JPH031955B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は、細胞融合の手法を利用して、海苔の
養殖漁期を延長し得る。温度耐性の強い新しい品
種の養殖海苔を作成する方法に関する。 従来の技術的背景 日本の沿岸における海苔の養殖は、11月から３
月頃までの冬場に行なわれているが、これは、海
苔が一般の海藻同様この時期に良く繁茂し、それ
以後は衰退、消滅するに至るという海苔本来の生
育上の特性に基づくものであつて、この特性は漁
場である海水の温度に大きく依存していることに
因る。 因に、今井丈夫監修「浅海完全養殖」（改定版、
昭和51年４月30日）によると、一般に海苔の生育
水温は２〜22℃であり、成長に好適な水温は発育
段階で異なり、幼芽で18〜20℃、葉体で16〜６℃
であつて、収量面からは８〜10℃が好適とされ
る。すなわち、上記生育水温から理解されるよう
に、海苔養殖の期間は、季節変化に伴なう海水温
の変化と海苔の生育及び成長の温度条件を考慮す
るとき、必然的に冬場の４〜５ケ月間に限定され
るものであり、したがつて、海苔の生産量も自か
ら制限されることになる。 発明が解決しようとする問題点 本発明者は、海苔養殖が漁場の水温に大きく依
存していて養殖期間が冬場に限定されるため、海
苔の年間における収量の制限が余儀なくされてい
る現状に鑑み、その対策について検討した結果、
養殖に適さない天然品種の海苔が養殖期を終えて
もまだ生育していることに着目し、該天然品種の
海苔が温度耐性の形質を保有していることを見出
し、本発明者がさきに開発した海苔のプロトプラ
スト化の技術に基づき細胞融合の手法を利用し
て、上記温度耐性の形質を養殖海苔に導入するこ
とにより、温度耐性の強い品種の養殖海苔の作成
に成功し、本発明をなすに至つた。 したがつて、本発明は、従来よりも養殖期間を
延長し得る。温度耐性の強い新しい品種の養殖海
苔の作成するための方法を提供することを目的と
する。 以下本発明を詳しく説明する。 発明の構成 本発明の特徴は、温度耐性の強い天然のアマノ
リ品種のプロトプラストを調製し、一方養殖海苔
のプロトプラストを調製し、得られる両方のプロ
トプラストを細胞融合させて細胞融合体を形成
し、ついで該細胞融合体を育成することにより、
温度耐性の強い新しい品種の養殖海苔を作成する
ことにある。 ここでいう“温度耐性の強い天然のアマノリ品
種”とは、通称岩ノリと呼ばれる岩に付着して成
育する野生主であつて、マルバアマノリ、クロノ
リ等を例示し得る。 問題点を解決するための手段 本発明において、温度耐性の強い新しい品種の
養殖海苔を作成するのに用いる、温度耐性の強い
上記例示したような天然のアマノリ品種は、一般
に養殖海苔と同様な黒茶色乃至黒色を呈するが、
それらの葉型はマル葉型乃至それに近く、密殖性
であつて成長速度が遅く、ある程度の大きさまで
しか成長しないため、養殖には用いられない。し
かし、天然のアマノリ品種の海苔は、在来の養殖
海苔に比べて温度耐性が非常に強いという特性を
有するものである。 次に、上記天然品種の海苔の温度耐性を、養殖
海苔との対比において実験した結果を示す。 なお、養殖海苔には、現在養殖に用いられてい
る多種類の品種の海苔のうち汎用されているアサ
クサノリとスサビノリを試料として用いた。 海苔の温度耐性についての実験 実験方法： 試料として各品種の海苔葉体（葉長10〜30mm程
度）の５枚宛を、２容丸型フラスコに人工海水
（Asp.12）1.5とともに入れ、温度30℃、自然光
の条件下に通気培養し、経日的に生細胞率を調べ
た。生細胞率は顕微鏡下100倍の10視野の平均値
で示した。 結果は表１に示すとおりである。

【表】 表１にみられるとおり、30℃の温度条件下での
天然品種の海苔の生細胞率の減少は、養殖海苔に
比べて非常に遅く、したがつて、天然品種の海苔
の温度耐性が強いことがわかる。 本発明では、上述したような天然品種の海苔が
本来保有する温度耐性の強い形質を、細胞融合の
手法を利用して養殖海苔に導入するものであつ
て、そのためまずこれらの海苔のプロトプラスト
を調製する。 上記各海苔のプロトプラストの調製は、本発明
者がさきに開発した方法（特願昭58―149378号
（特開昭60−41485号）又は特願昭59−22415号
（特開昭60−168381号））を適用して行ない得る。 これらの方法の概要を説明すると、前者の方法
は、シユードモナス属（Pseudmonas）に属する
難消化性多糖類（マンナン、キシラン及びポルフ
イラン）の加水分解能を有する微生物（シユード
モナスSPNo.PT―５、微工研条寄No.BP―330）
を、海苔もしくは海苔由来の多糖類（海苔を熱水
抽出して可溶性成分を除去して得られる、主とし
てマンナンもしくはキシランのような多糖類から
成る残渣又は該残渣を更に精製処理して多糖類含
量を高めたもの）を誘導物質とて含む培地中で培
養して得られる培養液を遠心分離し、その上澄液
を酵素液として用いて海苔葉体を処理することか
ら成る。上記酵素液にはマンナン加水分解酵素と
キシラン加水分解酵素が含されている該酵素液を
海苔葉体に作用させるとマンナン加水分解酵素が
海苔の表面に存在する顆粒状のマンナンに作用し
て葉体に大きく切断部を形成し、それによりキシ
ラン加水分解酵素により細胞壁を形成しているミ
クロフイブリル形態のキシランが作用され易くな
つて、葉体の細胞壁が分解除去されてプロトプラ
スト化されるようになる。また、上記酵素液には
ポルフイラン分解酵素も含まれているので、海苔
葉体の細胞充間物質としてのポルフイランにも作
用して分解するのでプロトプラスト化が一そう促
進される。 なお、上記プロトプラスト化に際して、海苔葉
体を予めパパインのようなプロテアーゼで処理す
るか、又は上記酵素液と並行的にプロテアーゼを
作用させると、更に効果的である。 又、後者の方法は、海苔葉体を予めプロテアー
ゼ処理した後、β―１，３―キシラナーゼとβ―
１，４―マンナナーゼで処理するか、或はβ―
１，３―キシラナーゼとβ―１，４―マンナナー
ゼ及びポルフイラナーゼとで処理することから成
るものであつて、非常に短時間で、しかも健全な
海苔葉体のプロトプラストを調製し得る。 本発明においては、上述した方法により天然品
種であるマルバアマノリのプロトプラストを調製
し、一方養殖海苔であるアサクサノリ並びにスサ
ビノリのプロトプラストを同じく調製し、マルバ
アマノリのプロトプラストと、アサクサノリもし
くはスサビノリの各プロトプラストとを細胞融合
させる。この細胞融合は公知の手法を適用して行
なうとよく、上記各２種のプロトプラストを混合
して形成させた沈澱にポリエチレングリコール溶
液と、High―PH―Ca溶液を加えて放置した後、
これに培養液（例えば人工海水Asp.12又は
Provasoliの栄養添加水）を加えて培養を行なつ
て融合体を形成する。なお、培養は15℃の温度で
6000Luxの照度で明期９時間、暗期15時間の条件
下で行なうとよい。 上述のようにして得られた細胞融合体（融合細
胞）について下記の手順により識別（選抜）を行
なう。この識別は、ＡとＢの２種のプロトプラス
トを細胞融合させた場合、２種の細胞の融合体
（Ａ×Ｂ）のほかに、同種の細胞の融合体（Ｂ×
Ｂ及びＡ×Ａ）及び融合しない細胞が混在してい
るので、これらから２種の細胞の融合体（Ａ×
Ｂ）を選抜するために行なうものである。なお、
上記識別のための方法としては両者の細胞の形質
マーカーについて行なうとよく、それには下記の
ようにして品種組合わせ別により行ない得るが、
これに限るものでない。 例えば、アサクサノリとマルバアマノリの各プ
ロトプラストを細胞融合させて得られた融合体の
選抜は、アサクサノリの葉体が細葉型であるのに
対し、マルバアマノリはマル葉型であり、又、単
胞子の放出時期がアサクサノリでは0.2〜１mmの
葉長のときであるのに対し、マルバアマノリでは
0.5〜23mmの葉長のときである両者の相違点を利
用して行なう。すなわち、上記細胞融合体につい
て細葉型であつて、10mm程度の葉長時に単胞子を
放出するものを選抜するとよい。また、直接的な
選抜方法として、前述したように両者の温度耐性
が著しく異なる点を利用して、上記細胞融合体
を、海苔の養殖温度より高い温度下（例えば30
℃）で培養し、適当な日数が経過した時点で生細
胞率が高い細葉型のものを選抜してもよい。 叙上のようにして得られる養殖海苔と天然品種
の海苔の各プロトプラストの細胞融合体は、天然
品種の海苔が保有する温度耐性の形質が導入され
ているので、該誘導体を育成することにより、温
度耐性の強い新しい品種の養殖海苔を作成するこ
とが可能となる。したがつて、本発明によると、
上記品種の養殖海苔を用いることにより、養殖期
間を延長し得るようになる。 発明の実施例と効果 以下に実施例を示して本発明及びその効果を具
体的に説明する。なお、本実施例は、養殖海苔と
して代表的なアサクサノリと、天然品種として代
表的なマルバアマノリを用いて温度耐性の強い品
種の養殖海苔の作成の態様について例示したもの
であつて本発明はこれに限定されるものではな
い。 実施例 アサクサノリとマルバアマノリの各プロトプラ
ストの調製： アサクサノリ並びにマルバアマノリの各葉体の
10枚（葉長０〜20mm）宛をＬ型試験管にそれぞれ
収容し、アサクサノリ葉体では、0.2％濃度のパ
パイン溶液（Ｍ／15トリス塩酸衝液、PH7.4）10
mlを加え、20℃で振盪下（100ストローク／分）
に５分間処理し、マルバアマノリ葉では１％濃度
の上記パパイン溶液を10mlを加え、同様な条件下
で10分間処理した。 ついで、得られた各葉体を海水で十分洗浄した
後、別のＬ型試験管に収容し、その各々に予めシ
ユードモナス（Pseudomonas）sp.No.PT―５（微
工研条寄No.BP―330）をスサビノリ粉末を基質と
する培地中で培養して得られた酵素液（0.75Mン
ニトール添加）10ml宛を加え、20℃で振盪下（70
ストローク／分）に60分間反応させて、プロトプ
ラスト化を行なつた。 このようにして得られた各酵素処理混合物を
40μメツシユのナイロン製網で濾過し、濾液を遠
心分離（1500rpm、５分間）して上澄援液を除去
し、残渣を適量の下記組成の人工海水
（Provasoliの栄養添加海水）を加え、それぞれの
プロトプラスト懸濁液を調製した。 人工海水の組成： 濾過海水100mlに対し、下記栄養剤２mlを添加
して調製したもの。 蒸留水 100ml NaNO₃ 350mg Na₂―グリセロリン酸 50mg Fe（as EDTA；１：１モル） 2.5mg ※１ Ｐ金属混液 25ml ビタミンB₁₂ 10μg チアミン 0.5mg ビオチン 5μg “TRIS”（Sigma Co.） 500mg PH 7.8 ※１ Ｐ金属混液組成 蒸留水 100ml Na₂―EDTA 100mg Fe（as Cl^-） １mg Ｂ（H₃BO₃） 20mg Mn（as Cl^-） ４mg Zn（as Cl^-） 500μg Co（as Cl^-） 100μg 細胞融合体の作成 上述のようにして調製したアサクサノリとマル
バアマノリの各プロトプラストを混合し、このプ
ロトプラスト混合液の0.1ml（約10⁶個）をパスツ
ールピペツトでペトリ皿内に滴下し、５〜10分間
放置してプロトプラストをガラス表面に沈澱させ
た。この沈澱に下記組成のポリエチレングリコー
ル溶液の0.2mlを加えて10分間放置した後、さら
に下記組成のHigh PH―Ca溶液の0.5mlを加えて
５分間放置した。 ポリエチレングリコール溶液の組成 ポリエチレングリコール（MW6000）の54％水
溶液にCaCl₂・2H₂O10.5mM、K₂PO₄・H₂O
0.7mMおよびグルコース0.1Mを添加する。 High PH―Ca溶液の組成 CaCl₂・2H₂Oを100mMおよびグルコースを
0.4Mの各濃度に蒸留水に溶解する。 100mM NaOH―グリシンバツフアー（PH
10.5）にグルコースを0.4Mの濃度に溶解する。 上記との溶液を使用前に１：１の割合に混
合する。 次に、上述のように放置したものに、下記に示
す人工海水（Provasoliの栄養添加海水）から成
る培養液0.3mlを加え、５分後その0.3mlをペトリ
皿から吸い上げ、さらにそれに上記培養液を５分
後その0.3mlを吸い上げる操作を５回繰返して行
なつた後、新たに上記培養液を加えて培養を行な
つた。培養は15℃の温度で6000Lux照度下で明期
９時間（暗期15時間）で行なつた。 細胞融合体の選抜 約10mm葉長程度に育つた時、細葉型のみ１葉体
づつマイクロプレートに入れ、人工海水
（Provasoliの栄養添加海水）を各５ml入れ、単胞
子放出処理（上述の培養条件で温度のみを15℃か
ら20℃に変える）をし、単胞子の放出のあつたも
のだけを選抜しその単胞子を上述の培養条件にて
培養、育成して成葉を得た。 次に、上述のようにして得られた成葉について
の温度耐性を前記本文記載の実験方法に準拠して
実験してその判定を行なつた。結果は表２に示す
とおりである。 なお、比較として細胞融合の処理を行なわない
アサクサノリ及びマルバアマノリの成葉について
も同様の実験を行ない、その結果を併せて表２に
示した。

【表】 表２にみられるように、本発明に従がつて得ら
れる細胞融合体から成る海苔の成葉の温度耐性は
養殖品種であるアサクサノリの成葉より明らかに
強いことがわかる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 温度耐性の強い天然のアマノリ品種のプロト
   プラストを調製し、一方養殖海苔のプロトプラス
   トを調製し、得られる両方のプロトプラストを細
   胞融合させて細胞融合体を形成し、ついで該細胞
   融合体を育成することを特徴とする温度耐性の強
   い新しい品種の養殖海苔の作成方法。 ２ 天然のアマノリ品種がマルバアマノリである
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 養殖海苔がアサクサノリもしくはスサビノリ
   である特許請求の範囲第１項記載の方法。