KR900005530B1 - 고농도당 내성의 바실러스속 두산 3호(Bacillus sp.Doosan 3)와 이를 이용한 다당류의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
내용 없음.
Description
제1도는 본 발명의 바실러스속 두산 3호(Bacillus sp. Doosan 3)를 전자현미경(×30,000)으로 관찰한 결과로서, (a)도는 TEM에 의한 상기 균주의 외모를 관찰한 사진이고, (b)도는 SEM에 의한 상기 균주의 횡단면을 나타낸 사진이고,
제2도는 제1도의 바실러스속 두산 3호(Bacillus sp. Doosan 3)를 이용하여 발효시켜서 생성된 건조다당류를 0.01 내지 1% 용액으로 만든 다음 분광광도계로 스캐닝한 결과를 나타내며,
제3도는 제2도의 다당류를 IR스펙트럼한 결과 그래프를 나타낸다.
본 발명은 바실러스속 두산 3호(Bacillus sp. Doosan 3)와 그의 배양물로부터 점성을 갖는 다당류를 제조하는 방법에 관한 것이다.
현재까지 다당류는 동물과 식물 및 미생물 등으로부터 제조되어 왔는데, 그 중에서도 특히 식물을 기원으로 하여 제조된 다당류와, 셀룰로오즈와 알긴산을 기초로해서 제조된 반합성 다당류 및 미생물로부터 생산되는 다당류가 유용한 것으로 알려져 있다.
세계적으로 다당류에 대한 소비가 증가추세에 있는 실정인데 그에 부응하여 식물성 다당류의 생산은 부족하다. 최근에는 미생물로부터 잔탄검을 제조해내는 방법이 상업화에 성공함에 따라 미생물로부터 제조된 다당류에 대한 관심이 날로 증가하게 되었다.
그리고 미생물을 이용해서 다당류를 제조할 수 있다는 사실은 이미 오래전부터 알려져 왔으나, 종래 미생물로부터 다당류를 제조해 내는 경우에는 대부분이 탄수화물을 탄소원과 에너지원으로서 이용하게 되고 암모늄과 아미노산을 에너지원으로서 이용하게 되고 암모늄과 아미노산을 질소원으로 이용하여서 다당류를 생산해내는 것으로 보호되어 있었으며, 그 밖에도 미생물의 배양에 따른 배양온도와 배양 pH, 염류 및 통기량 등의 여러 가지 배양조건에 의해 생성되게 되는 다당류 생산조건도 보고되어 있었다.
한편, 식물성 다당류는 그의 생산수율 및 용도면에서 제한을 받고 있으나, 미생물로부터 생산되는 다당류는 미생물이 생육할 수 있는 일정조건하에서 발효에 의해 대량생산이 가능하므로 상업적으로 생산할 수 있는 가능성을 부여해 줄 뿐만 아니라, 여러 가지 미생물로부터 생산되는 다당류는 대부분 독성이 없어 유해하지 않기 때문에 식품 및 화장품의 제조원료로 사용될 수 있는 잇점이 있다.
또한, 식물성 다당류보다 미생물로부터 제조된 다당류가 그의 응용면에서도 많은 특성을 갖고 있는 바, 예를들어 미생물로부터 생산된 다당류의 경우 중점능과 안정능, 겔화능, 결합능, 보수능(water holding capacity), 피복능, 필름화능, 생리활성능 등과 같은 기능적 특성을 갖고 있기 때문에, 이러한 기능적특성에 따라 식품첨가물과 화장품첨가제, 특수한 화학약품, 에너지 생산에 쓰이는 화학약품, 의약품, 바이오 의약품 등으로 다양하게 이용 연구되고 있으며, 이런 응용들은 다당류의 유동학(rheology) 특성에 의해 결정되게 된다. 그러나, 이와같이 여러 가지 면에서 식물성 다당류보다 유용한 미생물로부터 생산된 다당류는 그 제조에 있어 대량생산할 수 있는 것으로 알려져 있기는 하지만 아직까지 본격적인 대량생산에 이용되는 경우는 그리 많지 않았고, 그 중 일부의 미생물만이 공업적 규모로 다당류를 생산하는데 이용될 뿐이었다.
즉, 종래에 미생물을 이용하여 다당류를 제조하는 방법에 있어서는, 예컨대 알카리균속(Alcaligenus) 또는 잔토모나스속(Xanthomonas), 아스로박터속(Arthrobacter), 슈도모나스속(Pseudomonas) 및 바실러스속(Bacillus)에 속하는 세균과 함께 한세눌라속(Hansenula)과 로도돌루라속(Rhodotorula)에 속하는 효모, 플루라리아속(Pullularia), 아스퍼질러스속(Aspergillus)에 속하는 곰팡이류 등이 이용되는 것이 널리 알려져 있으나 공업적으로 응용되고 있는 것은 많지 않았다.
이와같이, 미생물을 이용하여 다당류를 생산하기 위해서는 균주의 선발과 배양조건, 회수, 정제방법, 안정성, 시장성 및 용도적성 등 충분한 검토가 이루어지지 않으면 안도기 때문에, 현재까지 미생물로부터의 다당류의 생산에 대한 연구가 진행되어 오기는 했으나 그 연구상태가 아직 미흡한 상태에 그치고 있고 최근에는 많은 나라에서 이에 관한 연구에 많은 노력을 기울이고 있다.
이에 본 발명자는 공업적으로 유용한 다당류를 생산할 수 있는 신규한 미생물을 토양시료로부터 분리해냄과 아울러 이를 이용해서 점성을 나타내는 새로운 다당류를 대량 생산할 수 있는 기술을 발명하게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은 토양으로부터 고농도의 당을 함유한 배지하에서 분리해낼 수 있는 신규한 미생물과 이를 이용하여 다당류를 제조해내는 방법을 제공하는데 있다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 토양으로부터 45~50%의 고농도당이 함유된 배지에서 분리되며 점성을 가지며 필름형성능과 접착능이 함유된 발효배지에 접종배양시켜 생산된 다당류를 통상의 용매침전법에 의해 추출해내는 다당류의 제조방법을 그 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명의 바실러스속 두산 3호는 다음과 같은 균학적 성질을 갖는다.
(1) 포자형성능이 있다.
(2) 한천평판상에서 투명한 다당류를 생산한다.
(3) 4.5 내지 10의 넓은 초기 pH 범위내에서 생육한다.
(4) 고농도당 배지에서 생육이 양호하다.
(5) 액체배양시 높은 수율로 다당류를 생산한다.
이러한 특성을 갖는 바실러스산 두산 3호의 배지로는 탄소원과 질소원, 무기염류 및 임의로 미량원소가 함유된 통상의 배지가 사용될 수 있는 바, 탄소원으로서는 글루코오즈(Glucose), 라피노오즈(Raffinose), 락토오즈(Lactose), 만노오즈(Mannose), 수크로오즈(Sucrose), 말토오즈(Maltose), 플럭토오즈(Fructose), 녹말가수분해물, 섬유소분해물 등의 탄수화물이 이용될 수 있으며, 질소원으로 펩톤(Peptone), 효모추출물과 요소 등의 유기질소원과 질산염, 인산암모늄염, 염화암모늄, 황산암모늄 등의 무기질소원이 이용될 수 있고, 마그네슘과 칼륨, 칼슘, 철 등의 염류가 이용될 수 있다.
그리고, 본 발명에 따른 두산 3호의 배양에 필요한 배양온도는 20~40℃로서 30~37℃의 온도범위가 바람직하고, 배양약의 pH는 4.5 내지 10.0, 바람직하기로는 6.0 내지 7.5의 중성 pH이며, 통성호기성균이기 때문에 배양시 통기를 하여 주는 것이 바람직하다.
상기 바실러스속 두산 3호의 분리방법에 대해 상세히 설명하면 다음과 같다.
우리나라 각지의 토양중 약 1400개의 토양시료 각 0.5g을 45~50% 고농도당이 함유된 액체 A배지(조성 : 효모추출물 0.2%, KH2PO40.1%, MgSO40.01%, 용해성 전분 0.5%, pH 6.5) 5ml에 현탁시킨 후, 30℃의 배양기내에서 3~10일 동안 정치배양시켜서 배양액의 점도를 관찰하여 1차 스크리닝한 다음, 1차 스크리닝으로 점도가 관찰된 배양액을 2% Agar가 함유된 상기 액체 A배지에 적당 농도로 희석시킨후 플레이팅하여 균체(colony)를 순수분리하며, 이와같이 하여 순수분리한 군락을 변형된 액체 A배지(용해성 전분이 제거되고 20% 수크로즈가 함유된 액체 A배지)에서 10일 동안 액체 배양후 원심분리에 의해 균체를 제거해낸 다음, 그 상등액으로부터 메탄올 침전법에 이해 침전된 원심분리에 의해 얻고, 이를 진공건조하고 무게를 측정하여 2차 스크리닝함으로써 10개의 균주를 분리하여, 이를 본 명세서에서는 P1-P10균주로 명명하였다.
이와같이 분리된 균주들의 다당류생산능을 살펴보면 다음의 표 1과 같은데, 이로부터 본 발명의 방법으로 분리해낸 10가지 균주가 다당류를 생산할 수 있음을 알 수 있었으며, 그중 다당류생산능이 제일 큰 P1균주를 선발하였다.
[표 1]
그리고 상기 P1균주의 균학적 성질은 다음과 같다.
[1] 형태학적 성질
I. 현미경에 의한 관찰
ㅇ 영양세포 형태 : 장간균
ㅇ 운동성 : 있음
ㅇ 크기 : 0.5×2.5~5.5㎛
ㅇ 포자 : 중앙부근에 별모양의 포자를 형성(첨부도면 제1도 참조)
II. 그람 염색 : 양성
III. 배지에서의 생육상태
(1) 영양 한천(Nutrient Agar, Difco)배양-백탁으로 주름이 없으며 광택도 없음.
(2) 영양 액체(Nutrient Broth, Difco)배양-상부에 피막을 형성하지 않으며 균체는 침강함.
(3) 육즙 젤라틴(Nutrient Gelatin, Difco)배양-액화가 늦게 발생됨.
(4) 브레인 하트 인퓨존(Brain Heart Infusion, Difco)한천 배양-30℃와 37℃의 배양 온도에서 24시간내에 생육양호.
[2] 생리학적 성질
1. 생육 온도 : 15~45℃
2. 생육 최적 온도 : 30℃
3. 생육 pH : 4.5~10.0
4. 생육 최적 pH : 7.0
5. 생육 당농도 : 0~30%
6. 생육 최적 당농도 : 10%
7. 산소요구성 : 편성호기성
8. 전분의 가수분해능 : 양성
9. 카세인의 가수분해능 : 양성
10. 인돌(Indole)의 생성 : 음성
11. 헤모라이시스(haemolysis) : 양성
12. 카탈라아제(catalase)의 생성 : 양성
13. NaCl 생육(5%, 7%, 10%) : 음성
[3] 탄수화물의 발효성
1% 펩톤(Peptone), 0.5% 칼륨포스페이트(K2HPO4), 0.00625% 브롬크레졸 퍼플(bromcresol purple)용액에 당을 1%(CMC는 0.5%사용)로 첨가하여 듀람(Duhram)관을 넣은 시험관에 분주하고 3일간 간헐살균을 행한 후, 여기에 공시균을 접종시켜서 30℃의 온도에서 일주일동안 가스발생유무와 산생성유무를 관찰하였으며 그 결과를 다음의 표 2에 나타내었다.
[표 2]
이상의 제성질에 다라서 Beargey's Mannual of Systematic Bacteriology 제1판에 따라 분류할 경우, 본 발명에 따라 분리된 균주는 바실러스속으로 동정되었으며, 그 포자는 별모양으로 중앙부근에 형성된다는 점과 글루코오즈에서 산과 가스가 발생된다는 점 및 카제인분해능이 있다는 점으로 보아 바실러스 플리믹서(B.polymyxa)에 가까운 것으로 추정되며, 솔비톨을 발효시키고 고농도당에서도 생육된다는점 및 알카리성 pH에서 생육된다는 점으로 보아 본 발명의 상기 균주는 바실러스속에 속하는 신균종으로 동정되는 바, 이를 본 발명자는 바실러스속 두산 3호(Bacillus sp.Doosan 3)로 명명하였으며, 이를 한국종균협회에 1988년 6월 27일 KFCC-10619호로 기탁하였다.
한편, 본 발명의 균주를 이용하여 다당류를 생산하는 방법을 설명해 보면, 우선 상기 균주를 발효배지에서 배양시키게 되는데, 이러한 배양에 사용되는 배지로는 미생물이 자화할 수 있는 탄소원과 질소원 및 생육에 필요한 각종 무기염류 등의 영양원이 함유된 배지가 이용될 수 있다.
이와같은 배지에 필요한 상기 탄소원으로는 전분, 포도당, 설탕, 라피노오즈, 락토오즈, 만노오즈, 말토오즈, 플럭토오즈 등이 이용될 수 있으며, 질소원으로는 요소(urea), 육즙(beef extract), 펩톤(peptone), 콘스팁리쿼(corn steep liquor) 효모추출(yeast extract) 등의 유기질소원 및 초산암모늄, 유산암모늄 등의 무기질소원도 이용될 수 있고, 무기물로는 염화나트륨 또는 마그네슘, 망간, 칼륨, 철, 칼슘 등의 인산염, 초산염, 탄산염 등이 이용될 수 있다.
본 발명에 따르면 상기 본 발명의 균주의 배양은 pH 4.5~10.0에서 실시하며 바람직하게는 pH 6.0~7.5에서 실시하며, 이때 배양은 20~45℃의 온도에서, 바람직하게는 25~40℃의 온도에서 실시하고, 통상 수일정도 배양시키면 좋다. 또한 본 발명의 균주는 통성호기성 균주이기 때문에 배양중 통기를 해주는 것이 바람직하다.
상기와 같이 배양시킨 배양물 중에는 본 발명에서 얻고자 하는 다당류가 함유되어 있으므로 이러한 배양액중에서 다당류를 추출 정제할 필요가 있다. 우선 다당류를 정제할 때는 준비된 배양물에서 균체와 기타 불필요한 고형물을 제거한 후 다당류를 회수하는 것이 좋다. 이와같은 정제방법으로는 가수부해와 원심분리, 세척, 건조, 용매에 의한 분별침전 및 추출 등의 방법으로서 다당류를 불순물으로부터 회수하기 위한 통상의 방법들을 단독 또는 조합하여 실시하면 좋은데, 한가지 예로서 배양물에 2배정도의 물을 첨가한 후에 원심분리에 의해 균체 및 고형물을 제거해낸 다음, 여기에다 메탄올 등의 용매를 첨가하여서 다당류를 석출시키고, 이 때 얻어진 다당류를 물에 용해시켜서 다음 메탄올 등의 용매를 이용하여 다당류를 석출시키는 방법이 있다. 이런 처리과정을 수회 반복한 후, 투석 및 동결건조시킴으로서 상기 균주로부터 제조된 다당류를 정제된 형태로 얻을 수 있게 된다.
이와같이 하여 얻어진 다당류의 성질을 분석해본 결과는 다음과 같다.
(1) 일반조성성분
(2) UV spectrum
λmax : 210nm(첨부도면 제2도 참조)
(3) 적외선 흡수 스펙트럼(IR spectrum)
첨부한 도면 제3도에 나타내고 있다.
(4) 용매에 대한 용해성
물에 수용성이며 메탄올, 에탄올, 이소프로판올(isopropanol), 아세톤 등의 유기용매로는 불용성이다.
(5) 발색반응
닌히드린(Nin hydrin)반응, 아닐린 프탈레이트(Aniline phthalate)반응, 염화제이철(3% FeCl3)반응, 요오드 반응, 암모니아(3% NH3OH)반응은 음성이고, 황산반응, 과망간산 반응은 양성이며, 모리쉬(Molish)반응, 피노프(Pinoff)반응, 일 페크만(Ihl-Pechman)반응은 양성을 나타낸다.
(6) 물질의 색
백색
(7) 점도
10% sample 용액을 브럭필드(Brookfield) 점도계 LV2추를 사용하여 12rpm 측정시 1175CP(센터포이즈)를 나타내었다.
(8) 원소분석
탄소 40.1%, 수소 6.59%, 질소 0.2% 이하
본 발명에 따른 다당류는 이상과 같은 특징외에도, 유리판위에 적정농도(1~10% w/v)로 가열용해시킨 상기 다당류를 코팅시켰을 때 단시간내에 필름이 형성되고, 또 상기와 같이 코팅된 2개의 유리판을 가열처리시킨 후에 냉각시키면 큰 접착능을 나타내게 되며, 물을 흡수하는 능력(보수성)이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서 이러한 특성을 갖는 본 다당류는 결합재와 피복재 및 포장재로서 식품, 화장품, 의약품 등에 이용되는 것이 가능하며, 단독으로 사용되거나 다른 다당류와 조합하여 물성개량재로서 사용할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
[실시예]
다당류 생산을 위해 사용한 배지는 다음고 같은 조성으로 제조하여 멸균시켰다.
(배지조성)
수크로오즈(Sucrose)5%, 폴리펩톤(polypeptone)0.2%, 효모추출물 0.3%, 인산칼륨 0.1%, 유산마그네슘 0.02%, 염화나트륨 0.1%(pH 7.0, 121℃의 온도에서 15분간 가압멸균시켰다.)
30ml 실험관에 상기 배지 5ml을 넣고 여기에다 토양시료에서 분리한 바실러스속 두산 3호(KFCC-10619호)를 접종시키고 36℃의 온도에서 2일간 250rpm 진탕배양 시켰다.
250ml 삼각플라스크에 100ml의 배지를 제조한 다음 여기에 상기 배양액 5ml를 접종한 후 36℃의 온도에서 2일간 250rpm 진탕배양시킨 배양물을 3ℓ배지가 들어 있는 5ℓ 발효조로 접종하여 36℃의 온도에서 3일간 300rpm, 0.2v/m 조건으로 배양시켰다.
상기 배양액 3ℓ에 증류수를 첨가하여서 2배로 희석한 후 5000rpm에서 20분동안 원심분리를 실시하여 균체 및 불순물을 제거한 다음, 그 상등액에 2배 부피의 메탄올을 첨가하고 1시간 동안 정치한후 상등액을 제거하여 다당류를 섬유상으로 추출하였다. 이 다당류를 다시 물에 용해시켜서 상기 메탄올 침전법을 2회 반복처리한 후, 다당류용액을 셀룰로오즈튜브(분획분자당 10,000)에 넣어 2일간 투석하고, 동결건조시켜서 섬유상의 정제다당류 79.3g을 얻었다.
이렇게 얻어진 정제다당류는 상기와 같은 제성질을 갖고 있으며 이때 수율은 52.9%이었다.
Claims (2)
- 토양으로부터 45~50%의 고농도당이 함유된 배지에서 분리되며 점성을 가지며 필름형성능과 접착능이 우수한 다당류 생산능을 갖는 바실러스속 두산 3호.
- 토양으로부터 45~50%의 고농도당이 함유된 배지에서 분리되며 점성을 가지며 필름형성능과 접착능이 우수한 다당류 생산능을 갖는 바실러스속 두산 3호를 탄소원과 질소원 및 기타 생육에 필요한 무기염류 동의 영양원이 함유된 발효배지에 접종배양시켜서 통상의 용매침전법에 의해 다당류를 추출해내는 것을 특징으로 하는 바실러스속 두산 3호를 이용한 다당류의 제조방법.
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| KR1019880008436A KR900005530B1 (ko) | 1988-07-07 | 1988-07-07 | 고농도당 내성의 바실러스속 두산 3호(Bacillus sp.Doosan 3)와 이를 이용한 다당류의 제조방법 |
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| KR900001840A KR900001840A (ko) | 1990-02-27 |
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| KR900001840A (ko) | 1990-02-27 |
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