JPS619291A - 海苔の細胞融合による細胞質融合体の選抜方法 - Google Patents
海苔の細胞融合による細胞質融合体の選抜方法Info
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- JPS619291A JPS619291A JP59130668A JP13066884A JPS619291A JP S619291 A JPS619291 A JP S619291A JP 59130668 A JP59130668 A JP 59130668A JP 13066884 A JP13066884 A JP 13066884A JP S619291 A JPS619291 A JP S619291A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/14—Plant cells
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業↓■科朋分１
本発明は、アマノリ属に属する２種の海苔葉体のプロト
プラストを細胞融合して得られる異種間細胞質融合体の
選抜方法に関する。
プラストを細胞融合して得られる異種間細胞質融合体の
選抜方法に関する。
従未■肢血迫宣旦
近年、遺伝子工学的手法として異種生物体の細胞間の融
合、いわゆる細胞融合についての研究が非常に盛んとな
り、陸上植物番こおいては既に実用化の段階にまで成功
したものもみられるに至っている。
合、いわゆる細胞融合についての研究が非常に盛んとな
り、陸上植物番こおいては既に実用化の段階にまで成功
したものもみられるに至っている。
しかしながら、海藻類、特にアマノリ類に関しての細胞
融合の研究報告は少なく、その成功例についても未だみ
られていない。
融合の研究報告は少なく、その成功例についても未だみ
られていない。
因に、コムギ、オオムギ、大豆などの陸上植物では市販
の酵素剤（例えばセルラーゼ、マセロチーム等）を用い
て容易にそれらのプロトプラストを調製し得るけれども
、アマノリ類をプロトプラスト化できる酵素が現在のと
ころ入手し得ないため、アマノリ類の細胞融合の技術が
陸上植物に比べて遅れている一因と考えられる。
の酵素剤（例えばセルラーゼ、マセロチーム等）を用い
て容易にそれらのプロトプラストを調製し得るけれども
、アマノリ類をプロトプラスト化できる酵素が現在のと
ころ入手し得ないため、アマノリ類の細胞融合の技術が
陸上植物に比べて遅れている一因と考えられる。
而して、アマノリ類をプロトプラスト化するための試み
としては今までのところ、藤田等による［酵素処理によ
るノリ、チオノリ類のプロドプラす ストの分離とその発生」についての報告（日本水産学会
、昭和５７年秋季講演要旨集、第２３頁、２１３）がみ
られるのみである。この藤田等による方法は、海苔葉体
を物理的手段で細断して得られる葉片にシュードモナス
属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＰの菌株（Ｐ−１株）
の培養液から得た粗酵素液を約４時間程度作用させてプ
ロトプラストを調製するものであるが、この方法ではプ
ロトプラストを得るための酵素処理に長時間を要し、し
かも海苔を物理的に切断したものに酵素を作用させるの
で得られるプロトプラストが不健全になる可能性が高く
、′シたがってこのプロトプラストを用いての細胞融合
に支障をきたすおそれがある。蓋し、細胞融合の手法に
おいてはそれに用いるプロトプラストの健全度が非常に
主要な要因であって、プロトプラストが不健全であると
細胞融合に当っての融合率が低くなって以後の培養によ
る成育も劣るようになると考えられるからである。
としては今までのところ、藤田等による［酵素処理によ
るノリ、チオノリ類のプロドプラす ストの分離とその発生」についての報告（日本水産学会
、昭和５７年秋季講演要旨集、第２３頁、２１３）がみ
られるのみである。この藤田等による方法は、海苔葉体
を物理的手段で細断して得られる葉片にシュードモナス
属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＰの菌株（Ｐ−１株）
の培養液から得た粗酵素液を約４時間程度作用させてプ
ロトプラストを調製するものであるが、この方法ではプ
ロトプラストを得るための酵素処理に長時間を要し、し
かも海苔を物理的に切断したものに酵素を作用させるの
で得られるプロトプラストが不健全になる可能性が高く
、′シたがってこのプロトプラストを用いての細胞融合
に支障をきたすおそれがある。蓋し、細胞融合の手法に
おいてはそれに用いるプロトプラストの健全度が非常に
主要な要因であって、プロトプラストが不健全であると
細胞融合に当っての融合率が低くなって以後の培養によ
る成育も劣るようになると考えられるからである。
また、上記方法で海苔葉体を切断するには、シュードモ
ナスｓｐ菌株が生産する酵素が海苔の表層部分には作用
せずに切断部分から作用して海苔の細胞壁を崩壊してプ
ロトプラストとなるとの認識に基づいているものと考え
られる。
ナスｓｐ菌株が生産する酵素が海苔の表層部分には作用
せずに切断部分から作用して海苔の細胞壁を崩壊してプ
ロトプラストとなるとの認識に基づいているものと考え
られる。
Ｐｒｅｓｔｏｎ等の報告によると、海苔は表層にマンナ
ンが顆粒状に存在しており、海苔の細胞壁はミクロフィ
ブリル形態のキシランから構成されており、細胞充間物
質としてポルフィランが存在しているとされる。また、
Ｌ、Ａ、Ｈａｎｉｃ等によると、海苔の表層には蛋白質
から成る薄い被覆が存在しているとされる。すなわち、
このような海苔の組織上の観点から、海苔は切断しなけ
ればプロトプラスト化できないと考えられていたものと
思われる。
ンが顆粒状に存在しており、海苔の細胞壁はミクロフィ
ブリル形態のキシランから構成されており、細胞充間物
質としてポルフィランが存在しているとされる。また、
Ｌ、Ａ、Ｈａｎｉｃ等によると、海苔の表層には蛋白質
から成る薄い被覆が存在しているとされる。すなわち、
このような海苔の組織上の観点から、海苔は切断しなけ
ればプロトプラスト化できないと考えられていたものと
思われる。
本発明者は、さきに細胞融合に適した海苔の健全なプロ
トプラストを得る゛には、海苔を物理的に切断すること
なくその表層から崩壊させることが必要であるとの見地
から海苔のプロトプラスト化について検討した結果、海
苔を少なくともマンナン加水分解酵素およびキシラン加
水分解酵素を含有する酵素液で処理するか、更にはボル
フイラン加水分解酵素も含有する酵素液で処理すること
により、海苔のプロトプラストを健全な状態で調製し得
ることの知見を得て、海苔のプロトプラスト化の技術を
開発した（特願昭５８−１４９３７８号）。
トプラストを得る゛には、海苔を物理的に切断すること
なくその表層から崩壊させることが必要であるとの見地
から海苔のプロトプラスト化について検討した結果、海
苔を少なくともマンナン加水分解酵素およびキシラン加
水分解酵素を含有する酵素液で処理するか、更にはボル
フイラン加水分解酵素も含有する酵素液で処理すること
により、海苔のプロトプラストを健全な状態で調製し得
ることの知見を得て、海苔のプロトプラスト化の技術を
開発した（特願昭５８−１４９３７８号）。
その後、本発明者は上述した海苔葉体のプロトプラスト
化の成功に伴なってアマノリ属に属する２種の海苔葉体
のプロトプラストを調製し、これらのプロトプラストを
細胞融合の手法を通用して細胞融合することにより異種
間細胞質融合体くバイブリド細胞）を作成し、下記に述
べるような海苔本来の形質に鑑み、その形質を改良する
ことを試みた。
化の成功に伴なってアマノリ属に属する２種の海苔葉体
のプロトプラストを調製し、これらのプロトプラストを
細胞融合の手法を通用して細胞融合することにより異種
間細胞質融合体くバイブリド細胞）を作成し、下記に述
べるような海苔本来の形質に鑑み、その形質を改良する
ことを試みた。
現在、養殖に用いられているアマノリ属に属する海苔の
品種は多種類に亙るが、それらのうちで主として海苔製
品の製造に用いられているのはアサクサノリとスサビノ
リである。而して、アサクサノリは葉体が柔かく香気も
豊かで美味であるが、貧栄養の漁場ではいわゆる色落ち
が激しくなって品質が低下するという欠点があり、一方
スサビノリは繁殖力が強く、色彩および光沢などの外観
も優れているが、その反面食味上の香気が乏しく、かつ
海水中の栄養分濃度の減少に伴ない組織が粗削になる欠
点がある。また、アマノリ属に属する海苔の野生株であ
るマルバアマノリはその形態がマル葉型であり、かつ生
長率も劣ることから養殖には適さないとされているが、
貧栄養漁場でも比較的色落ちが少ないという特性を有す
る。
品種は多種類に亙るが、それらのうちで主として海苔製
品の製造に用いられているのはアサクサノリとスサビノ
リである。而して、アサクサノリは葉体が柔かく香気も
豊かで美味であるが、貧栄養の漁場ではいわゆる色落ち
が激しくなって品質が低下するという欠点があり、一方
スサビノリは繁殖力が強く、色彩および光沢などの外観
も優れているが、その反面食味上の香気が乏しく、かつ
海水中の栄養分濃度の減少に伴ない組織が粗削になる欠
点がある。また、アマノリ属に属する海苔の野生株であ
るマルバアマノリはその形態がマル葉型であり、かつ生
長率も劣ることから養殖には適さないとされているが、
貧栄養漁場でも比較的色落ちが少ないという特性を有す
る。
したがって、アマノリ属に属する代表的な海苔の品種で
あるアサクサノリおよびスサビノリが本来有する形質の
うち、上述したような欠点とされる形質を細胞融合の手
法を適用して異種間細胞質融合体を作成することにより
優良な形質に転換することが望まれる。
あるアサクサノリおよびスサビノリが本来有する形質の
うち、上述したような欠点とされる形質を細胞融合の手
法を適用して異種間細胞質融合体を作成することにより
優良な形質に転換することが望まれる。
ところで、上述のように、２種の海苔葉体のプロトプラ
ストを細胞融合して異種間細胞質融合体を作成する場合
、得られた上記融合体を分離するための選抜が実際上困
難であることがわかった。
ストを細胞融合して異種間細胞質融合体を作成する場合
、得られた上記融合体を分離するための選抜が実際上困
難であることがわかった。
すなわち、上記異種間細胞質融合体の作成に際しては異
種間の融合体（ヘテロ融合細胞）のほかに同種間の融合
体（ホモ融合細胞）および未融合細胞が生成して混在す
るため、これらの中からヘテロ融合細胞のみを分離する
ことが必要である。
種間の融合体（ヘテロ融合細胞）のほかに同種間の融合
体（ホモ融合細胞）および未融合細胞が生成して混在す
るため、これらの中からヘテロ融合細胞のみを分離する
ことが必要である。
従来、細胞融合の手法においてへテロ融合細胞を選抜す
る方法としては、一般に遺伝的マーカー（アルピノ、抗
生物質耐性、栄養要求性）や特定な培地成分による成育
阻害などを利用して行なわれているが、これらの方法を
海苔のへテロ融合細胞の選抜に適用することは現状では
実際上不可能である。
る方法としては、一般に遺伝的マーカー（アルピノ、抗
生物質耐性、栄養要求性）や特定な培地成分による成育
阻害などを利用して行なわれているが、これらの方法を
海苔のへテロ融合細胞の選抜に適用することは現状では
実際上不可能である。
ろ■が ンしよ゛と る。 占
本発明者は、２種の海苔葉体のプロトプラストを細胞融
合して得られる異種間細胞質融合体の選抜方法について
検討した結果、互に色調の異なる海苔葉体のプロトプラ
ストを用いて細胞融合を行ない、得られた細胞群のう・
ちから両者の色調がまじっている細胞を分離することに
より、異種間細胞質融合体を有利に選抜し得ることの知
見を得て、本発明をなすに至った。
合して得られる異種間細胞質融合体の選抜方法について
検討した結果、互に色調の異なる海苔葉体のプロトプラ
ストを用いて細胞融合を行ない、得られた細胞群のう・
ちから両者の色調がまじっている細胞を分離することに
より、異種間細胞質融合体を有利に選抜し得ることの知
見を得て、本発明をなすに至った。
すなわち、本発明の目的は、アマノリ属に属する２種の
海苔葉体のプロトプラストを細胞融合して得られる異種
間細胞質融合体の有利な選抜方法を提供することにある
。
海苔葉体のプロトプラストを細胞融合して得られる異種
間細胞質融合体の有利な選抜方法を提供することにある
。
以下本発明の詳細な説明する。
皇所豊盪底
本発明の特徴は、アマノリ属に属する２種の海苔葉体の
プロトプラストを調製し、それらのプロトプラストを細
胞融合して異種間細胞質融合体を作成するに際し、互に
色調の異なる海苔葉体のプロトプラストを細胞融合し、
得られた融合細胞のうちから上記両者の色調がまじった
融合細胞を選択的に採取することにある。
プロトプラストを調製し、それらのプロトプラストを細
胞融合して異種間細胞質融合体を作成するに際し、互に
色調の異なる海苔葉体のプロトプラストを細胞融合し、
得られた融合細胞のうちから上記両者の色調がまじった
融合細胞を選択的に採取することにある。
海苔の色調は、市販製品では板状に抄製して乾燥したも
のであるため黒色を呈し、又、それを焼成した焼海苔は
緑色を呈する。しかし、元来海で養殖された海苔葉体は
茶色を呈するものであって、それから調製されたプロト
プラストも茶色を呈するものである。
のであるため黒色を呈し、又、それを焼成した焼海苔は
緑色を呈する。しかし、元来海で養殖された海苔葉体は
茶色を呈するものであって、それから調製されたプロト
プラストも茶色を呈するものである。
したがって、細胞融合に用いる２種の海苔葉体のプロト
プラストの一方のプロトプラストとして茶色と肉眼的に
識別可能な色調のものを採用することにより、それらの
細胞融合により得られるもののうちから両者の色調が混
ったものを選択的に分離すれば、所望の異種間細胞質融
合体を選抜し得ることになる。
プラストの一方のプロトプラストとして茶色と肉眼的に
識別可能な色調のものを採用することにより、それらの
細胞融合により得られるもののうちから両者の色調が混
ったものを選択的に分離すれば、所望の異種間細胞質融
合体を選抜し得ることになる。
本発明では上述したような茶色と識別可能な色調を示す
海苔のプロトプラストとして、元来、茶色を呈する海苔
葉体のプロトプラストを予め染色剤で染色したものを用
いるか、もしくは突然変異種にみられる色素合成欠損株
の海苔葉体から調製したプロトプラストを用いる。因に
、このような突然変異種である色素合成欠損株としては
、アマノリ属のスサビノリの突然変異種であるスサビグ
リーンと称せられるフィコエリスリン色素（赤色）欠損
株（この赤色色素を欠くため葉体は緑色を呈する）が知
られており、また、緑色色素欠損株（葉体は赤色を呈す
る）も存在すると言われている。
海苔のプロトプラストとして、元来、茶色を呈する海苔
葉体のプロトプラストを予め染色剤で染色したものを用
いるか、もしくは突然変異種にみられる色素合成欠損株
の海苔葉体から調製したプロトプラストを用いる。因に
、このような突然変異種である色素合成欠損株としては
、アマノリ属のスサビノリの突然変異種であるスサビグ
リーンと称せられるフィコエリスリン色素（赤色）欠損
株（この赤色色素を欠くため葉体は緑色を呈する）が知
られており、また、緑色色素欠損株（葉体は赤色を呈す
る）も存在すると言われている。
。 占 ２するための およびその を上述したよ
うな観点から、アマノリ属に属する海苔の代表的なもの
としてアサクサノリの葉体（色調か茶色）のプロトプラ
ストを調製し、このプロトプラストと、スサビノリの突
然変異種であるスサビグリーンの葉体（色調が緑色）の
プロトプラストを細胞融合する場合、並びに上記アサク
サノリの葉体のプロトプラストを予め染色剤で染色ゴ
したものと、野生株であるマルバアマ
ノリの葉体（色調が茶色）のプロトプラストを細胞融合
する場合を例として、細胞融合により得られる異種間細
胞質融合体の選抜について以下説明する。
うな観点から、アマノリ属に属する海苔の代表的なもの
としてアサクサノリの葉体（色調か茶色）のプロトプラ
ストを調製し、このプロトプラストと、スサビノリの突
然変異種であるスサビグリーンの葉体（色調が緑色）の
プロトプラストを細胞融合する場合、並びに上記アサク
サノリの葉体のプロトプラストを予め染色剤で染色ゴ
したものと、野生株であるマルバアマ
ノリの葉体（色調が茶色）のプロトプラストを細胞融合
する場合を例として、細胞融合により得られる異種間細
胞質融合体の選抜について以下説明する。
本発明では、まず、上記各海苔葉体のプロトプラストを
調製するが、その調製には前述したように、本発明者が
さきに開発した方法（特願昭５８−１４９３７８号）を
適用して行なう。このプロトプラストの調製法の概要を
説明すると１、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）に属する難消化性多糖類（マンナン、キシランお
よびポルフィラン）の加水分解能を有する微生物（シュ
ードモナス５ＰＮｏ、ＰＴ−５゜微工研条寄１）ｈＢＰ
−３３０）を、海苔もしくは海苔由来の多糖類（海苔を
熱水抽出して可溶性成分を除去して得られる、主として
マンナンもしくはキシランのような多糖類から成る残渣
又は該残渣を更に精製処理して多糖類含量を高めたもの
）を誘導物質として含む培地中で培養して得られる培養
液を遠心分離し、その上澄液を酵素液として用いて海苔
葉体を処理することから成る。このようにして得られる
酵素液にはマンナン加水分解酵素とキシラン加水分解酵
素が含まれているので、該酵素液を海苔葉体に作用させ
るとマンナン加水分解酵素が海苔葉体の表層に存在する
顆粒状のマンナンに作用して葉体に大きく切断部を形成
し、それによりキシラン加水分解酵素により細胞壁を形
成しているミクロフィブリル形態のキシランが作用され
易くなって、葉体の細胞壁が分解除去されてプロトプラ
スト化されるようになる。また、上記酵素液にばポルフ
ィラン分解酵素も含まれているので１、海苔葉体の細胞
光間物質としてのポルフィランにも作用して分解するの
でプロトプラスト化が−そう促進される。
調製するが、その調製には前述したように、本発明者が
さきに開発した方法（特願昭５８−１４９３７８号）を
適用して行なう。このプロトプラストの調製法の概要を
説明すると１、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）に属する難消化性多糖類（マンナン、キシランお
よびポルフィラン）の加水分解能を有する微生物（シュ
ードモナス５ＰＮｏ、ＰＴ−５゜微工研条寄１）ｈＢＰ
−３３０）を、海苔もしくは海苔由来の多糖類（海苔を
熱水抽出して可溶性成分を除去して得られる、主として
マンナンもしくはキシランのような多糖類から成る残渣
又は該残渣を更に精製処理して多糖類含量を高めたもの
）を誘導物質として含む培地中で培養して得られる培養
液を遠心分離し、その上澄液を酵素液として用いて海苔
葉体を処理することから成る。このようにして得られる
酵素液にはマンナン加水分解酵素とキシラン加水分解酵
素が含まれているので、該酵素液を海苔葉体に作用させ
るとマンナン加水分解酵素が海苔葉体の表層に存在する
顆粒状のマンナンに作用して葉体に大きく切断部を形成
し、それによりキシラン加水分解酵素により細胞壁を形
成しているミクロフィブリル形態のキシランが作用され
易くなって、葉体の細胞壁が分解除去されてプロトプラ
スト化されるようになる。また、上記酵素液にばポルフ
ィラン分解酵素も含まれているので１、海苔葉体の細胞
光間物質としてのポルフィランにも作用して分解するの
でプロトプラスト化が−そう促進される。
なお、上記プロトプラスト化に際して、海苔葉体を予め
パパインのようなプロテアーゼで処理するか、又は上記
酵素液と並行的にプロテアーゼを作用させると、更に効
果的である。
パパインのようなプロテアーゼで処理するか、又は上記
酵素液と並行的にプロテアーゼを作用させると、更に効
果的である。
次に、上述のようにして調製したプロトプラストの細胞
融合は公知の手法を適用して行なう。
融合は公知の手法を適用して行なう。
すなわち、細胞融合すべき２種のプロトプラストを混合
して形成させた沈澱にポリエチレングリコール溶液と旧
ｇｈ−ｐＨ−Ｃａ溶液を加えて放置した後、これに培養
液（人工海水＾ｓｐ、１２）を加えて培養を行なって細
胞質融合体を作成する。なお、培養は１５℃の温度で６
，０ＯＯＬｕｘの照度で明期９時間、晴朗１５時間の条
件下で行なう。
して形成させた沈澱にポリエチレングリコール溶液と旧
ｇｈ−ｐＨ−Ｃａ溶液を加えて放置した後、これに培養
液（人工海水＾ｓｐ、１２）を加えて培養を行なって細
胞質融合体を作成する。なお、培養は１５℃の温度で６
，０ＯＯＬｕｘの照度で明期９時間、晴朗１５時間の条
件下で行なう。
本発明においては、上記細胞融合に当って互に色調の異
なる２種のプロトプラストを細胞融合させるものであっ
て、そのためには例えば、アサクサノリの葉体を上述の
ように処理してプロトプラスト 製し、一方前記突然変異種のスサビグリーンの葉体を同
様に処理して緑色の色調を示すプロトプラストを調製し
、これらのプロトプラストを上述のようにして細胞融合
する。
なる２種のプロトプラストを細胞融合させるものであっ
て、そのためには例えば、アサクサノリの葉体を上述の
ように処理してプロトプラスト 製し、一方前記突然変異種のスサビグリーンの葉体を同
様に処理して緑色の色調を示すプロトプラストを調製し
、これらのプロトプラストを上述のようにして細胞融合
する。
また、例えば、上述のようにして調製したアサクサノリ
の葉体のプロトプラスト（茶色）をニュ−トラルレツド
溶液にュートラルレッドＩＯＢと人工海水Ａｓｐ、１２
１００ ｍβの混液にマンニトールがＯ，，７５Ｍにな
るように添加して調製した溶液）で染色して赤色の色調
にしたものと、マルバアマノリの葉体を上述のように処
理して調製した茶色の色調を示すプロトプラストを上述
のようにして細胞融合する。
の葉体のプロトプラスト（茶色）をニュ−トラルレツド
溶液にュートラルレッドＩＯＢと人工海水Ａｓｐ、１２
１００ ｍβの混液にマンニトールがＯ，，７５Ｍにな
るように添加して調製した溶液）で染色して赤色の色調
にしたものと、マルバアマノリの葉体を上述のように処
理して調製した茶色の色調を示すプロトプラストを上述
のようにして細胞融合する。
これらの細胞融合により、前者の場合では茶色と緑色の
各色調が相混った細胞と茶色並びに緑色のままの細胞と
が混在したもの、また、後者の場合では赤色と茶色の各
色調が相混った細胞と赤色並びに茶色のままの細胞とが
混在したものがそれぞれ得られるので、それらの細胞群
から顕微鏡下で茶色と緑色のまじった細胞および相混り
つつある細胞、並びに赤色と茶色のまじった細胞および
η 相混りつつある細胞をパスツールピペットなどでそれぞ
れ吸い取って分離することにより、各異種間細胞質融合
体を選抜することができる。 ′このようにして選抜
した異種間細胞質融合体を人工海水＾ｓｐ、１２中で１
５°Ｃの温度で６０００Ｌｕｘの照度下に′明期９時間
（晴朗１５時間）で培養して育成し、上記融合体の成葉
を得る。
各色調が相混った細胞と茶色並びに緑色のままの細胞と
が混在したもの、また、後者の場合では赤色と茶色の各
色調が相混った細胞と赤色並びに茶色のままの細胞とが
混在したものがそれぞれ得られるので、それらの細胞群
から顕微鏡下で茶色と緑色のまじった細胞および相混り
つつある細胞、並びに赤色と茶色のまじった細胞および
η 相混りつつある細胞をパスツールピペットなどでそれぞ
れ吸い取って分離することにより、各異種間細胞質融合
体を選抜することができる。 ′このようにして選抜
した異種間細胞質融合体を人工海水＾ｓｐ、１２中で１
５°Ｃの温度で６０００Ｌｕｘの照度下に′明期９時間
（晴朗１５時間）で培養して育成し、上記融合体の成葉
を得る。
斜上のように、本発明によると、アマノリ属に属する２
種の海苔葉体のプロトプラストを細胞融合して得られる
異種間細胞質融合体を容易に識別して選抜し得るので、
この融合体についての形質転換の状態を判定することに
より、アマノリ属の海苔本来の形質の改良に細胞融合の
手法を有効に応用し得るようになる。
種の海苔葉体のプロトプラストを細胞融合して得られる
異種間細胞質融合体を容易に識別して選抜し得るので、
この融合体についての形質転換の状態を判定することに
より、アマノリ属の海苔本来の形質の改良に細胞融合の
手法を有効に応用し得るようになる。
以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。
実差」ロー
海苔葉体のプロトプラストの調製；
約１ｃｍ程度の大きさのアサクサノリの葉体５枚を０．
２％パパイン液（ｐＨ７，４のトリス塩酸バッファー１
０ｎ＋ Ｉｔにパパイン２０＋＋＋ｇを熔解した溶液）
に浸漬し、２０℃の温度で５分間振とう（７０ストロ一
ク／分）シた。ついで、上記によりパパインで処理した
葉体を、予めシュードモナス５ＰＮｌｌＰＴ−５（微工
研条寄ＮａＢＰ−３３０）をスサビノリ粉末を基質とす
る培地中で培養して得られた酵素液（０，７５Ｍマニマ
ントール）に浸漬し、２０℃で６０分間振とう（７０ス
トロ一ク／分）させてプロトプラスト化を行なった。
２％パパイン液（ｐＨ７，４のトリス塩酸バッファー１
０ｎ＋ Ｉｔにパパイン２０＋＋＋ｇを熔解した溶液）
に浸漬し、２０℃の温度で５分間振とう（７０ストロ一
ク／分）シた。ついで、上記によりパパインで処理した
葉体を、予めシュードモナス５ＰＮｌｌＰＴ−５（微工
研条寄ＮａＢＰ−３３０）をスサビノリ粉末を基質とす
る培地中で培養して得られた酵素液（０，７５Ｍマニマ
ントール）に浸漬し、２０℃で６０分間振とう（７０ス
トロ一ク／分）させてプロトプラスト化を行なった。
得られた酵素処理混合物を４０μメツシユのナイロン製
網で濾過し、濾液を遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分間
）して残渣に茶色の色調を示すアサクサノリのプロトプ
ラスト（１０７個）を得た。
網で濾過し、濾液を遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分間
）して残渣に茶色の色調を示すアサクサノリのプロトプ
ラスト（１０７個）を得た。
また、上記と同様の手順により緑色の色調を示すスサビ
グリーンのプロトプラストを得た。
グリーンのプロトプラストを得た。
細胞融合：
上述のようにして調製したアサクサノリとスサビグリー
ンの２種のプロトプラストを混合し、このプロトプラス
トの混合液の０．１ｍＡ （１０６個）をパスツールピ
ペットでペトリ皿内に滴下し、５〜１０分間放置してプ
ロトプラスト混合物をペトリ皿のガラス表面に沈澱させ
た。この沈澱に下記組成のポリエチレングリコール溶液
の０．２ｍｊ！を加えて１０分間放置した後、さらに下
記組成の旧ｇｈ ｐＨ−Ｃａ溶液の０．５ｍｆｆ１を加
えて５分間放置した。
ンの２種のプロトプラストを混合し、このプロトプラス
トの混合液の０．１ｍＡ （１０６個）をパスツールピ
ペットでペトリ皿内に滴下し、５〜１０分間放置してプ
ロトプラスト混合物をペトリ皿のガラス表面に沈澱させ
た。この沈澱に下記組成のポリエチレングリコール溶液
の０．２ｍｊ！を加えて１０分間放置した後、さらに下
記組成の旧ｇｈ ｐＨ−Ｃａ溶液の０．５ｍｆｆ１を加
えて５分間放置した。
ポリエチレングリコールの組成：
ポリエチレングリコール（ＭＷ ６．’０００）の５４
％水溶液にＣａＣｌ２２Ｈ２０１０，５ｍＭ 、ＫｔＰ
Ｏ＋＋２１）２００．７ｍＭおよびグルコース０．１Ｍ
を添加する。
％水溶液にＣａＣｌ２２Ｈ２０１０，５ｍＭ 、ＫｔＰ
Ｏ＋＋２１）２００．７ｍＭおよびグルコース０．１Ｍ
を添加する。
Ｈｉｇｈ ｐＨ−Ｃａ溶液の組成：
■ ＣａＣｌ２２Ｈ２０を１００ｍＭおよびグルコース
を０．４Ｍの各濃度に菓留水に溶解する。
を０．４Ｍの各濃度に菓留水に溶解する。
■ １００ｍＭ ＮａＯＨ−グリシンバッファー（ｐＨ
１０，５）に・グルコースを０．４Ｍの濃度に溶解する
。
１０，５）に・グルコースを０．４Ｍの濃度に溶解する
。
上記■と■の溶液を使用前に１：１の割合に混合する。
次に、上述のようにして放置したものに、下記に示す人
工海水Ａｓｐ、 １２からなる培養液０，３ｎｌを加え
、５分後その０．３ｍＩ！、をペトリ皿から吸い上げ、
さらにそれに上記培養液を加え、５分後その０．３ｍｌ
を吸い上げる操作を５回繰返して行なった後、新たに上
記培養液を加えて培養を行なった。培養は１５℃の温度
で６，０００Ｌｕｘ照度下で明朗９時間（晴朗１５時間
）で行なった。
工海水Ａｓｐ、 １２からなる培養液０，３ｎｌを加え
、５分後その０．３ｍＩ！、をペトリ皿から吸い上げ、
さらにそれに上記培養液を加え、５分後その０．３ｍｌ
を吸い上げる操作を５回繰返して行なった後、新たに上
記培養液を加えて培養を行なった。培養は１５℃の温度
で６，０００Ｌｕｘ照度下で明朗９時間（晴朗１５時間
）で行なった。
人工海水（ＡＳＰ １２）の組成＝
ＮａＣ１２８ｇ
ＭｇＳＯ吟７１）２０ ７ ｇＭｇＣ
１２６Ｈ２０４ｇ ＫＣ１４００ｍｇ ＣａＣ１２２Ｈ２０１，４６ｇ ＮａＮＯａ
１００ ｍｇＫ、ＨＰ版 １０
ｍｇグリセロ燐酸ナトリウム １０ ｍｇビタミン
Ｂ１２ ０．０２ μｇビオチン
０．１ μｇチアミン
１０ μｇＰ ＩＩ Ｍｅｔａｌ
１０ ｍ、ｇＳ ＩＩ Ｍｅｔａｌ
１０ ｍ１２トリスアミノメタン
１ｇ 蒸留水 １０００＋＋／＋ＰＨ８，０
〜８．１ １工」１旦■鳳成 盈↓」１）皇紙戊ＥＤＴＡ
１ ａｇ ＮａＢ
ｒ １．２ ｍｇＨｈＢＯｑ
１ ｍｇ ＡＩＣ
ＩＢ−６１）２０１，２ｍｇＭｎＣ１２４Ｈｚ０ ０．
１４ ｔａｇ ５ｒＣＩ２６１）２０ ０．６ ｍ
ｇ１’ｅｃＩ２６Ｈ２００，０５ｍｇ ＮａＭｏ０
＋ ・２Ｈ２００，１２ｍｇＺｎＣｌ２ ０．０１
ｍｇ ＰｂＣｌ ０．０３ｍｇＧｏＣＩ
２・６Ｈ２０４ｇｇ Ｋｌ １．５ｇ
ｇＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，５ｇｇ 蒸留水 １
ａｎｊ！蒸留水 １ ｖａｌｌ 細胞質融合体の選抜： 上述のようにして培養して得られた細胞群のうちから、
顕微鏡下に茶色と緑色の色調がまじった細胞および相部
りつつある細胞を識別してパスツールピペットで吸い取
り選抜した。
１２６Ｈ２０４ｇ ＫＣ１４００ｍｇ ＣａＣ１２２Ｈ２０１，４６ｇ ＮａＮＯａ
１００ ｍｇＫ、ＨＰ版 １０
ｍｇグリセロ燐酸ナトリウム １０ ｍｇビタミン
Ｂ１２ ０．０２ μｇビオチン
０．１ μｇチアミン
１０ μｇＰ ＩＩ Ｍｅｔａｌ
１０ ｍ、ｇＳ ＩＩ Ｍｅｔａｌ
１０ ｍ１２トリスアミノメタン
１ｇ 蒸留水 １０００＋＋／＋ＰＨ８，０
〜８．１ １工」１旦■鳳成 盈↓」１）皇紙戊ＥＤＴＡ
１ ａｇ ＮａＢ
ｒ １．２ ｍｇＨｈＢＯｑ
１ ｍｇ ＡＩＣ
ＩＢ−６１）２０１，２ｍｇＭｎＣ１２４Ｈｚ０ ０．
１４ ｔａｇ ５ｒＣＩ２６１）２０ ０．６ ｍ
ｇ１’ｅｃＩ２６Ｈ２００，０５ｍｇ ＮａＭｏ０
＋ ・２Ｈ２００，１２ｍｇＺｎＣｌ２ ０．０１
ｍｇ ＰｂＣｌ ０．０３ｍｇＧｏＣＩ
２・６Ｈ２０４ｇｇ Ｋｌ １．５ｇ
ｇＣｕＳＯ４・５Ｈ２００，５ｇｇ 蒸留水 １
ａｎｊ！蒸留水 １ ｖａｌｌ 細胞質融合体の選抜： 上述のようにして培養して得られた細胞群のうちから、
顕微鏡下に茶色と緑色の色調がまじった細胞および相部
りつつある細胞を識別してパスツールピペットで吸い取
り選抜した。
このようにして選抜した細胞質融合体を上記人工海水Ａ
ｓｐ、１２中において１５℃の温度で６０００Ｌｕｘの
照度下に明朗９時間（晴朗１５時間）で培養して育成し
、該融合体の成葉を得た。
ｓｐ、１２中において１５℃の温度で６０００Ｌｕｘの
照度下に明朗９時間（晴朗１５時間）で培養して育成し
、該融合体の成葉を得た。
実蓋貫１
実施例１に記載したと同様の手順でアサクサノリのプロ
トプラスト（茶色の色調）とマルバアマノリのプロトプ
ラスト（茶色の色調）をそれぞれ調製した。
トプラスト（茶色の色調）とマルバアマノリのプロトプ
ラスト（茶色の色調）をそれぞれ調製した。
上記アサクサノリのプロトプラストをニュートラルレッ
ド溶液にュートラルレッド１０ｍｇと人工海水＾ｓｐ、
１２１００ ｍｉｌの混液にマンニトールが０．７５Ｍ
になるように添加して調製した溶液）で常法により染色
して赤色の色調を示すプロトプラストを作成した。
ド溶液にュートラルレッド１０ｍｇと人工海水＾ｓｐ、
１２１００ ｍｉｌの混液にマンニトールが０．７５Ｍ
になるように添加して調製した溶液）で常法により染色
して赤色の色調を示すプロトプラストを作成した。
次に、この赤色のアサクサノリのプロトプラストと上記
茶色のマルバアマノリのプロトプラストを実施例１に記
載したと同様の手順で細胞融合し、ついで培養を行なっ
た。
茶色のマルバアマノリのプロトプラストを実施例１に記
載したと同様の手順で細胞融合し、ついで培養を行なっ
た。
細胞質融合体の選抜：
上記により培養して得られた細胞群のうちから、顕微鏡
下に赤色と茶色の色調がまじりつつある細胞を識別して
パスツールピペットで吸い取り選抜した。
下に赤色と茶色の色調がまじりつつある細胞を識別して
パスツールピペットで吸い取り選抜した。
このようにして選抜した細胞質融合体を実施例１に記載
したと同様の手順で培養して育成し、その成葉を得た。
したと同様の手順で培養して育成し、その成葉を得た。
Claims (5)
- （１）アマノリ属に属する２種の海苔葉体のプロトプラ
ストを調製し、それらのプロトプラストを細胞融合して
異種間細胞質融合体を作成するに際し、互に色調の異な
る海苔葉体のプロトプラストを細胞融合し、得られた融
合細胞のうちから上記両者の色調がまじった融合細胞を
選択的に採取することを特徴とする海苔の細胞質融合体
の選抜方法。 - （２）色調の異なる海苔葉体のプロトプラストが、茶色
の色調を呈する海苔葉体のプロトプラストとそれと色調
の異なる染色剤で染色した異種の海苔葉体のプロトプラ
ストもしくは該染色剤で染色したプロトプラストである
特許請求の範囲第（１）項記載の選抜方法。 - （３）染色剤がニュートラルレッドである特許請求の範
囲第（２）項記載の選抜方法。 - （４）色調の異なる海苔葉体のプロトプラストが、茶色
の色調を呈する海苔葉体のプロトプラストとそれと色調
の異なる突然変異種の海苔葉体のプロトプラストである
特許請求の範囲第（１）項記載の選抜方法。 - （５）突然変異種の海苔葉体がスサビグリーンの葉体で
ある特許請求の範囲第（４）項記載の選抜方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59130668A JPH0229314B2 (ja) | 1984-06-25 | 1984-06-25 | Norinosaibojugonyorusaiboshitsujugatsutainosenbatsuhoho |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59130668A JPH0229314B2 (ja) | 1984-06-25 | 1984-06-25 | Norinosaibojugonyorusaiboshitsujugatsutainosenbatsuhoho |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS619291A true JPS619291A (ja) | 1986-01-16 |
| JPH0229314B2 JPH0229314B2 (ja) | 1990-06-28 |
Family
ID=15039755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59130668A Expired - Lifetime JPH0229314B2 (ja) | 1984-06-25 | 1984-06-25 | Norinosaibojugonyorusaiboshitsujugatsutainosenbatsuhoho |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0229314B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61212279A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | あかぐされ病耐性の強い新しい品種の養殖海苔の作成方法 |
| JPS61212281A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | 温度耐性の強い新しい品種の養殖海苔の作成方法 |
| JPS61212280A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | 貧栄養耐性の強い品種の養殖海苔の作成方法 |
-
1984
- 1984-06-25 JP JP59130668A patent/JPH0229314B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61212279A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | あかぐされ病耐性の強い新しい品種の養殖海苔の作成方法 |
| JPS61212281A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | 温度耐性の強い新しい品種の養殖海苔の作成方法 |
| JPS61212280A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-20 | Shiraha Akira | 貧栄養耐性の強い品種の養殖海苔の作成方法 |
| JPH031953B2 (ja) * | 1985-03-18 | 1991-01-11 | Shiraha Akira | |
| JPH031955B2 (ja) * | 1985-03-18 | 1991-01-11 | Shiraha Akira | |
| JPH031954B2 (ja) * | 1985-03-18 | 1991-01-11 | Shiraha Akira |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0229314B2 (ja) | 1990-06-28 |
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