CN116904426A - 一种利用菌株hz20-1生产甲壳素酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术应用领域，尤其是涉及一种利用菌株HZ20‑1生产甲壳素酶的方法。取菌株HZ20‑1接入种子培养基活化培养，得到活化后的菌液；将活化后的菌液按2％‑10％的接种量接入发酵培养基中进行发酵培养，以得到甲壳素酶；所述菌株HZ20‑1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2023172，保藏日期为2023年02月22日，保藏地址是中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。该甲壳素酶经检测属于组成型酶，非诱导酶，对该菌进行发酵工艺优化，即可通过菌体的持续扩增达到持续产酶的效果。与现有技术相比，本发明菌株HZ20‑1来源新型，其发酵方法简单，产酶成本较低，应用价值大。

Description

一种利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法
技术领域
本发明属于微生物技术应用领域，尤其是涉及一种利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法。
背景技术
甲壳素(chitin)，是自然界中结构非常稳定的生物高分子，广泛存在于高等真菌的细胞壁，节肢动物(虾、蟹)、昆虫的外壳，是除了纤维素以外的全球第二大生物多糖大分子物质。其降解产物氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖在食品、医药、环保、农业、日化等众多领域内已经拥有巨大的应用价值。但由于甲壳素分子内及分子间强的氢键作用，使其具有很好的化学稳定性，给其应用研究带来了非常大的困难。目前，主要用于甲壳素降解的方法是酸解法，但由于通过该法得到的降解产物脱乙酰基严重，对工厂设备要求高，环境污染严重等问题，所以利用温和的生物酶法降解是目前研究的热点。
甲壳素酶大多来源于微生物，其中细菌占到70％以上，主要用于对外界所需碳源进行降解和利用。另外，植物和人体内也发现含有甲壳素酶，起到抵抗病原菌入侵的作用。近年来，甲壳素酶在医药领域中用于抗真菌感染，及治疗癌症和慢性炎症中作为新型生物标记物的作用被广泛报道。目前，已经从微生物中开发出了许多甲壳素酶，但多存在酶活低、生产成本高及热稳定性差等原因而限制了其工业化生产。因此，开发自然界中的新型高产甲壳素酶微生物的菌种和优化其产酶工艺，对甲壳素系列产品的开发利用具有重要的科学和经济意义。
目前甲壳低聚糖的制备方法大致可以分为化学法、生物法两大类。化学法反应速率高，但反应过程不易控制，产品结构易被修饰，产物分离提纯困难，产率较低，且环境污染严重；相对于化学降解法，酶法(生物法)降解甲壳素具有条件温和易控、功能性寡糖得率高、不易造成环境污染等优势。
不同的菌株产的甲壳素酶不尽相同，其产酶发酵条件也各有差异，因此筛选出高效产甲壳素酶的菌株并研究其产酶发酵条件在甲壳素的研究方面也至关重要。
发明内容
基于现有技术中产甲壳素酶的菌株存在的产酶需要诱导物以及产酶量和酶活较低的问题，本发明提供一种利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法，所述菌株HZ20-1在发酵培养基中进行发酵培养，以得到甲壳素酶；所述菌株HZ20-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2023172，保藏日期为2023年02月22日，保藏地址是中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
在本发明的一个实施方式中，利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法，步骤为：
取菌株HZ20-1接入种子培养基活化培养，得到活化后的菌液；
将活化后的菌液按2％-10％的接种量接入发酵培养基中进行发酵培养，以得到甲壳素酶。
在本发明的一个实施方式中，所述发酵培养基中的碳源选自乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖或水溶性淀粉中的一种，优选为乳糖或麦芽糖。菌株HZ20-1能够利用包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、麦芽糖和水溶性淀粉在内的多种碳源进行生长和产甲壳素酶。
在本发明的一个实施方式中，所述发酵培养基中的氮源选自硫酸铵、蛋白胨、尿素、酵母粉、花生饼粉、黄豆饼粉、麸皮或牛肉膏中的一种，优选为硫酸铵、花生饼粉和蛋白胨。菌株HZ20-1能够利用包括花生饼粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、黄豆饼粉、麸皮、尿素、玉米浆、硫酸铵等在内的多种氮源进行生长和产甲壳素酶。
在本发明的一个实施方式中，所述发酵培养基的组成为：碳源2-5g/L、氮源20-30g/L、pH 6.0-6.5。优选地，所述发酵培养基的组成为：乳糖2.5g/L、花生饼粉25g/L、pH6.2。
在本发明的一个实施方式中，进行发酵培养时的条件为：pH范围为4.0-10.0，温度范围为28-42℃，转速120-200r/min、震荡培养0-108小时。
优选地，进行发酵培养时的条件为：pH范围为6.2，温度范围为30℃，转速180r/min、震荡培养36小时。
本发明提供的菌株HZ20-1能够在适宜产甲壳素酶条件和适宜产甲壳素酶培养基条件下高效产甲壳素酶，在最适生长条件下，所述产甲壳素酶的粗酶酶活至少能够达到30U/mL。
与现有技术相比，本发明的优点及有益效果体现在以下方面：
本发明以芽孢杆菌属细菌HZ20-1用于产胞外分泌型甲壳素酶，通过对菌株HZ20-1的培养条件优化，如对产酶培养基进行优化，无需加入甲壳素酶的诱导物，仅对碳源、氮源进行优化，筛选出最佳的产酶培养条件，以产酶量和酶活作为考察指标，对菌体发酵产酶的工艺条件进行了优化，从而得到了利用菌株HZ20-1产甲壳素酶的最佳工艺条件，进行高效产酶，粗酶酶活至少达到30U/ml。
本发明研究发现现有技术中用于产壳聚糖酶的菌株HZ20-1也可以生成甲壳素酶，甲壳素酶经检测属于组成型酶，非诱导酶，因此，菌株HZ20-1无需底物诱导，也不受外接环境的胁迫，可自主外分泌甲壳素酶，通过菌体的持续扩增达到持续产酶的效果。
基于本发明的方案，利用菌株HZ20-生产甲壳素酶，菌株HZ20-1来源新型，其发酵方法简单，产酶成本较低，应用价值大，对工业化生产甲壳素酶制剂提供了一种新的途径。
附图说明
图1为菌株HZ20-1菌落形态照片。
图2为菌株HZ20-1的16S rDNA测序结果及同源性构建的系统发育树。
图3为不同碳源对菌株HZ20-1发酵产甲壳素酶的影响。
图4为不同氮源对菌株HZ20-1发酵产甲壳素酶的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
以下实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，而不构成对本发明的限制。
实施例1：
菌株(HZ20-1)的分离和鉴定
1.1实验材料
1.1.1菌株来源
菌株分离自海边或河边虾蟹壳排污水井底部的淤泥。
1.1.2培养基
富集培养基：酵母粉1.0g/L、KH2PO4 1.0g/L、MgSO4 0.5g/L、NaCl 5.0g/L、(NH4)2SO4 5.0g/L，pH 6.5。
初筛平板：酵母粉2.0g/L、葡萄糖1.0g/L、KH2PO4 0.3g/L、MgSO4 0.5g/L、NaCl5.0g/L、(NH4)2SO4 10.0g/L，pH 6.5。
斜面保藏培养基：脑心浸粉37g/L、琼脂粉20.0g/L，pH 7.2。
液体种子培养基：蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、NaCl 5.0g/L，pH 6.5。
1.2实验方法
富集：将采集的淤泥样品与无菌生理盐水按质量比1∶10的比例混合，室温振荡30min，使样品与生理盐水充分混匀，静置3h后取上清，按10％(v/v)的接种量接种至富集培养基中，37℃200r/min培养48h。
初筛：将富集液稀释至100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 7个不同梯度，吸取不同稀释梯度的富集液100uL涂布至初筛平板上，37℃倒置培养，并观察不同培养时间平板上菌落的生长情况，培养结束后，用接种环蘸取平板上透明圈相对较大的菌落，划线至空白平板上进行分离纯化，直至同一菌株出现两次单菌落后进行斜面保藏，命名为芽孢杆菌(Bacillus sp)HZ20-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2023172，保藏日期为2023年02月22日，保藏地址是中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
将分离复筛得到的菌株HZ20-1在37℃200r/min培养到16-24h，平板划线，待长出单个菌落后进行形态观察，对菌株进行革兰氏染色并通过显微镜观察。
提取菌株的基因组DNA，交由上海生物工程有限公司测定。用BLAST程序对16SrDNA的测序结果进行相似性比对，使用MEGA7.0软件(Neighbor-Joining法)构建菌株系统发育树。
1.3实验结果
参考图1，菌株HZ20-1形态呈杆状，革兰氏染色阳性，菌落呈浅黄色不透明、菌落无褶皱、中央略微凸起、易挑取、表面无光泽、边缘不规则。
参考图2，基因序列的长度为1442bp，将菌株的16S rDNA基因序列进行相关比对，确定该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)。
该菌株的16S rDNA基因，序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
GGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTT
需要说明的是，菌株HZ20-1在公开号为CN 116286512 A的专利申请中已经公开，在公开号为CN 116286512 A的专利申请中，菌株HZ20-1为一种产壳聚糖酶的芽孢杆菌，其用于产胞外分泌型壳聚糖酶，此外，公开号为CN 116286512 A的专利申请通过对菌体的培养条件优化，如对产酶培养基进行优化，对碳源、氮源、微量元素等进行优化，筛选出最佳的产酶培养条件，以产酶量和酶活作为考察指标，对菌体发酵产酶的工艺条件进行了优化，从而得到了利用芽孢杆菌属细菌产壳聚糖酶的最佳工艺条件，进行高效产酶，酶活可高达60U/mL。但是在公开号为CN 116286512A的专利申请中并没有涉及此菌株HZ20-1是否具有产甲壳素酶的能力。
由于甲壳素化学名为8-(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，也称为聚(N-乙酰基-D-葡糖胺)。甲壳素结构中存在大量的氢键，包括O＝O和N-H基团形成的氢键，C上的OH和环氧之间形成的氢键，以及每个链上的C＝O和相邻糖环上的OH形成的分子间氢键。甲壳素的化学结构与天然纤维素相似，分子中除存在羟基外，还含有乙酰氨基和氨基功能基团，具有比纤维素及其衍生物更广泛的性质。
而壳聚糖化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖，是由甲壳素(chitin)经过脱乙酰作用得到的。可以看出，甲壳素与壳聚糖的结构存在较大差异，用于降解壳聚糖的壳聚糖酶与用于降解甲壳素的甲壳素酶也存在较大的差异。从公开号为CN 116286512A的专利申请中并不能知晓菌株HZ20-1是否能产生甲壳素酶。
实施例2：不同碳源情况下菌株HZ20-1产甲壳素酶的酶活
碳源是构成微生物细胞和代谢产物中碳素来源的营养物质，是菌株生长所必不可少的部分。因此，本实施例验证不同碳源情况下菌株HZ20-1产甲壳素酶的酶活能力。具体步骤如下：
步骤1：菌株活化
从保存菌株HZ20-1的甘油管中取菌种于空白斜面培养基上，于30℃先培养16h，空白斜面培养基为：酵母提取物5.0g/L，蛋白胨10.0g/L和氯化钠5.0g/L，pH 6；接种于含有种子培养基的摇瓶中，在30℃下、100r/min的振荡速率活化培养16h，种子培养基配方为：酵母提取物5.0g/L，蛋白胨10.0g/L和氯化钠5.0g/L，pH 6，得到种子液。
步骤2：发酵培养
种子液按照4％提及百分比接入发酵培养基中，30℃、180r/min发酵培养36h，发酵培养基按照碳源的不同分别为：
发酵培养基(基础)：乳糖2.5g/L，蛋白胨25g/L、Ca2+1mmol/L、K2HPO4 1g/L、酵母粉0.3％(W/V)，pH 6.2。
发酵培养基(蔗糖)：蔗糖2.5g/L、蛋白胨25g/L、Ca2+1mmol/L、K2HPO4 1g/L、酵母粉0.3％(W/V)，pH 6.2。
发酵培养基(麦芽糖)：麦芽糖2.5g/L、蛋白胨25g/L、Ca2+1mmol/L、K2HPO4 1g/L、酵母粉0.3％(W/V)，pH 6.2。
发酵培养基(葡萄糖)：葡萄糖2.5g/L、蛋白胨25g/L、Ca2+1mmol/L、K2HPO4 1g/L、酵母粉0.3％(W/V)，pH 6.2。
发酵培养基(水溶性淀粉)：水溶性淀粉2.5g/L、蛋白胨25g/L、Ca2+1mmol/L、K2HPO41g/L、酵母粉0.3％(W/V)，pH 6.2。
步骤3：发酵培养结束后，离心收集上清液，获得甲壳素酶粗酶液，对甲壳素酶粗酶液进行酶活检测。
将上述制备所得的甲壳素酶粗酶液采用DNS法测定酶活，结果如图3所示，图3中，control表示发酵培养基(基础)，sucrose表示发酵培养基(蔗糖)，malt dust表示发酵培养基(麦芽糖)，glucose表示发酵培养基(葡萄糖)，soluble starch表示发酵培养基(水溶性淀粉)，从图3可以看出，采用发酵培养基(基础)进行发酵培养的甲壳素酶的酶活最高，酶活为29U/mL，产酶量为0.535mg/L。
实施例3：不同氮源情况下菌株HZ20-1产甲壳素酶的酶活
步骤1：菌株活化
从保存菌株HZ20-1的甘油管中取菌种与空白斜面培养基上，于30℃先培养16h，空白斜面培养基为：酵母提取物5.0g/L，蛋白胨10.0g/L和氯化钠5.0g/L，pH 6；接种于含有种子培养基的摇瓶中，在30℃下、100r/min的振荡速率活化培养16h，种子培养基配方为：酵母提取物5.0g/L，蛋白胨10.0g/L和氯化钠5.0g/L，pH 6，得到种子液。
步骤2：发酵培养
种子液按照4％体积百分比接入发酵培养基中，30℃、180r/min发酵培养36h，发酵培养基按照氮源的不同分别为：
发酵培养基(基础)：乳糖2.5g/L、蛋白胨25g/L、Ca2+1mmol/L、K2HPO4 1g/L、酵母粉0.3％(W/V)，pH 6.2。
发酵培养基(尿素)：乳糖2.5g/L、尿素25g/L、Ca2+1mmol/L、K2HPO4 1g/L、酵母粉0.3％(W/V)，pH 6.2。
发酵培养基(酵母粉)：乳糖2.5g/L、酵母粉25g/L、Ca2+1mmol/L、K2HPO4 1g/L、酵母粉0.3％(W/V)，pH 6.2。
发酵培养基(花生饼粉)：乳糖2.5g/L、花生饼粉25g/L、Ca2+1mmol/L、K2HPO4 1g/L、酵母粉0.3％(W/V)，pH 6.2。
发酵培养基(黄豆饼粉)：乳糖2.5g/L、黄豆饼粉25g/L、Ca2+1mmol/L、K2HPO4 1g/L、酵母粉0.3％(W/V)，pH 6.2。
发酵培养基(麸皮)：乳糖2.5g/L、麸皮25g/L、Ca2+1mmol/L、K2HPO4 1g/L、酵母粉0.3％(W/V)，pH 6.2。
发酵培养基(牛肉膏)：乳糖2.5g/L、牛肉膏25g/L、Ca2+1mmol/L、K2HPO4 1g/L、酵母粉0.3％(W/V)，pH 6.2。
将上述制备所得的甲壳素酶粗酶液采用DNS法测定酶活，结果如图4所示，图4中，Based表示发酵培养基(基础)，Urea表示发酵培养基(尿素)，Springer yeast表述发酵培养基(酵母粉)，Peanut cake powder表示发酵培养基(花生饼粉)，Bean cake powder表示发酵培养基(黄豆饼粉)，Bran表示发酵培养基(麸皮)，Beef paste表示发酵培养基(牛肉膏)，从图4可以看出，其中采用发酵培养基(花生饼粉)进行发酵培养的甲壳素酶的酶活最高，酶活可达30U/mL，产酶量为0.605mg/L。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法，其特征在于，所述菌株HZ20-1在发酵培养基中进行发酵培养，以得到甲壳素酶；所述菌株HZ20-1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2023172，保藏日期为2023年02月22日，保藏地址是中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
2.根据权利要求1所述的一种利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法，其特征在于，利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法，步骤为：
取菌株HZ20-1接入种子培养基活化培养，得到活化后的菌液；
将活化后的菌液按2％-10％的接种量接入发酵培养基中进行发酵培养，以得到甲壳素酶。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基中的碳源选自乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖或水溶性淀粉中的一种。
4.根据权利要求3所述的一种利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基中的碳源选自乳糖或麦芽糖。
5.根据权利要求1或2所述的一种利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基中的氮源选自硫酸铵、蛋白胨、尿素、玉米浆、酵母粉、花生饼粉、黄豆饼粉、麸皮或牛肉膏中的一种。
6.根据权利要求5所述的一种利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基中的氮源选自硫酸铵、花生饼粉或蛋白胨。
7.根据权利要求1所述的一种利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：碳源2-5g/L、氮源20-30g/L、pH 6.0-6.5。
8.根据权利要求7所述的一种利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：乳糖2.5g/L、花生饼粉25g/L、Ca2+1mmol/L、K2HPO4 1g/L、酵母粉0.3％(W/V)、pH 6.2。
9.根据权利要求1所述的一种利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法，其特征在于，进行发酵培养时的条件为：pH范围为4.0-10.0，温度范围为28-42℃，转速120-200r/min、震荡培养0-108小时。
10.根据权利要求9所述的一种利用菌株HZ20-1生产甲壳素酶的方法，其特征在于，进行发酵培养时的条件为：pH范围为6.2，温度范围为30℃，转速180r/min、震荡培养36小时。
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