JPS60176582A - 海苔のプロトプラストの調製法 - Google Patents
海苔のプロトプラストの調製法Info
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- JPS60176582A JPS60176582A JP59030892A JP3089284A JPS60176582A JP S60176582 A JPS60176582 A JP S60176582A JP 59030892 A JP59030892 A JP 59030892A JP 3089284 A JP3089284 A JP 3089284A JP S60176582 A JPS60176582 A JP S60176582A
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- seaweed
- hydrolase
- plant
- polysaccharides
- enzyme solution
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は海苔の健全なプロトプラストを調製する方法、
更に詳しくは、細胞融合に有効に適用し得る海苔のプロ
トプラストをＩＪｉｌ製する方法に関する。
更に詳しくは、細胞融合に有効に適用し得る海苔のプロ
トプラストをＩＪｉｌ製する方法に関する。
近年、遺伝子工学的手法とし−で異種生物体の細胞間の
融合、いわゆる細胞融合についての研究が各方面で活発
に行なわれるようになり、陸」二植物については既に実
用化の段階にまで成功したものもみられるようになった
。
融合、いわゆる細胞融合についての研究が各方面で活発
に行なわれるようになり、陸」二植物については既に実
用化の段階にまで成功したものもみられるようになった
。
しかしながら、海藻類、特にアマノリ類に関しては、そ
の細胞壁を構成している多ｔｍ類が陸上植物における多
糖類（主としてセルロース）と異なり、主としてキシラ
ン、及びマンナンのような難消化性の多糖類であるため
、酵素処理によるプロトプラスト化が困難と考えられて
いた。
の細胞壁を構成している多ｔｍ類が陸上植物における多
糖類（主としてセルロース）と異なり、主としてキシラ
ン、及びマンナンのような難消化性の多糖類であるため
、酵素処理によるプロトプラスト化が困難と考えられて
いた。
因に、Ｐｒｅｓ ｔｏｎ等の報告によると、海苔の表層
にマンナンが顆粒状に存在しており、海苔の細胞壁はミ
クロフィブリル形態のキシランから構成されており、細
胞充間物質としてボルフイランが存在しているとされる
。また、Ｌ、Ａ、Ｈａｎｉｃ等によると、海苔の表層に
は蛋白質から成る薄い被覆が存在しているとされる。
にマンナンが顆粒状に存在しており、海苔の細胞壁はミ
クロフィブリル形態のキシランから構成されており、細
胞充間物質としてボルフイランが存在しているとされる
。また、Ｌ、Ａ、Ｈａｎｉｃ等によると、海苔の表層に
は蛋白質から成る薄い被覆が存在しているとされる。
上述したような海苔特有の組織に鑑み、海苔はその組織
を物理的に切断しないとプロトプラスト化ができないと
の観点から、近年、海苔葉体を物理的手段で切断して得
られる葉片にシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
） ＳＰの菌株（Ｐ−１株）の培養液から得た粗酵素
液を約４時間程度作用させてプロトプラストを調製する
方法が提案されている。
を物理的に切断しないとプロトプラスト化ができないと
の観点から、近年、海苔葉体を物理的手段で切断して得
られる葉片にシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
） ＳＰの菌株（Ｐ−１株）の培養液から得た粗酵素
液を約４時間程度作用させてプロトプラストを調製する
方法が提案されている。
（日本水産学会、昭和５７年秋季講演要旨集、藤田等［
酵素処理によるノリ、チオノリ類のプロトプラストの分
離とその発生」第２３頁、２１３）。
酵素処理によるノリ、チオノリ類のプロトプラストの分
離とその発生」第２３頁、２１３）。
しかし、この方法ではプロトプラストを得るための酵素
処理に長時間を要し、しかも海苔を物理的に切断したも
のに酵素を作用させるので得られるプロトプラス１−が
不健全になる可能性が高く、したがってこのプロトプラ
ストを用いての細胞融合に支障をきたすおそれがある。
処理に長時間を要し、しかも海苔を物理的に切断したも
のに酵素を作用させるので得られるプロトプラス１−が
不健全になる可能性が高く、したがってこのプロトプラ
ストを用いての細胞融合に支障をきたすおそれがある。
蓋し、細胞融合の手法においてはそれに用いるプロトプ
ラストの健全度が非常に主要な要因であって、プロトプ
ラストが不健全であると細胞融合に当っての融合率が低
くなって以後の培養による生育も劣るようになると考え
られるからである。
ラストの健全度が非常に主要な要因であって、プロトプ
ラストが不健全であると細胞融合に当っての融合率が低
くなって以後の培養による生育も劣るようになると考え
られるからである。
また、」１記方法で海苔葉体を切断するには、シュード
モナスｓｐ菌株が生産する酵素が海苔の表Ｔ一部分には
作用せずに切断部分から作用して海苔の細胞壁を崩壊し
てプロトプラストとなるとの認識に基づいているものと
考えられる。
モナスｓｐ菌株が生産する酵素が海苔の表Ｔ一部分には
作用せずに切断部分から作用して海苔の細胞壁を崩壊し
てプロトプラストとなるとの認識に基づいているものと
考えられる。
本発明者は、上述したような現状に捲み、細胞融合に適
した海苔の健全なプロトプラストを得るには、海苔を物
理的に切断することなくその表層から崩壊させるごとが
必要であるとの見地から海苔のプロトプラスト化につい
て検削した結果、さきに海苔を少なくともマンナン加水
分解酵素およびキシラン加水分解酵素を含有する酵素液
で処理するか、更にはポルフィラン加水分解酵素も含有
する酵素液で処理することにより、海苔のプロトプラス
トを健全な状態で調製し得ることの知見を得て、海苔の
プロトプラストを調製する方法に係る発明をなした。（
特願昭５８−１４９３７８号）。
した海苔の健全なプロトプラストを得るには、海苔を物
理的に切断することなくその表層から崩壊させるごとが
必要であるとの見地から海苔のプロトプラスト化につい
て検削した結果、さきに海苔を少なくともマンナン加水
分解酵素およびキシラン加水分解酵素を含有する酵素液
で処理するか、更にはポルフィラン加水分解酵素も含有
する酵素液で処理することにより、海苔のプロトプラス
トを健全な状態で調製し得ることの知見を得て、海苔の
プロトプラストを調製する方法に係る発明をなした。（
特願昭５８−１４９３７８号）。
すなわち、上記発明に係る方法は、海苔葉体を、シュー
ドモナス属に属する難消化性多糖類の加水分解能を有す
る微生物を、海苔もしくは海苔由来の多糖類を誘導物質
として含む培地中で培養して得られる少なくともマンナ
ン加水分解酵素とキシラン加水分解酵素を含有する酵素
液で処理することを特徴とする。
ドモナス属に属する難消化性多糖類の加水分解能を有す
る微生物を、海苔もしくは海苔由来の多糖類を誘導物質
として含む培地中で培養して得られる少なくともマンナ
ン加水分解酵素とキシラン加水分解酵素を含有する酵素
液で処理することを特徴とする。
而して、本発明者は、その後の研究の結果、上記微生物
を、海苔もしくは海苔由来の多糖類に代えて、海苔の構
造多糖類の構成単位であるβ−１，３キシロシド結合及
びβ−１，４マンノシド結合を有する多糖類を構造多糖
類成分として含有する植物体もしくは該植物体由来の多
糖類を誘導物質として含む培地中で培養して得られる培
養液から調製される少くともマンナン加水分解酵素と牛
シラン加水分解酵素を含有する酵素液で海苔葉体を処理
することによっても海苔のプロトプラスト化が有効に行
ない得ることの知見を得て本発明をなすに至った。
を、海苔もしくは海苔由来の多糖類に代えて、海苔の構
造多糖類の構成単位であるβ−１，３キシロシド結合及
びβ−１，４マンノシド結合を有する多糖類を構造多糖
類成分として含有する植物体もしくは該植物体由来の多
糖類を誘導物質として含む培地中で培養して得られる培
養液から調製される少くともマンナン加水分解酵素と牛
シラン加水分解酵素を含有する酵素液で海苔葉体を処理
することによっても海苔のプロトプラスト化が有効に行
ない得ることの知見を得て本発明をなすに至った。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明の構成上の主要な特徴は、シュードモナス属（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）に属する難消化性多糖類の加
水分解能を有する微生物を、β−１，３キシロシド結合
及びβ−１，４マンノシド結合を有する多糖類を構造多
糖類成分として含有する植物体（ただし、海苔葉体を除
く）もしくは該植物体由来の、ト記多糖類を誘導物質と
して含む培地中で培養して得られる培養液から調製した
少くともキシラン加水分解酵素とマンナン加水分解酵素
とを含有する酵素液で、海苔葉体を処理することにある
。
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）に属する難消化性多糖類の加
水分解能を有する微生物を、β−１，３キシロシド結合
及びβ−１，４マンノシド結合を有する多糖類を構造多
糖類成分として含有する植物体（ただし、海苔葉体を除
く）もしくは該植物体由来の、ト記多糖類を誘導物質と
して含む培地中で培養して得られる培養液から調製した
少くともキシラン加水分解酵素とマンナン加水分解酵素
とを含有する酵素液で、海苔葉体を処理することにある
。
なお、本発明のその他の構成は以下の説明から明らかに
なるてあらう。
なるてあらう。
本発明において、海苔のプロトプラストいる酵素液の調
製に利用される難消化性多糖類の加水分解能を有する微
生物は海水中から分離されたシュードモナス属（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ）に属するものであって、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ ＰＴ−５の表示で微工研条寄第
３３０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３０）の受託番号で工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
製に利用される難消化性多糖類の加水分解能を有する微
生物は海水中から分離されたシュードモナス属（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ）に属するものであって、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ ＰＴ−５の表示で微工研条寄第
３３０号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３０）の受託番号で工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。
なお、上記微生物は、上記難消化性多糖類であるキシラ
ン、マンナン及びポルフィランの加水分解能を有し、下
記に示す菌学的性質を有する。
ン、マンナン及びポルフィランの加水分解能を有し、下
記に示す菌学的性質を有する。
菌学的性質：
ｉ）形態
ＺｏＢＥＬＬ ２２１６Ｅ培地に生育した細胞について
、（イ）細胞の形態は桿菌で大きさは０．５〜１μｍ×
１．５〜２．５μｍ （口）運動性を有し、鞭毛は単極毛性 （ハ）ダラム染色性は陰性 ｉｉ）生育状態 ７、ｏＲＥＬＬ ２２１．６［ｉ斜面培地における生育
状態、（イ）２０〜２７°Ｃの温度で良好に生育する（
口）淡黄色の色素を沈着 （ハ）毛状（ｆｉｌｉｆｏｒｍ）の簗落を形成１１１）
生理学的性質 （イ）カタラーゼテスト １揚者生 （口）オキシダーセテスト 陽性 （ハ）グルコースよ・りの酸のη；成陽性（二）Ｏ−Ｆ
テスト０ （ｌｌｕｇｈ １．ｅｉｆｓｏｎ法による）（ホ） Ｖ
ｉｈｒｏ−Ｓｔａｔｉｃ Ａｇｅｎｔ （ ０／１２９
）陰性（へ）寒天液化能 ＋ （ト）キシラン分解能 十 （チ）マンナン分解能 ＋ （す）好気性 本発明では上記微生物を、β−１，３キシロシド結合及
びβ−１，４マンノシド結合を有する他を構造多糖類成
分として含有する植物体（ただし、海苔を除＜）、例え
ばイワツダ（海藻の１種）、ハ不モ、号ボテングサ、コ
ンニャク、イチョウイモ、コーヒー豆、ラン科植物等の
植物体、もしくは該植物体由来の多糖類を誘導物質とし
て含む培地中で培養してマンナン加水分解酵素とキシラ
ン加水分解酵素、更にはボルフイラン加水分解酵素を培
地中に生産させる。
、（イ）細胞の形態は桿菌で大きさは０．５〜１μｍ×
１．５〜２．５μｍ （口）運動性を有し、鞭毛は単極毛性 （ハ）ダラム染色性は陰性 ｉｉ）生育状態 ７、ｏＲＥＬＬ ２２１．６［ｉ斜面培地における生育
状態、（イ）２０〜２７°Ｃの温度で良好に生育する（
口）淡黄色の色素を沈着 （ハ）毛状（ｆｉｌｉｆｏｒｍ）の簗落を形成１１１）
生理学的性質 （イ）カタラーゼテスト １揚者生 （口）オキシダーセテスト 陽性 （ハ）グルコースよ・りの酸のη；成陽性（二）Ｏ−Ｆ
テスト０ （ｌｌｕｇｈ １．ｅｉｆｓｏｎ法による）（ホ） Ｖ
ｉｈｒｏ−Ｓｔａｔｉｃ Ａｇｅｎｔ （ ０／１２９
）陰性（へ）寒天液化能 ＋ （ト）キシラン分解能 十 （チ）マンナン分解能 ＋ （す）好気性 本発明では上記微生物を、β−１，３キシロシド結合及
びβ−１，４マンノシド結合を有する他を構造多糖類成
分として含有する植物体（ただし、海苔を除＜）、例え
ばイワツダ（海藻の１種）、ハ不モ、号ボテングサ、コ
ンニャク、イチョウイモ、コーヒー豆、ラン科植物等の
植物体、もしくは該植物体由来の多糖類を誘導物質とし
て含む培地中で培養してマンナン加水分解酵素とキシラ
ン加水分解酵素、更にはボルフイラン加水分解酵素を培
地中に生産させる。
因に、海苔葉体の多糖類は主としてキシランとマンナン
から構成されており、これら多糖類の結合様式及び組成
単糖を、過ヨウ素酸酸化法及び加水分解物についての液
体クロマトグラフィ分析で調べた結果、キシランはβ−
１，３結合のキシロースのモノポリマーであり、マンナ
ンはβ−１，４結合のマンノースのモノポリマーである
ことが確認されたが、本発明で培地中に誘導物質として
含有させる上記植物体の多糖類及び該植物体由来の多糖
類は、必ずしもβ−１，３キシロシド結合のキシロ一ス
のモノポリマー及びβ−１，４結合のマンノースのモノ
ポリマーである必要はなく、β−１，３キシロシド結合
及びβ−１，４マンノシド結合を一部含有している三糖
類以上のものがあれば使用可部である。
から構成されており、これら多糖類の結合様式及び組成
単糖を、過ヨウ素酸酸化法及び加水分解物についての液
体クロマトグラフィ分析で調べた結果、キシランはβ−
１，３結合のキシロースのモノポリマーであり、マンナ
ンはβ−１，４結合のマンノースのモノポリマーである
ことが確認されたが、本発明で培地中に誘導物質として
含有させる上記植物体の多糖類及び該植物体由来の多糖
類は、必ずしもβ−１，３キシロシド結合のキシロ一ス
のモノポリマー及びβ−１，４結合のマンノースのモノ
ポリマーである必要はなく、β−１，３キシロシド結合
及びβ−１，４マンノシド結合を一部含有している三糖
類以上のものがあれば使用可部である。
なお、本発明で用いる上記“植物体由来の多糖類”とは
、上述したごときβ−１，３キシロシド結合及びβ−１
，４マンノシド結合を有する多糖類を含有する植物体を
熱水抽出して可溶性成分を除去してｉ尋られる、主とし
て多糖類から成る残渣、又は該残渣を更に精製処理して
多糖類含量を高めたものを意味する。
、上述したごときβ−１，３キシロシド結合及びβ−１
，４マンノシド結合を有する多糖類を含有する植物体を
熱水抽出して可溶性成分を除去してｉ尋られる、主とし
て多糖類から成る残渣、又は該残渣を更に精製処理して
多糖類含量を高めたものを意味する。
例えば、上記植物体を１０倍量の水に浸漬し、オートク
レーブ中で１２０℃で３０分間加熱したのち、濾布を用
いて可溶性区分を除去し、得られる残渣について、上記
と同様の手順で加熱して可溶性区分を除去する操作を繰
返し行ない（５回程度）、ついで得られる残渣を１００
％エタノールに浸漬し、室温にて一夜放置したのち、可
溶性区分を除去し、乾燥したものを多糖類から成る残渣
として用いるか、又は、上記加熱と可溶性区分の除去を
繰返し行なって得られる残渣（エタノール浸漬を行なっ
ていないもの）をｌＮ−Ｎａ０ｌｌ熔液に浸漬し、室温
にて一夜放置したのち、可溶性区分を除去した残ｌＨを
Ｎａ０ＩＩの２０％熱水溶液で抽出し、得られる抽出液
を遠心分離し、その上澄み液にフェーリング溶液を加え
て沈澱を生成させ、この沈澱物を水洗してＣｏイオンを
除去して得られる多１！ＩＪＩ（β−１，４マンノシド
結合を有する）もしくは上記フェーリング溶液を加えて
沈澱を生成させたときの上澄液にＨＣＩ を加えてｐＨ
を３に調整して得られる沈澱物から成る多糖類（β−１
，３キシロシド結合を有する）をそれぞれ精製処理した
多糖類として用いる。
レーブ中で１２０℃で３０分間加熱したのち、濾布を用
いて可溶性区分を除去し、得られる残渣について、上記
と同様の手順で加熱して可溶性区分を除去する操作を繰
返し行ない（５回程度）、ついで得られる残渣を１００
％エタノールに浸漬し、室温にて一夜放置したのち、可
溶性区分を除去し、乾燥したものを多糖類から成る残渣
として用いるか、又は、上記加熱と可溶性区分の除去を
繰返し行なって得られる残渣（エタノール浸漬を行なっ
ていないもの）をｌＮ−Ｎａ０ｌｌ熔液に浸漬し、室温
にて一夜放置したのち、可溶性区分を除去した残ｌＨを
Ｎａ０ＩＩの２０％熱水溶液で抽出し、得られる抽出液
を遠心分離し、その上澄み液にフェーリング溶液を加え
て沈澱を生成させ、この沈澱物を水洗してＣｏイオンを
除去して得られる多１！ＩＪＩ（β−１，４マンノシド
結合を有する）もしくは上記フェーリング溶液を加えて
沈澱を生成させたときの上澄液にＨＣＩ を加えてｐＨ
を３に調整して得られる沈澱物から成る多糖類（β−１
，３キシロシド結合を有する）をそれぞれ精製処理した
多糖類として用いる。
前記誘導物質としての植物体もしくは植物体由来の多糖
類の培地に対する添加量は１〜２重呈％が適当である。
類の培地に対する添加量は１〜２重呈％が適当である。
次に、本発明で利用する上記微生物の培養に用いる培地
は、炭素源として上記誘導物質を、窒素源としてペプト
ンおよび酵母エキスを、更には無機質としてに２ Ｉｔ
Ｐ Ｏ＋、ＦｅＣｌ３などを海水又は人工海水に溶解
し、緩衝液（例えばトリスバッファ〜）でｐｌ＋を７．
５前後に調整したものが好ましい。培地組成を例示する
と下記のとおりである。
は、炭素源として上記誘導物質を、窒素源としてペプト
ンおよび酵母エキスを、更には無機質としてに２ Ｉｔ
Ｐ Ｏ＋、ＦｅＣｌ３などを海水又は人工海水に溶解
し、緩衝液（例えばトリスバッファ〜）でｐｌ＋を７．
５前後に調整したものが好ましい。培地組成を例示する
と下記のとおりである。
培地組成：
上記植物又は該植物由来の多糖類 １．０ （重量％）
ペプトン １．０ 酵母エキス ｏ、１ Ｋ２１１ＰＯ＋ ０．０１ ＦｅＣ１３０，６ｍｇ／ ７！ トリス緩衝液 ０．１（重量％） 上記割合で海水に熔解してｐＨを７．５に調整する。
ペプトン １．０ 酵母エキス ｏ、１ Ｋ２１１ＰＯ＋ ０．０１ ＦｅＣ１３０，６ｍｇ／ ７！ トリス緩衝液 ０．１（重量％） 上記割合で海水に熔解してｐＨを７．５に調整する。
本発明で利用する上記微生物の上記培地における培養条
件は、２５℃の温度で４日間通気、攪拌通気下（通気ｆ
ｆ１１０００〜２０００ ｍ ｌｔ ／ｍｉｎ 、攪拌
数１ｏＯ〜３００ｒ、ｐ、ｍ、 ）に行う。
件は、２５℃の温度で４日間通気、攪拌通気下（通気ｆ
ｆ１１０００〜２０００ ｍ ｌｔ ／ｍｉｎ 、攪拌
数１ｏＯ〜３００ｒ、ｐ、ｍ、 ）に行う。
上述のようにして培養して得られた培養液から酵素液を
調製するには、該培養液を４°Ｃの温度で３０分間遠心
分離（１０，０００ｒ、ｐ、ｍ、） シ、その上澄液を
酵素液とする。
調製するには、該培養液を４°Ｃの温度で３０分間遠心
分離（１０，０００ｒ、ｐ、ｍ、） シ、その上澄液を
酵素液とする。
このようにして得られる酵素液はマンナン加水分解酵素
、キシラン加水分解酵素およびボルフイラン加水分解酵
素を含有する。
、キシラン加水分解酵素およびボルフイラン加水分解酵
素を含有する。
本発明では上記培養に当たり、上記植物由来の多糖類と
して主にマンナンもしくはキシランから成るものを誘導
物質として培地に含有させて主としてマンナン加水分解
酵素もしくはキシラン加水分解酵素をそれぞれ培地中に
生産させ、得られる培養液からこれらの各酵素を主とし
て含む酵素液を調製し、両者の酵素液を組合せて海苔葉
体のプロトプラスト化に用いることも可能である。
して主にマンナンもしくはキシランから成るものを誘導
物質として培地に含有させて主としてマンナン加水分解
酵素もしくはキシラン加水分解酵素をそれぞれ培地中に
生産させ、得られる培養液からこれらの各酵素を主とし
て含む酵素液を調製し、両者の酵素液を組合せて海苔葉
体のプロトプラスト化に用いることも可能である。
なお、本発明で海苔葉体のプロトプラスト化にマンナン
加水分解酵素とキシラン加水分解酵素を主に用いるのは
、前者が海苔の表層に存在する顆粒状のマンナンに作用
して葉体に大きく切断部を形成して細胞壁を形成してい
るミクロフィブリル形態のキシランに対する後者の作用
をし易くすることに基づくものであり、したがって、キ
シラン加水分解酵素が海苔葉体のプロトプラスト化に最
も重要な作用をしているものと言える。なお、ボルフイ
ラン加水分解酵素は海苔葉体の細胞光間物質としてのボ
ルフイランに作用して分解するので該酵素を含む酵素液
を用いるとプロトプラスト化が−そう促進される。
加水分解酵素とキシラン加水分解酵素を主に用いるのは
、前者が海苔の表層に存在する顆粒状のマンナンに作用
して葉体に大きく切断部を形成して細胞壁を形成してい
るミクロフィブリル形態のキシランに対する後者の作用
をし易くすることに基づくものであり、したがって、キ
シラン加水分解酵素が海苔葉体のプロトプラスト化に最
も重要な作用をしているものと言える。なお、ボルフイ
ラン加水分解酵素は海苔葉体の細胞光間物質としてのボ
ルフイランに作用して分解するので該酵素を含む酵素液
を用いるとプロトプラスト化が−そう促進される。
海苔葉体に作用させる１−記酵素液の量は、海苔葉体を
５ｃｍ程度のもの４〜５枚に対し、上記酵素液を５〜１
０倍に濃縮したものの１０ｍ１！程度が適当であり、３
〜４時間の作用で海苔のプロ１−プラストを１ｌＩｉｌ
製し得る。
５ｃｍ程度のもの４〜５枚に対し、上記酵素液を５〜１
０倍に濃縮したものの１０ｍ１！程度が適当であり、３
〜４時間の作用で海苔のプロ１−プラストを１ｌＩｉｌ
製し得る。
また、本発明では海苔葉体に上記酵素液を作用させるに
当って、該葉体にプロテアーゼを作用させると〆毎苔の
表層を被覆している蛋白質の薄い層を分解し得るのでブ
■：Ｉドプラストを調製するうえで一層効果的であイ〕
。プロテアーゼとしてはパパインが特に好ましく、１０
％のパパイン１１νとして葉体に１５〜３０分程度作用
させると上記蛋白質の薄層を有効に分解、除去しｉ′４
る。
当って、該葉体にプロテアーゼを作用させると〆毎苔の
表層を被覆している蛋白質の薄い層を分解し得るのでブ
■：Ｉドプラストを調製するうえで一層効果的であイ〕
。プロテアーゼとしてはパパインが特に好ましく、１０
％のパパイン１１νとして葉体に１５〜３０分程度作用
させると上記蛋白質の薄層を有効に分解、除去しｉ′４
る。
なお、プロテアーゼの海苔葉体に対する作用は、上記プ
ロトプラスト化のための酵素液による処理に先立って行
ってもよく、又、該酵素液による処理と平行的に行って
もよい。
ロトプラスト化のための酵素液による処理に先立って行
ってもよく、又、該酵素液による処理と平行的に行って
もよい。
上述のようにして得られる海苔のプロトプラストは海苔
を物理的に切断することなく、酵素処理によってのみ８
７４％されるものであるから健全な状態であって、細胞
融合に利用するのに適している。
を物理的に切断することなく、酵素処理によってのみ８
７４％されるものであるから健全な状態であって、細胞
融合に利用するのに適している。
例えば、本発明の方法で開裂された海苔のプロトプラス
トをペトリ皿内で人工海水（藻類用Ａｓｐ。
トをペトリ皿内で人工海水（藻類用Ａｓｐ。
１２）に懸濁させ、ベトリ皿の底部に着生したプロトプ
ラストの生育状況を観察した結果によると生育状況は非
常に良好である。
ラストの生育状況を観察した結果によると生育状況は非
常に良好である。
叙上のように、本発明によると、海苔のプロトプラスト
が酵素的処理のみで健全な状態で得られるので、今後の
海苔の細胞融合技術の進展に益するものと言える。
が酵素的処理のみで健全な状態で得られるので、今後の
海苔の細胞融合技術の進展に益するものと言える。
以下に実施例を示して本発明を更ζこ具体的に説明する
。
。
実施例１
陪」１＠稠−整
ペプトン １．０（重量％）
酵母エキス ０．１ （＝ ）
ＫｄｌＰＯ＋ ０．０１ （〃）
ＦｅＣＩＢ ０．６ ｍｇ／ １１
トリス緩衝液 ０．１（重量％）
（トリスアミノメタン）
イワツダ（海藻の１種）の熱水 １．０（重量％）抽出
残渣 上記組成のものを海水に添加してｐＨ７，５に調整した
ものを培地に用いた。
残渣 上記組成のものを海水に添加してｐＨ７，５に調整した
ものを培地に用いた。
酸１羞少量製
上記培地にシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
） ＳＰ微工研条寄ＮａＢＰ−３３０を接種し、３００
ｒ、ｐ、ｍ。
） ＳＰ微工研条寄ＮａＢＰ−３３０を接種し、３００
ｒ、ｐ、ｍ。
の攪拌下に通気しながら（通気量２０００ｍ ｌ ／
ｍｉｎ ）２５℃で４日間培養を行った。
ｍｉｎ ）２５℃で４日間培養を行った。
得られた培＃液を４℃の温度で３０分間遠心分離（１０
，００Ｏｒ、ｐ、ｍ、） Ｌ、その−上澄液を１０倍に
濃縮して酵素液とした。
，００Ｏｒ、ｐ、ｍ、） Ｌ、その−上澄液を１０倍に
濃縮して酵素液とした。
このようにして調＆Ｊした酵素液のゲＷ消化性多糖頻に
対する酵素活性を調べた結果は、下記表に示すとおりで
ある。
対する酵素活性を調べた結果は、下記表に示すとおりで
ある。
（注） ＋ 十＋−−−−−−−−活性が非常に強い＋
→−−−−−一活性が強い ＋−−−−−−−−ｍ−活性が稍々強い表にみられるよ
うに本発明で用いる酵素液はマンナン及びキシランに対
する活性が優れている。
→−−−−−一活性が強い ＋−−−−−−−−ｍ−活性が稍々強い表にみられるよ
うに本発明で用いる酵素液はマンナン及びキシランに対
する活性が優れている。
プＰ」で醪しくＬΔ戚裂
海苔葉体を５ｃｍ程度のもの４〜５枚を１７型試験管に
入れ、これを上記酵素液］Ｏｎｌを加えて海苔葉体を該
酵素液に？′Ｊ：消しながら、２０°Ｃの温度で七ノー
型振盪器を用いて４時間振盪（７０ストロ一ク／分）さ
せて海苔のプロトプラストを得た。
入れ、これを上記酵素液］Ｏｎｌを加えて海苔葉体を該
酵素液に？′Ｊ：消しながら、２０°Ｃの温度で七ノー
型振盪器を用いて４時間振盪（７０ストロ一ク／分）さ
せて海苔のプロトプラストを得た。
実施例２
本例は海苔葉体のプロトプラスト化に当って該葉体にパ
パインを作用させた例を示したものである。なお、パパ
インを葉体に作用させるほかは、実施例１と同様な手順
でプロトプラストの調製を行った。
パインを作用させた例を示したものである。なお、パパ
インを葉体に作用させるほかは、実施例１と同様な手順
でプロトプラストの調製を行った。
ベバエノ員書玉臭狸
■−型試験管に５ｃｍ程度の海苔葉体の４〜５枚を収容
し、これにパパイン溶液（酢酸塩バッファーに溶解して
ｐＨ６，０にしたもの）１０ｍρを添加して海苔葉体を
該パパイン溶液に浸漬しながら、２５℃の温度で２０分
間振盪（モノー型振盪器７０ストローク／分）させた。
し、これにパパイン溶液（酢酸塩バッファーに溶解して
ｐＨ６，０にしたもの）１０ｍρを添加して海苔葉体を
該パパイン溶液に浸漬しながら、２５℃の温度で２０分
間振盪（モノー型振盪器７０ストローク／分）させた。
フ１１プラストの罷
一ヒ述のようにしてパパインを作用させた海苔葉体を、
実施例１に記載した手順に従って酵素液で６０分間処理
してプロトプラストを調製した。
実施例１に記載した手順に従って酵素液で６０分間処理
してプロトプラストを調製した。
出願人 小漫商事株式会社
代理人 宮 １） 広 豊
Claims (9)
- （１） シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）に属する難消化性多糖類の加水分解能を有する微生物
を、β−１，３キシロシド結合及びβ−１，４マンノシ
ド結合を有する多糖類を構造多糖類成分として含有する
植物体（ただし、海苔葉体を除く）もしくは該植物体由
来の上記多糖類を誘導物質として含む培地中で培養して
得られる培養液から調製した少くともキシラン加水分解
酵素とマンナン加水分解酵素とを含有する酵素液で、海
苔葉体を処理することを特徴とする海苔のプロトプラス
トの調製法。 - （２）海苔葉体をプロテアーゼで処理した後、シュード
モナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）に属する難消化
性多糖類の加水分解能を有する微生物を、β−１，３キ
シロシド結合及びβ−Ｌ４マンノシド結合を有する多糖
類を構造多糖類成分として含有する植物体（ただし、海
苔葉体を除く）もしくは該植物体由来の上記多糖類を誘
導物質として含む培地中で培養して得られる培養液から
調製した少くともキシラン加水分解酵素とマンナン加水
分解酵素とを含有する酵素液で、上記海苔葉体を処理す
ることを特徴とする海苔のプロトプラストを調製する方
法。 - （３） シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）に属する難消化性多糖類の加水分解能を有する微生物
を、β−１，３キシロシド結合及びβ−１，４マンノシ
ド結合を有する多糖類を構造多糖類成分として含有する
植物体（ただし、海苔葉体を除く）もしくは該植物体由
来の上記多糖類を誘導物質として含む培地中で培養して
得られる培養液から調製した少くともキシラン加水分解
酵素とマンナン加水分解酵素及びプロテアーゼとを含有
する酵素液で、海苔葉体を処理することを特徴とする海
苔のプロトプラストを調製する方法。 - （４）上記植物体由来の多糖類は該植物体を熱水抽出し
て得られる多糖類含有残渣である特許請求の範囲第（１
）項乃至第（３）項のいずれかに記載の方法。 - （５）上記植物体由来の多糖類は該植物体を熱水抽出し
て得られる残渣を精製処理したものである特許請求の範
囲第ｆｉ１項乃至第（３）項のいずれかに記載の方法。 - （６）酵素液はポルフィラン加水分解酵素も含有するも
のである特許請求の範囲第ｉ１１項乃至第（３）項のい
ずれかに記載の方法。 - （７）酵素液はマンナン加水分解酵素を含有する酵素液
とキシラン加水分解酵素を含有する酵素液とを組合せた
ものである特許請求の範囲第（１）項乃至第（３）項の
いずれかに記載の方法。 - （８）培地は窒素源としてペプトンおよび酵母エキスを
含有するものである特許請求の範囲第（１）項乃至第（
３）項のいずれかに記載の方法。 - （９）プロテアーゼがパパインである特許請求の範囲第
（２）項又は第（３）項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59030892A JPS60176582A (ja) | 1984-02-21 | 1984-02-21 | 海苔のプロトプラストの調製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59030892A JPS60176582A (ja) | 1984-02-21 | 1984-02-21 | 海苔のプロトプラストの調製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60176582A true JPS60176582A (ja) | 1985-09-10 |
| JPH0353909B2 JPH0353909B2 (ja) | 1991-08-16 |
Family
ID=12316373
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59030892A Granted JPS60176582A (ja) | 1984-02-21 | 1984-02-21 | 海苔のプロトプラストの調製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60176582A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999029160A1 (en) * | 1997-12-12 | 1999-06-17 | Northeastern University | STRAIN MANIPULATION AND IMPROVEMENT IN THE EDIBLE SEAWEED $i(PORPHYRA) |
| CN105754927A (zh) * | 2016-03-22 | 2016-07-13 | 中国海洋大学 | 缢江蓠原生质体的制备方法 |
-
1984
- 1984-02-21 JP JP59030892A patent/JPS60176582A/ja active Granted
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999029160A1 (en) * | 1997-12-12 | 1999-06-17 | Northeastern University | STRAIN MANIPULATION AND IMPROVEMENT IN THE EDIBLE SEAWEED $i(PORPHYRA) |
| CN105754927A (zh) * | 2016-03-22 | 2016-07-13 | 中国海洋大学 | 缢江蓠原生质体的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0353909B2 (ja) | 1991-08-16 |
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