調製した粗酵素は以下のようにして得られたも
のである。 〔1〕 バチラス・サーキユランスIAM1165からの
粗酵素調製法 肉エキス１％、ポリペプトン１％、麹菌温潤
菌体２％及び水からなる培地（PH7.2）１を
５容三角フラスコに入れ、高圧減菌したもの
に、麹菌湿潤菌体を入れない以外は上記と全く
同じ培地で前培養（30℃で48時間）したバチラ
ス・サーキユランスIAM1165の種菌液10mlを
接種し、30℃で48時間、振とう培養（170r.p.
m.）した。こうして得た培養液から粗酵素を
得るには、これを遠心分離して上清液を分離取
得し、これに硫安を加えて常法により塩析し、
生成した沈澱区分を採取した。これを水25mlに
溶解し、セロフアンチユーブに入れ、１夜５℃
で蒸留水を用いて透析処理し、得られた透析内
液を凍結乾燥し、粗酵素（以下、「バチラス・
サーキユランス起源の粗酵素」と称す）を得
た。 〔2〕 ストレプトマイセス0143からの粗酵素調製
法 培地組成 １ KH₂PO₄ 0.2％ 酵母エキス 0.05％ Kcl 0.05％ グルコール 0.25％ MgSO₄・7H₂O 0.1％ ネオペプトン 0.1％ Nacl 0.05％ NaNO₃ 0.1％ 麹菌湿潤菌体 2.1％ 蒸留水 1.0 PH 5.0 上記組成の培地１（PH5.0）に、これと同一組
成の培地にて前培養したストレプトマイセス
0143（FERM Ｐ−7276）の種菌液10mlを接種
し、30℃で培養液のPHが7.0に上昇する迄（７
日間）、振とう培養（170r.p.m.）した。以下、
上記バチラス・サーキユランスの培養液から粗
酵素を得る方法と全く同様にして、培養液から
粗酵素（以下、「ストレプトマイセス起源の粗
酵素」と称す）を得た。 尚、上記で得られる２つの粗酵素は、β−
１，３−グルカンを基質として、常法によりβ
−１，３−グルカナーゼ活性の有無を調べた結
果、強力に基質を分解することが確認され、β
−１，３−グルカナーゼとして使用できること
が判明した。 また、洗滌し、ホモゲナイズされた麹菌湿潤
菌体を含む寒天平板培地に上記の両粗酵素は作
用し、透明なハローを形成することから、該粗
酵素はいずれも麹菌菌体の細胞壁を溶解するこ
とも確認された。 次に、麹菌の発芽胞子と細胞壁溶解酵素との処
理条件について説明する。すなわち、細胞壁溶解
酵素の使用濃度は、麹菌発芽胞子の細胞壁を溶解
し、完全なプロトプラストを得るのに充分な濃度
とすることが好ましく、例えばバチラス・サーキ
ユランス起源の粗酵素の場合、10〜50mg／ml、好
ましくは25〜35mg／mlである。またキチナーゼを
併用する場合、その使用濃度は１〜10mg／ml、好
ましくは３〜５mg／mlである。酵素処理の時間は
麹菌の細胞壁を溶解し、プロトプラストを得るの
に充分な時間とすることが必要で、通常30分〜６
時間が好ましい。またPHは6.0〜7.0、特に6.5が好
ましい。 次いで、酵素処理が終了したら、菌体を保護す
る洗滌液、例えば0.7〜1.5Mソルビトール或いは
0.5〜1.0M塩化カリウム溶液等で、菌体を洗し、
麹菌の細胞壁が溶解除去されたプロトプラストを
得る。 次に、ここで得られたプロトプラストの融合処
理及び融合プロトプラストの再生は、例えば、
Anne等の方法〔J.Gen.Microbiol.、92、413
（1976）〕に準じて行うことができる。 即ち、0.7〜1.5M・ソルビトール、５〜100ｍ
Ｍ・CaCl₂及び30〜80ｍＭグリシンを含む15〜33
％ポリエチレングリコール6000（PH7.5）中に、上
記で得られた高プロテアーゼ生産株と高グルタミ
ナーゼ生産株のそれぞれの洗滌プロトプラストを
添加混合し、20〜30℃で15〜45分処理することに
よりプロトプラスト融合細胞を得ることができ
る。 次に、こうして得られたプロトプラスト融合細
胞の再生は、プロトプラストを保護しつつ細胞壁
を再生することが可能な高張再生培地、例えば
0.7〜1.5Mのソルビトールを含む米麹汁（又は麦
芽汁）に寒天２％を含有させた高張再生寒天培地
（PH6.5）及び、0.7〜1.5Mのソルビツトを含むツ
アペツク液体培地に寒天２％を含有させた高張最
小再生寒天培地（PH6.5）に上記で得られたプロ
トプラスト融合細胞を移し、25℃〜35℃で２〜10
日間培養する方法により行なわれる。こうして、
プロトプラストの融合細胞は、その周囲に細胞壁
が再生し、培地上で生育して再生コロニーを形成
する。 次に、こうして得られた再生コロニーから、プ
ロトプラスト融合細胞の選別は、予じめその親株
である高プロテアーゼ生産株と、親株である高グ
ルタミナーゼ生産株の洗滌プロトプラストについ
て、それぞれ融合細胞の場合と同様に再生させ、
得られた再生コロニーの形態学的性質（色相、色
彩、明度、光沢、形状、大きさ等）及び生理学的
性質等の特徴を把握しておくことによつて、それ
らとは異なる特徴を備えた再生コロニーとして、
選別採取することができる。 尚、上記高プロテアーゼ生産株と高グルタミナ
ーゼ生産株のそれぞれの親株の分生胞子に、人工
変異処理（Ｘ線、紫外線等の照射、ニトロソグア
ニジン、エチルメチルサルフイート等の化学変異
処理）を施して、それぞれ親株の分生胞子に特徴
ある色や各種の栄養要求性、例えばアラニン、メ
チオニン等のアミノ酸要求性、ビオチン、ニコチ
ン酸、バラアミノ安息香酸等の要求性を付与した
変異株を得、この変異株を親株として上記と同様
に酵素処理、プロトプラスト融合処理を行ない、
次いで再生し、再生コロニーとすると、親株であ
る変異株は特徴ある色を有し、この色を有しない
プロトプラスト融合細胞を明確に区別し、採取す
ることができる。また栄養要求変異株のプロトプ
ラストは再生の際、特定の栄養源が存在しないと
生育出来ないので、特定の栄養源が存在しなくて
も生育できるプロトプラスト融合細胞を容易に区
別し採取することができる。このように両親株に
色及び栄養要求性等のマーカーを付しておくと、
目的とする融合細胞の分離操作が極めて容易とな
る。 上記で得られる高プロテアーゼ生産株の変異株
としては、例えば分生胞子が白色で、バラアミノ
安息香酸要求性の付与されたアスペルギルス・ソ
ーヤW2−91（FERM Ｐ−7277）が挙げられ、ま
た高グルタミナーゼ生産株の変異株としては、例
えば分生胞子が黄色で、ニコチン酸要求性の付与
されたアスペルギルス・ソーヤM12−２−61
（FERM Ｐ−7281）等が挙げられる。 次に、こうして高張再生培地で再生したプロト
プラスト融合株は、ヘテロカリオンである場合が
多いので親株に戻り易く、不安定である。そこ
で、これらへテロカリオン株の分生胞子に、小田
等の方法〔Agric.Biel.Chem.、27、758（1963）〕
に従つて、紫外線照射（距離39cm、１〜５分）を
施し、検定することによつて、安定な融合２倍体
株を得ることができる。 例えば、アスペルギス・ソーヤＤ−78はこうし
て得た高プロテアーゼ生産能を育し且つ高グルタ
ミナーゼ生産能を有する安定な融合２倍体株であ
り、工業技術院微生物工業技術研究所（以下、微
工研と略記する）に、微工研菌寄第7279号として
寄託されている。 次に、こうして得られた融合２倍体株の分生胞
子を半数体化処理する。 尚、ここに言う融合２倍体株は、以下に示すよ
うに吻合融合により得られた株も同様に使用する
ことができる。即ち、２種のダブミユータント
（栄養要求性、胞子の変色）の胞子を吻合用培地
（糖度10、米麹汁培地PH5.5）に混合接種を行な
い、23℃で７日培養し、うすく増殖した部分より
胞子をツアペツク培地に抜き出し、30℃で３日培
養するとヘテロカリオンが増殖してくる。ヘテロ
カリオンの増殖によつて２倍体は10^-5〜10^-7の頻
度で自然に生成し、分離することができる。ここ
においては、緑色のコロニーのみが２倍体である
から、白、黄、混合のヘテロカリオンとは容易に
区別される。この２倍体から、プロテアーゼ生産
能とグルタミナーゼ生産能を共に有する、好まし
くは共に高い菌株を選択分離して、目的とする麹
菌の吻合融合による２倍体を得ることができる。 本発明において、融合２倍体株を半数体化処理
することは最も重要であつて、該処理によつて融
合２倍体株である親株に比べてプロテアーゼ生産
能とグルタミナーゼ生産能の双方が同時に向上し
た麹菌を容易に育種することができる。 そして、従来全く知られていない新しいタイプ
の、650U／ｇより多い、高プロテアーゼ生産能
を育し且つ3.5U／ｇより多い、高グルタミナー
ゼ生産能を有する麹菌を育種することができる。 半数体化処理の方法としては、種々の方法が挙
げられるが、このうち半数体化剤による方法が好
ましい。半数体化剤としては、バラ・フルオロフ
エニルアラニン〔Ｐ−Fluorophenylalanine（Ｐ
−FPAと略記する）〕、メチル−１−ブチル−カ
ルバモイル−２−ベンズイミダゾール〔methyl
−１−butyl−carbamoyl−２−bezimidazoie
（benomylまたはベノミルと略記する）〕、１，２
−ビス（３−メトキシカルボニル−２−チオウレ
イド）ベンゼン〔１，２−bis（３−methoxy−
carbonyl−２−thioureido）benzen（thiephanate
−metylまたはチオフアネート・メチルと略記す
る）〕、２−（4′−チアゾールイル）−ベンズイミダ
ゾール〔２−（４−thiazolyl）−benzimidazole
（thiabendazoleまたはチアベンダゾールと略記す
る）〕及び２−（２−フリル）ベンズイミダゾール
〔２−（２−furyl）benz−imidazole
（fuberidazoleまたはフベリダゾールと略記す
る）〕等が挙げられる。 そして、これらは単用或いは併用することがで
きる。 半数体化処理の方法としては、融合２倍体株を
半数体株とするのに充分な温度の半数体化剤を含
む栄養寒天培地に、上記で得られた融合２倍体株
を接種し、麹菌の生育適温に保持してコロニーを
形成させ、そこから釣菌することにより行なわれ
る。 即ち、半数体化剤として、バラ・フルオロフエ
ニルアラニンを用いる場合は、この剤を10〜
300μｇ／ml、好ましくは50〜150μｇ／ml含有す
る、米麹汁寒天培地等の栄養寒天平板培地に、上
記で得られた融合２倍体株を常法により点植し、
25〜35℃の麹菌の生育適温で、識別できるセクタ
ー（Sector；扇形）を伴つた巨大コロニーが形成
される迄充分な時間（２〜14日）培養し、セクタ
ーの部分から釣菌することにより得られる。 一方、半数体化剤として、ベノミル、チオフア
ネートメチル、チアベンダゾール、フベリダゾー
ルを用いる場合は、これらの剤を0.01〜8p.p.m.
好ましくは1.5〜3.5p.p.m.となる如く溶解した栄
養寒天培地に、上記で得られた融合２倍体株の分
生胞子を塗沫し、麹菌の生育適温25〜35℃で２〜
10日培養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離す
ることによつて、本発明による菌株を取得するこ
とができる。尚、この際、半数体化されなかつた
融合２倍体株（親株）は、半数体化された菌株が
生育する濃度の半数体化剤を含有した培地では、
半数体化株なみに生育しないコロニーとして現わ
れるので、融合２倍体株と半数体化株とは明確に
区別できる。なお、このように半数体化処理によ
り得られたコロニーの中から釣菌して得られる菌
株の中には分生胞子の色と栄養要求性が交さした
組み換え型と考えられる株が多数みられる。この
ことから釣菌した菌株は半数体と推定される。 次に、こうして釣菌した数多くの半数体株の中
から、プロテアーゼ及びグルタミナーゼの酵素生
産能を測定することにより、650U／ｇより多い、
高プロテアーゼ生産能を有し且つ3.5U／ｇより
多い、高グルタミナーゼ生産能を有する麹菌を、
高頻度に育種し、取種することができる。 このようにして得られた麹菌株は、微工研にア
スペルギルス・ソーヤBen−１ FERM Ｐ−
7522及びアスペルギルス・ソーヤPFA−
118FERM Ｐ−7524として寄託されている。 尚、本発明でいう、プロテアーゼ生産能及びグ
ルタミナーゼ生産能を示す「Ｕ／ｇ」とは、それ
ぞれ後記第１表の「註」に記載された方法により
求めたものである。 本発明による麹菌は、従来の麹菌の大きな欠点
とされていた、プロテアーゼ生産能及びグルタミ
ナーゼ生産能のいずれか一方が高く、他方は逆に
低いという欠点を著しく改良し、双方とも同時に
著しく高い麹菌であつて、本発明によれば従来育
種が全く不可能に近いとされていた、650U／ｇ
より多い、高プロテアーゼ生産能を有し且つ
3.5U／ｇより多い、高グルタミナーゼ生産能を
有する麹菌を高頻度に育種し、取得することがで
きる。 また、融合２倍体株は比較的安定であるが、栄
養寒天斜面（スラント）上で、数代にわたつて継
代培養するに従い、融合に使用した、もとの親株
への復帰変異が高頻度（10^-4〜10^-3）で現われる
場合が多い。従つて次第にプロテアーゼ及びグル
タミナーゼの酵素生産能が不安定となる危険が生
ずる。これに対して、本発明により得られる麹菌
は、もとの親株への復帰変異は殆んどなく、その
割合は10^-7以下で、頗る安定である。 また、本発明で得られた麹菌を、醤油麹原料に
接種培養して麹をつくり、この麹を用いて仕込を
行い醤油を醸造すると、醤油原料は良く分解され
て窒素利用率が著しく向上するばかりか、グルタ
ミン酸が著しく、増加するので、旨味の非常に強
い醤油が得られる。 以下、実施例を示して、本発明を更に詳細に説
明する。 実施例 １ 分生胞子が白色で、パラアミノ安息香酸要求性
を有するアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus
sojae）W2−91（FERM Ｐ−7277）株を高プロテ
アーゼ生産株として使用し、この菌株の分生胞子
を米麹汁スラント培地に接種し、30℃の温度にお
いて66時間培養し、得られた培地から、常法によ
つて、分生胞子を採取した。得られた分生胞子を
0.01％ソルビタン脂肪酸エステル〔ソルゲンTW
−60、第一工業製薬(株)製〕溶液に分散して５×
10⁷個／mlの胞子ケン濁液を調製した。 ここに得られた胞子ケン濁液１mlを、150ml容
三角フラスコに入れたツアペツク変形培地〔ツア
ベツク（Czapek）培地に酵母エキス0.5％及びカ
ザミノ酸0.2％を加え、PHを6.0に調整したものを
水で10倍に希釈した培地〕30mlに接種し、30℃の
温度において12時間振とう培養して、発芽胞子の
長さがもとの胞子外径の10倍の発芽胞子（培養細
胞）を得た。 ここに得られた発芽胞子ケン濁液を、4500Gに
おいて20分間遠心分離して、発芽胞子を集め、こ
れを水で充分に洗滌し、水切りした後、細胞壁溶
解酵素液〔バチラス・サーキユランス起源の粗酵
素を30mg／１ml及びキチナーゼ（米国ICN社製）
を５mg／１mlの割合で溶解して得られたもの〕１
mlと混合し、この混合液を27℃の温度で２時間ゆ
るやかに振とうして、酵素処理を行なつて、アス
ペルギルス・ソーヤW2−91（FERM Ｐ−7277）
株のプロトプラストを得た。 ここに得られたプロトプラストをＧ−３規格の
ガラスフイルターで分離し、これを0.8Mソルビ
トール溶液で３回洗滌し、得られた洗滌プロトプ
ラストを0.8Mソルビトール溶液１mlに移し、ケ
ン濁してプロトプラストのケン濁液を得た。 これとは別に、分生胞子が黄色で、ニコチン酸
要求性を有するアスペルギルス・ソーヤ
（Aspergillus sojae）M12−２−61（FERM Ｐ−
7281）株を高グルタミナーゼ生産株として使用
し、この菌株の分生胞子を前記のアスペルギル
ス・ソーヤW2−９：株と同様に処理して、アス
ペルギルス・ソーヤM12−２−61（FERM Ｐ−
7281）株のプロトプラストがケン濁された0.8M
ソルビトール溶液を得た。 次にこのプロトプラストのケン濁された0.8M
ソルビトール溶液に、前記のアスペルギルス・ソ
ーヤW2−91（FERM Ｐ−7277）（高プロテアー
ゼ生産株）がケン濁された0.8Mソルビトール溶
液を加え、よく混合した後、混合ケン濁液を、20
℃の温度において、700Gで15分間遠心分離して、
アスペルギルス・ソーヤW2−91株（高プロテア
ーゼ生産株）とアスペルギルス・ソーヤM12−２
−61株（高グルタミナーゼ生産株）の混合プロト
プラストのペレツトを得た。 ここに得られた混合プロトプラストのペレツト
を0.8Mソルビトール、10ｍＭ CaCl及び50ｍＭ
グリシンを含む20％ポリエチレングリコール6000
（PH：7.5）溶液１mlと混合し、25℃の温度におい
て30分間、プロトプラスト融合反応を行なわせ
て、プロトプラスト融合細胞を得た。 ここに得られたプロトプラスト融合細胞に、
0.8Mソルビトール溶液を加えて、適当な濃度の
ケン濁液とし、これを予めシヤーレ内に流し固め
た高張最小再生寒天培地〔0.8Mソルビトールを
含むツアペツク寒天培地（寒天２％）〕に播種し、
その上に、寒天が0.5％である以外は全く同じ高
張最小再生寒天培地を流し込んで固化して重層
し、30℃の温度において５日間培養して、プロト
プラスト融合細胞の再生コロニーを得た。 ここに得られた再生株を米麹汁スラント培地に
接種し、30℃の温度において４日間培養して、緑
色、黄色、白色の胞子をもつヘテロカリオン株の
胞子を得た。ここに得られたヘテロカリオン株の
胞子に、39cmの距離から紫外線を１分間照射し、
得られた胞子を再び最小寒天平板培地に塗布し、
30℃の温度において４日間培養して、緑色の胞子
のみからなり、安定なコロニーを生成しうる菌株
を得た。この菌株の中から高いプロテアーゼ生産
能と高いグルタミナーゼ生産能の双方を有する融
合２倍体株のアスペルギルス・ソーヤＤ−78
（FERM Ｐ−7279）株を得た。 このようにして得られた融合２倍体株のアスペ
ルギルス・ソーヤＤ−78の分生胞子を、メチル−
１−ブチル−カルバモイル−２−ベンズイミダゾ
ール（ベノミル）2.5ppmを含有する麦芽汁寒天
平板培地に塗沫し、30℃の温度において７日間培
養して、直径１〜２cmの半数体株のコロニーを得
た。 次に、この半数体株のコロニーから釣菌し、得
られた菌株のプロテアーゼ生産能及びグルタミナ
ーゼ生産能を測定し、650U／ｇよりも高いプロ
テアーゼ生産能及び3.5U／ｇよりも高いグルタ
ミナーゼ生産能を有するアスペルギルス・ソーヤ
Ben−１（FERM Ｐ−7522）を選抜し、本発明の
目的とする菌株を育種した。 実施例 ２ 実施例１で得られた融合２倍体株のアスペルギ
ルス・ソーヤＤ−78（FERM Ｐ−7279）株の分
生胞子を、100μｇ／mlのパラーフルオロフエニ
ルアラニンを含有する麦芽汁寒天平板培地に点植
し、30℃の温度において、４日間培養して、周囲
とは異なつたセクター（円形のコロニー中の扇形
の部分）を有する巨大コロニーを得た。このセク
ターの中に半数体株が高頻度に存在することが確
認された。 次にこの半数体株から釣菌し、得られた菌株の
プロテアーゼ生産能及びグルタミナーゼ生産能を
測定し、650U／ｇよりも高いプロテアーゼ生産
能及び3.5U／ｇよりも高いグルタミナーゼ生産
能を有するアスペルギルス・ソーヤPFA−118
（FERM Ｐ−7524）を選抜し、本発明の目的と
する菌株を育種した。 次に実施例１及び実施例２において育種した本
発明の麹菌、ならびにその育成の過程で育種した
親株の酵素生産能を測定した。その結果を第１表
及び第１図に示す。

【表】 ようにして求められた。
脱脂大豆30ｇと炒熬割砕小麦30ｇを原料にし
て、直径15cmのシヤーレ内で、通常の醤油麹と同
じ方法で製麹し、得られた醤油麹に10倍量の水を
加えて、２時間抽出し、得られた抽出液のプロテ
アーゼ活性がアンソン−萩原法を用いて測定され
た。第１表のプロテアーゼ活性は、麹１ｇ当り１
分間に1μモルのチロシンを生成する活性を１単
位として表示した。 またグルタミナーゼ活性は、前記の抽出残渣を
ホモジナイズして得られた液とＬ−グルタミンを
30℃において１時間振とう反応させ、濾過した
後、濾液のグルタミン酸量を測定して求めた。第
１表のグルタミナーゼ活性は、麹１ｇ当り１分間
に1μモルのグルタミン酸量を生成する活性を１
単位として表示した。 第１図において、〇は、従来の麹菌株、▲は、
アスペルギルス・ソーヤW2−91、は、アスペル
ギルス・ソーヤM12−２−61、×は、アスペルギ
ルス・ソーヤＤ−78、○†い蓮▲▲好撻襯

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アスペルギルス・ソーヤに属する菌株であつ
   て、650U／ｇよりも高いプロテアーゼ生産能及
   び3.5U／ｇよりも高いグルタミナーゼ生産能を
   有することを特徴とする麹菌。 ２ アスペルギルス・ソーヤに属する菌株が、ア
   スペルギス・ソーヤBen−１であることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の麹菌。 ３ アスペルギルス・ソーヤに属する菌株が、ア
   スペルギルス・ソーヤPFA−118であることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項に記載の麹菌。 ４ アスペルギルス・ソーヤに属する菌株であつ
   て、高いプロテアーゼ生産能を有する菌株を培養
   し、得られた培養細胞からプロトプラストを得る
   こと、アスペルギルス・ソーヤに属する菌株であ
   つて、高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株を
   培養し、得られた培養細胞からプロトプラストを
   得ること、これらをプロトプラスト融合させて融
   合細胞を得ること、融合細胞を高張再生培地にお
   いて培養し、得られた培養物から高いプロテアー
   ゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有する
   融合２倍体株を選抜すること、およびここに選抜
   された高いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミ
   ナーゼ生産能を有する融合２倍体株を半数体化処
   理することを特徴とするアスペルギルス・ソーヤ
   に属する菌株であつて、650U／ｇよりも高いプ
   ロテアーゼ生産能及び3.5U／ｇよりも高いグル
   タミナーゼ生産能を有する麹菌の育種法。 ５ 半数体化処理が半数体化剤の使用によるもの
   であることを特徴とする特許請求の範囲第４項に
   記載の麹菌の育種法。 ６ 半数体化剤が、パラ−フルオロフエニルアラ
   ニン、メチル−１−ブチル−カルバモイル−２−
   ベンズイミダゾール、１，２−ビス（３−メトキ
   シカルボニル−２−チオウレイド）ベンゼン、２
   −（４−チアゾールイル）−ベンズイミダゾールお
   よび２−（２−フリル）ベンズイミダゾールから
   なる群より選択された少なくとも１種であること
   を特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の麹菌
   の育種法。 ７ 麹菌が、アスペルギルス・ソーヤBen−１で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第４項に記
   載の麹菌。 ８ 麹菌が、アスペルギルス・ソーヤPFA−118
   であることを特徴とする特許請求の範囲第４項に
   記載の麹菌。