SU348010A1 - Способ получения литического фермента - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к области микробиологической промышленности, а именно к получению ферментов, способных лизировать оболочку клеток Chlorella, дрожжей н т. п.

Известен способ получени  литического фермента путем выращивани  его продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в присутствии минеральных солей с последующим выделением фермента из культуральной жидкости.

Иредложенный снособ отличаетс  от известного тем, что в качестве продуцента используют микроорганизм Micropolys рога 434. Ири этом выращивание последнего желательно производить при температуре 40-60° С в течение 16-24 час.

Микрооргапиз.м Micropolys рога 434 имеет следующую характеристику.

Морфологи . Воздушный мицелий диаметром около 0,7-1,0 мк, разветвленный, умеренно прилипщий -к среде, белый.

Субстратпый мпцелий немного тоньще, чем воздушный; диаметр около 0,5-0,7 мк, имеет тенденцию проникать в агаровую среду.

Иа поверхности агаровой среды, часто наблюдаетс  скопление из куполообразиых образований .

отдельные споры, но главным образом цепочкп из 2-10 спор. Цепочки пр мые, сравнительно легко раздел ютс  на отдельные споры и при выращивании со встр хиванием не наблюдаетс  цепочек длпнпее, чем из 2-3 спор. Спиральные не образуютс .

Ир1 прорастанни спор наблюдаетс  1 - 2 трубчатых зародыша.

Фрагментов мнцелн  в чашках Иетри не наблюдаетс , но часто встречаютс  фрагменты в 5-20 мк при намазывании на стекло.

Как показывает хроматографический анализ на бумаге после гидролиза клеточной оболочки 611-НС клеточна  оболочка состоит из мезо-сх, е-диаминоиомелиновой кислоты, арабинозы , галактозы и т. д.

Физиологические признаки. Иа сахарозонитратном агаре не растет.

Иа глюкозо-аснарагиновом агаре не растст .

Иа глицерин-асиарагиновом агаре рост умеренный. Иа новерхности среды образуютс  тесные слои. Субстратный мицелий светло-коричневый . Воздушный -мицелий белый. Иа жидком агаре рост хороший. Воздушный мицелий белый. Субстратный мицелий свегло-коричневый . Растворимого пигмента пег. Среда имеет порошковатую поверхность.

сти среды. Иа второй день разжижени  студн  не наблюдаетс , но на четвертый день наблюдаетс  умеренное разжижение.

Среда Беннета. Хороший рост. Воздушный .1Нцелий белый. Субстратный .мицелий светло-корнчневый . Растворимый нпгмснт сиетло коричневого цвета.

Агар с кра.хмалом н неорган.ичсскимн с(.о1м .M1I. Через чет1)1ре прн 50 С роста нег. Разжнжен 1  К15а.мала нет.

Лгар с кра.х.малом н .м сным нентоно.м. Хо ) рост. Воздунпчый мнцелнй бельп. Субстратный мнне.пн сБ(ЛЛ())нч 1еиы| 1. Растворимы HHiMCHi, ciiei;i()-i(.)pH4Hc-Bbii i. -1ере,ч два дн  Hpii 50 С крахмал нолностыо гидро:1нзуетс ,

Декстрнно-казе1П оиый агар. Хороший pi;cT. Воздуншый .пIнeлий желтовато-белый. Растворимый н HIмен т светло-желто-кор1 ЧневыГ|.

1 нтратиа  среда. Тонкий нлснкообразшл рост. Воздушный М1 нс;1нй бе.лый.

Ьгграт не восстанавливает.

Па .laK.M coBOM молоке )астет с образо1(аинем колец. Через два-дн  н)и 50 С иаб.тюдаетс  нег|тоннза1дн . /

Па 1.:артофельно1 1 массе роста нет.

11,е.1люлозо-аснарагн110Ба  С1)еда. Роста нет. Целлюлоза не разла1аетс .

1.,е, люлозо-декстрш-10-казеиио1 а среда.

Умереиный рост в внде колоний. Возду Н1Н 1| 1 мнцелнй белв1Й. Почти не наблюдаетс  раз.тоженн  неллю;10зы.

Па нитггге.ииюГ агаровой с)еде Hei роста нрн 30, слаб1,1Й рост нрн о7, ме1)енный нри 40-45 и ,) рост нри 40 - 45С. .Умс|)снН1 ) рост, но слабое сцсн,тение воздушного мицелн  нрн 55--60 С н нло.хой рост нрн 65° С.

Споры не по1 1бают нри тенловси: обрабоп;с в теченне 10 мин нрн 100 С. При экстракщш гор чим 80%-ным этаноло.м наб.тюдастс  нрнсутхтвнс 2,6-днноколеииовой кнс,К)Т1). Этот факт не наблюдаетс  дл  нзвеспюго )ода.

Г1итател1Л1а  ереда, иримен е.ма  .нрн предложенном стюсобе, соде1)Ж1гг источники у1лерода , азота, HeojiraiiiniccKHx солсм : и opraiiHMcски .х нитательн1 гх вен1еств. Источником углс л )да можег быт1) нолн.мер, и.мею1цнй с|)авннтельно высокую стенень но.;1И.мери:;ацн11, нанример крахмал, декстран, декстрнн, ннулнн II т. н., но са.хара, имсюшие ннзкую степень но,тимернзацнн, наиример, .моноса.ха)1ды, днса .харнды н т. н. непригодны. Псгочииками азота .может бвггь сульфат ал1монн , х.торн.ц аммони , фосфат а.м.моии , нитрат аммони  н т. II. Меорганнческие соли добавл ютс  к среде в качестве источников разлнчны.х э.те.ментов , существенных дл  роста мнкроорганизма II . нредетавл ть нодход шую комбинацию различных фое11)атов, 1 алийиых, ма1незиальных , цинковых, медных, железных, марганцевых и т. и.солей. В качестве ор аи 1ческнх ннтате; ьиых веществ добавл ют такнс вещества, как витамннв, аминокислоты, дрож}кевой н солодовы) .экстракты н т. д,.

Среда может также состо ть нз сущесгвенно важных неорганических солей и живых клеток некоторых дрожжей, хлореллы, грибков, бактерий и т. д., которые иодвергаюте  действню (рерме гга насто щего изобретени . В последнем случае живые клетки служат в качестве источника углерода, азота и нитательных вендеств, но лучшие результаты могут быть ;.;остигнугы, если к среде добавл ют

дрожжевой н солс довый экстракт и т. д.

Вырашивание обычно начинают суспендированием Micropolys рога 434 в стерилизованной воде нутс.м Hepeiifica нетле11 и.татиновой 11ГЛ1л чисто11 ку;|ьтурв1 и дсгЗавлеии  нолучаюшейс  суснензнн к нитательной среде онисацного выше тина. Выращивание обычно заканчивают за период 1( -48 час с аэрированием нри температуре 40--60°С.

Фер.меит накапливаетс  во врем  выращивани  в ку,тьтуральной жидкости и верхний слой носле удалени  мицели , ианример, центрифугироваиием , .может примен тьс  как таковой дл  лпзир( клеточной оболочки или может высушиватьс  ири темнературе ниже 0°С дл  получени  его в виде порошка.

Дл  нолучени  более очищенного ирепарата раствор неочищенного фермента высаливают сульфатом аммони  или обрабатывают

ацетоном дл  оеаждени  фермента. Высаливание производ т цуте.м добавлени  сульфата а.м.мслш  к расгвору фермента до етенени насыщени  0,4, удалени  образова;вшегос  оеадка , да.1вне1 1шего дс,баво1еии  до стеиени наеы|цс1111  0,G и собнрани  осевшего фермента. Добавл ть сульфат аммони  можно за один прием. Лучшие результаты в этом случае по .чучают, если сульфат аммони  добав 1 ют до етенени насыидеии  0,8. С другой стороны дл 

осаждени  фермента .можно обрабатывать раство) ацетслю.м. Панлучшнй результат получают нрн .медленном добавлении ацетона до концентрации 60% н отделении оеадка после ие1)емещнванн  в течение 1 час. Полученный

фер.меит раство|з ют зате.м в подход щем буферном растворе, например в 0,01 п. растворе КНгРО., (,0) и диализируют в тот же буферный раствор. Внутренний раствор (расiBop , остаюнипк  в .мешке из мембраны после

диализа) иредставл ет высоко чистый раствор фермс1гга, его можно высушить нри темлературе ииже 0° С аналогнчно неочищенному раствору фермента.

Г1)едложенньи1 литический фермент имеет

следующие характеристики.

Устойчив в пределах рП 5,0-9,0. Оптимальный предел рП 7,0-8,0.

УХктивеи ири температуре 40-70° С, в особенности :нрн 50-60° С.

Будучи сюйкнм нри низкой температуре, он не дезактивн)устс  нрн 0 С и тер ет активноеть нри 100°С за 10 мин.

Hg++, Fe++, Zn++, Cd++, Ni++ и умеренно Mn++, Co++, HO активируетс  и Mg++.

Полученный литический фермент пригоден дл  экстрагировани  многих полезных внутриклеточных веществ, например протеина, нуклеиновой кислоты, аминокислот, витамина и др.

П р и м е р 1. В среду А производ т посев Micropolys рога 434. Среда сОхТ,ержит 5 г живых клеток Candida rugosa IF-101; 1 г KsHPO ; 0,5 г MgSO.,. УНаО и 1000 мл дистиллированной водЕл; рН 7,4. Выращивают со встр хиванием 24 час три 50-55° С, после чего живые клетки Candida rugosa IF-101 полиостыо раствор ютс . Полученную культуральную жидкость затем центрифугируют при 5000 об/мин iB течение 10 мин, клетки и споры Micropolys рога 434 удал ют. Получают неочищенный раствор фермепта, обладающий большой активностью но растворению клеточной оболочки.

Готов т суспензию живых клеток каждого вида дрожжей, перечисленных в табл. 1, с концентрацией 10 мл, содержащую 0,1% K2lIP04 и 0,05% MgSO.|-7H20 в дистиллированной воде и рН довод т до 7,4. Примен вшиес  дрожжи , содержащие живые клетки, получают посевом этих дрожжей в среду, содержащую глюкозу, (NH4)2SO.,, КЫгРО.,, MgSO4, сололювый и дрожжевой экстракты, и.1еющую рП 5,4. Выращивают их встр хиванием 24 час при 30° С.

Затем после доведени  неочищенного раствора до рН 7,4 к каждым 3 мл этого раствора добавл ют 0,2 мл суснензии живых клеток и смесь слегка встр хивают 4 час при 50° С, Результаты, приведенные в табл. 1, показывают , что больша  часть дрожжевых клеток разрушепа и растворена.

Уменьшение мутности реакционной смеси, указанное в табл. 1, определ етс  визуальио. Три :плюса обозиачают полное растворение клеток, два плюса - умеренное растворение и один плюс - слабый лизис клеток.

Степень лизиса клеток вычисл ют по следующей формуле: где Si - исходное число клеток; Sa - ЧИСЛО иелизироваппых клеток, тающихс  в реакционной смеси. Пример 2. В стерилизованную при 120°С в течение 3 мин среду Б, содержащую около 10 г увлажненных клеток Chlorella ellipso idella tamiga; 1 г K2HPO4; 0,5 г MgS04X7H,O и 1 г дрожжевого экстракта в 1000 мл дистиллированной воды с рН 7,4 засевают мицелий Micropolys рога 434 и выращивают при 50° С 24 час. Нелизированные клетки Chlorella удал ют центрифугированием дл  получени  неочищенного раствора фермента, который имеег большую активность по лизированию живых

Таб.)1нца 1

К 3,0 мл нолучепного таким образом раствора добавл ют 6,2 мл суснензии клеток Chlorel1а (3x10 мл) и смесь выдерживают при 50°С в течение 18 час прп легком встр хивании. Полученные результаты показап1л в табл. 2, где мутность даиа в велпчипах оптической плотности , измеренной при длине .волны 530 ммк. Стандартный раствор готов т путем добавлени  к суснепзии Clilorella фосфатного буферного раствора (рП 7,4) вместо раствора фермента в количестве равном раствору фермента.

Таблица 2 П р и м ер 3. К неочищениому раствору фермента , полученному как в примере 1, добавл ют сульфат аммоии  до степенн насыщени  0,4. Образовавшиес  осадки удал юг и сульфат аммони  добавл ют до стенеии иасыщени  0,6. Полученные осадки собирают центрифугированием и суспенднруют в днстиллированной воде. Суснензию диализировали через целлофановый .мешок дл  получени  очищенного фермента. Полученный очищенный фермент добавл ют к жидкому образцу, содержащему мицелий Aspergillusorizal IAM 2024. После выдерживани  смеси при 50° С в течение 4 час больша  часть клеточных оболочек мицели  была разрушена.

3 мин, добавл ют 2,0 мл раствора фермента, полученного в нримере 3.

После доведени  рН до 7,4 смесь выдерживают 4 час при 50°С. Около 70% клеток было разрушено.

Пример 4. В среду В (содержан1ую 20 ; крахмала; 2 г (МП,),SO.,; 2 г КНаРО,; 5 г К2НРО.,; 2 г MgSO., 7Н2О; 0,006 г CuSO,,бНгО; 0,001 г FeSO4-7H2O; 0,008 г МпСЬ 4Н2О; 0,002 г ZnSO.,-71-120 и 10 г дрожжезого экстракта в 1000 мл дистиллированной воды -при рП 7,4) засевают Micropolys рога 434 и вырааитвают при встр .хиваини при 50° С в течение 24 час.

Культуральиую жидкость центрифугируют при 5000 об:мин 10 мин. Мицелий и споры удал ют и получают раствор неочищенного фермента , обладающий большой активностью но лизироваиию клеточиых оболочек.

К получеиному раствору иеочнп;енпого фермента добавл ют сульфат аммонн  до степени наеыщепи  0,8 и смесь :перемешивают 4 5 час при 5°С, при это.м 1получа1от коричненып осадок. Последний отдел ют центрифугированием при 10000 обIмин, раствор ют в 90 мл 0,01 М раствора фосфатного буфера (рП 7,0) н днализируют в тот же буферный раетвор при 5° С. Получают раствор очищенного фер .мента, который высущивают при низкой температуре . Получают 195 г чистого фермента в виде порощка.

П р и м е р 5. К раствору неочищенного фермента , полученного как в примере 4, поддерживаемому ири 5° С, добавл ют ацетон при перемещиваиии до достижени  ацетоном 60%-ной концентрации и продолжают перемешивание 5 час. Образовавшийс  осадок отдел ют центрифугированием при 10000 об лшн 10 мин и раствор ют в 90 мл 0,01 М раствора фосфорного буфера (рП 7,0). Полученпый расччюр днализируют в тот же буферный рас1В (зр ири 5° С и получают раствор очищенного фермента.

Предмет изобретени 

1.Способ нолучени  литического фермента нуте.м выращиванн  его продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода , азота, в присутствии .минеральных солей е гюследующи.м выделением фермента из культуральиой жидкости, отличающийс  тем, что в качестве продуцента иснользуют микроорганизм Micropolys рога 434.

2.Способ но 11. 1, отличающийс  тем, ч го вырандивание осуществл ют при температуре 40-60° С в течение 16-24 час.