JPS60168380A - アマノリ糸状体のプロトプラストの調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アマノリ糸状体の健全なプロトプラストを調
製する方法に関する。

本発明者は、さきに、ノリ葉体をシュードモナス属に属
する難消化性多［類の加水分解能を有する微生物を、ノ
リもしくはノリ由来の多８Ｉ４類を誘導物質として含む
培地中で場誉して得られる培養液から！＃製した、少く
ともマンナン加水分解酵素とキシラン加水分解酵素とを
含有する酵素液で処理することによって、ノリ葉体のプ
ロトプラスト′１に調製する方法に係る発明（特願昭５
８−１４９３７８号）をなしたが、更にその後の研究の
結果、上記方法を適用してアマノリ糸状体のプロトプラ
スト化を行ない得ることの知見を得て、本発明をなすに
至った。

ここでいう１アマノリ糸状体”とはアマノリの生活項に
おいて、生長したノリ葉体の先端細胞から転換した生殖
細胞が受梢して分裂することにより生ずる未胞子が海１
氏の貝殺に付層して生成する、カヒニ似た形状のもので
必って、コンコセリス（ａｏｎａｈｏａｅｌｅ’ｇ）と
称せられている。なお、この糸状体はアマノリの生活項
に訃いて、やがて胞子を形成し、幼芽の過程を経てノリ
幼葉になる。

元来、アマノリはその測施幽′ｆｒ：構成する多糖類（
主としてキシラン、マンナン）が、１空上植９勿のそれ
の多植＠（生々してセルロースラと異な広部消化性であ
るため、そのプロトプラスト化は困難とされていたもの
であるが、本発明者は、前述したように、シュードモナ
ス属に属する難消化性多糖類の加水分瑯能を有する微生
ｖｌＪを培誉して得られる酵素液でアマノリを処理する
ことに工９、そのプロトプラスト化に成功し、更に本発
明ではこのアマノリのプロトプラスト化の技術を上記ア
マノリ糸状体のプロトプラスト化に応用することにより
、そのプロトプラスト化にも成功したものである。

丁なわち、本発明は、上述したように、アマノリの生活
猿において生成するアマノリ糸状体のプロトプラストを
調製するための方法を提供することを目的とする。

以下本発明を詳しく収用する。

本発明の構成上の生長な待機は、アマノＩＪ、％状体を
シュードモナス属に＃！する嬌消化性多ａ１急の加水分
′Ｉｓ能を有する微生物を、海苔もしくは海苔由来の多
糖類を誘導物質として含む培地中で培養して得られる培
養液から調製される少なくともマンナン加水分′ＮＲ累
とキシラン加水分解酵素を含有する酵素液で処理するこ
とにある。なお、本発明の其他の構成は以下の説明から
明らかになるであろう。

本発明において、アマノリ糸状体のプロトプラスト化に
用いる酵素液の調製に利用さ扛る難消化性多ｍ類の加水
分解能を有する微生物は、海水中から分離されたシュー
ドモナス属（Ｐｓｅｕｄ６ｍｏｎａｓ　）に属するもの
でるって、Ｐｇｅｕｄｏｍｏｎａｓ　＊ｐ、　ＰＴ−５
の表示で微工研条寄第３３０号（ＦｇＲＭ　ＢＰ−３３
０）の受託番号で工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている。

なお、上記微生物は、上記難消化性多糖類であるキシラ
ン、マンナン及びボルフイランの加水分ｌｉＩ能ケ有し
、Ｆ記に示す園学的性質全有する。

菌学的性實： １）形態 ＺｏＢＥＬＬ　２２１６ｆｆｉ培地に生育した細胞につ
いて、（イ）細胞の形態は桿菌で大きさは０．５〜１μ
ｍ×１．５〜２．５　μｍ （ロ）　運動性を有し、鞭毛は単襖毛性ビ→　グラム染
色性は陰性 １１）生育状態 ＺｏＢｇＬＬ　２２１６Ｅ　ｆＩＪｒ面培地における生
育状態、（イ）　２０℃〜２７℃の温度で良好に生育す
る（口）淡黄色の色素を沈眉 ビ→　毛状（ｆｉｌｉｆｏｒｍ　）の集洛を形成１１１
）生理学的性質 （イ）　カタラーゼテスト　關性 （ロ）オキシダーゼテスト同性 Ｐ→　グルコースよりの酸の生成　１場性に）ｃ）−Ｆ
’テスト　０ （Ｈｕｇｈ　Ｌｅｉｆｓｏｎ法にょろりＯＮ　Ｖｉｂｒ
ｏ−８ｔａｔｌａＡｇａｎｔ（０／１２９）陰性（へ）
寒天液化能　“ （ト）キシラン分解能　十 （２）マンナン分解能　十 （男　好気性 本発明では上目己微生物を、海苔もしく＆家海苔由来の
多糖類全誘導物質として含む培地中で培養してマンナン
加水分解酵素、キシラン加水分解酵素更にはボルフイラ
ン加水分解酵素を培地中に生産するＯ ここで用いる１海苔由来の多糖類”と９ま海苔を熱水抽
出してｃｉＪ溶注溶分成分金除去侍らｎる。王として多
糖類から成る残渣、父は該残渣を更に精製処理して多糖
類含ｉｉｔを高めたものを意味する。

例えば、海苔を１０倍量の水に浸漬し、オートクレーブ
中で１２０℃で３０分間加熱したのち、濾布を用いて可
溶性区分を除去し、４ら扛る残渣について上ｍｌと同様
の手ｊ畝で加熱して可溶性区分を除去する操作を繰返し
行い（５同根度）、ついで得らｎる残／ｆを１００％エ
タノールに浸漬し、室温にて一夜放置したのち、可溶性
区分を除去し、乾燥したものを多糖類から成る残渣とし
て用いるか、又は、上記加熱と可溶性区分の除去を繰返
し行って得られる残渣（エタノール浸漬を行っていな（
・もの）をｌＮ−ＮａＯＨ溶液に浸漬し、室温にて一夜
放置したのち、可溶性区分を除去した残渣をＮａＯＨの
２０％熱水溶液で抽出し、得られる抽出液を遠心分離し
、その上澄液にフェーリング溶液を加えて沈ａを生成き
せ、この沈澱物を水洗してＣｕ　イオンを除去して侍ら
扛る多糖類（マンナン」もしくは上記フェーリング溶液
を加えて沈＃を生成させたときの上澄液にＨＣｔ′ｆｒ
、加えてｐｆ（を３に調整して傅ら扛る沈澱物から成る
多糖類（キシラン）をそれぞｎｍ製処理した多糖類とし
て用いる。

上記誘導物質としての海苔もしくは饅苔由来の多硝１Ａ
の培地に対する亦刀口首は１乃至２厘重％が適当である
。

本発明で利用する上記微生物の培養に用いる培地は、炭
素源として上記誘導物質を、窒素源としてペプトンおよ
び酵母エキスを、更には無機質としてに４ＨＰ　０４　
、　ＦｅＣＬＨなどを海水又は人工海水に浴解し、緩＃
液（例えばトリスバッファー）で−を７．５＠後に調整
したものが好ましい。培地組成を例示すると下記のとお
りである。

培地組成： 海苔又は海苔由来の多糖＠１．０（爪掛％）ペプトン　
１゜０ 酵母エキス　０．１ に！ＨＰ０．　０．０１ ＦｅＣｔ、　０．６　ａｖ／　／　１ トリス緩衝液　０．１（型針％り 上記割合で海水に溶解して内を７５に調整する。

本発明で４・り用する上記微生物の上記培地における冶
齋宋性は、２５℃の温度で４Ｈ間通気、攪拌通気Ｆ（通
気量１０００〜２０００ｍｌ／ＩｆＭＡ、攪拌ｉ１００
〜３００　ｒ、ｐ、ｍ、　）に行う。

上述のようにして培養して得られた培養液から酵素液を
ｐｌ製するには、該培養液全４℃の温度で３０分間遠心
分離（１０，００Ｏｒ＋ｐ、ｍ、）し、その上置液を酵
素液とする。

このようにして得らｎる酵素液はマンナン加水分解酵素
、キシラン加水分解酵素およびボルフイラン加水分解酵
素を含有する。

本発明では上記培養に当たシ、海苔由来の多糖類として
主にマンナンもしくはキシランから成るもの會誘尋物質
として培地に含有させて主としてマンナン加水分解酵素
もしくはキシラン加水分解＃紫をそｎぞｎ培地中に生産
させ、得られる培養液からこれらの各酵素を主として含
む酵素液を調製し、両者の酵素液を組合せてアマノリ糸
状体のプロトプラスト化に用いることも可能でめる。

本究明では、上述のようにして侍られる、少くとも７ン
ナン加水分解酵素と中シラン加水分解酵素を含有し、更
にはボルフイラン加水分解酵素を含有する酵素液でアマ
ノリ糸状体を処理すると、マンナン加水分解酵素はアマ
ノリ糸状体の表層に存在するｇ粒状のマンナンに作用し
て糸状体に大きな切〜ｆ８（＋を形成して、細胞壁を形
成しているミクロフィブリル形態のキシランに対するキ
シラン加水分解酵素の作用を容易にして該酵素によるキ
シランの分解を促進して、アマノリ糸状体をプロトプラ
スト化するに至る。又、上記酵素液中のボルフイラン力
ロ水分Ｊ％Ｉ＃！索はアマノリ糸状体の細胞間に存在す
るｗＪ買であるボルフイランに作用して分解し、該糸状
体のプロトプラスト化を−そう促進する。

アマノリ糸状体に作用させる上記酵糸液の量は、アマノ
リ糸状体のＩ（ｍ程度のコロニー１個に対し、上記酵素
液を５〜１０倍に＃縮したものの１０−程度が適当でｂ
シ・　３〜４時間の作用でアマノリ糸状体のグロトプラ
ストヲ調裂し得る。

また、本発明ではアマノリ糸状体に上記酵素液を作用さ
せるに当って、該アマノリ糸状体にグロテアーゼを作用
させると糸状体の表層を被覆している蛍白質の薄い層を
分解し得るのでプロトプラストを調製するうえで一層効
釆的である。グロテアーゼとしてはパパインが特に好ま
しく、１０％のパパイン液として糸状体に１５〜３０分
程度作用させると上記蛋白質の薄層を有効に分解、除去
し得る。

なお、グロテアーゼのアマノリ糸状体に対する作用は、
上目己プロトプラスト化のための酵素液による処理に先
立って行ってもよく、父、該酵素液による処理と平行的
に行ってもよい。

上述のようにして得られるアマノリ氷状体のプロトプラ
ストは糸状体を物理的に切断することなく、酵素処理に
よってのみ調製されるものであるかり健全な状態でるっ
て・削施融付にも利用するのに適している。

例えば、本発明の方法で調製されたアマノリ糸状体のプ
ロトプラストヲペトリ皿内で人工海水（藻類用Ａｓｐ、
　１２　）に懸濁させ、ベトリ皿の底部に着生じたプロ
ドブ２ストの生育状況ヲ威祭した結果によると生育状況
は非常に良好でるる。

叙上のように、本発明によると、アマノリ糸状体の健全
なプロトプラス）１調製し得るので、このアマノリ糸状
体のプロトプラストを生育させることにより、従来のよ
うなアマノリの生活項ヲ経ることなく、ｆ′なわち、ノ
リの養殖上巻から皮にかけて海産の貝殻に付層して生成
する糸状体の過程を経ることなく、糸状体の胞子の形成
−幼芽−幼葉の過程でアマノリを生産し得るようになる
ので、ノリの養殖技術上寄与するところが多大であると
いえる。

又、今後のアマノリ糸状体の細胞融会孜術の進展にも役
立つものともいえる。

以Ｆに実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。

実施例１ 接遣ば四葭斃 ペプトン　１．０（電電％す 酵母エキス　０．１　（＃　） Ｋ冨ＨＰＯ４０，０１（／／　） ＦｅＣ４０，６ｒｎ９　／　Ｌ トリス緩衝液　０．１（重量’Ｘ） （トリスアミノメタン） 海苔の熱水抽出残渣　１．ｏ（重量Ｘ）上記組成のもの
ｔ海水に絡加してｐＨ７，５に調整したものを培地に用
いた。

酵系液の調製 上記培地にシュードモナス（Ｐａｅｕｄｏｍｏｎａａ　
）　ｓｐ微工研条寄、％ＢＰ−３３０を接種し、３００
　ｒ、ｐ、ｍ。

の偉拌下に通気しながら（通気量２０００　ｍｌ／１ｍ
）２５℃で４日間培１１を行った。

侍ら３た増誉漱ｔ４℃の温度でｊＯ分間通６分離（１０
，００Ｏｒ、ｐ、ｍ、　）　Ｌ、その上澄液を１０倍に
濃縮して酵素液とした。

このようにして調製した酵素液の難消化性多糖類に対す
る酵素活性を詞べた結果は、Ｆ記載に示すとおりである
。

表 （至）十十＋・・・・・・活性が非常に強い十十・・・
・・・活性が強い ＋・・・・・・活性が稍々強い 表にみもれるように、本発明で用いる酵素液はマンナン
およびキシランに対する活性が優ｎている。

プロトプラストのｔｉｌｌ蟹 アマノリ糸状体の１ｃｍ程度のコロニー１個ｆ：Ｌ型試
験管に入れ、これに上記酵素液１０−を加えてアマノリ
糸状体を該酵素液に浸漬しながら、２０℃の温度で七ノ
ー型振盪器を用いて４時間振ｆｉ（７０ストロ一ク／分
）させてアマノリ糸状体のプロトプラスト’を傅た。

実施例２ 本例はアマノリ糸状体のプロトプラスト化に当って該糸
状体にパパインを作用させた例を示したものである。な
お、パパインを糸状体に作用させるほかは、実施例１と
同様な手順でプロトプラストの調整を行った。

パパインによる処理 り型試験管に１ｃＩＩＬ程度のアマノＩＪ糸状体コロニ
ー１個を収容し、これに１％パパイン溶液（酢酸塩バッ
ファーに溶解して−６，０にしたもの）１゜−を添加し
てアマノリ糸状体′ｆ、該パパイン浴液ニ＆撹しながら
、２０Ｃの温度で１０分間嶽盪（モノー型振盪器７０ス
トローク／分）させた。

プロトプラストの調整 上述のようにしてパパインを作用させたアマノリ糸状体
を、実施例１に記載した手順に従って酵素液で６０分間
処理してプロトグラス）’！ｋａ１４ｍした口 出願人　小波商事株式会社 代理人宮田広豊

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＋１７　アマノリ糸状体を、シュードモナス属（Ｐａｅ
   ｕｄｏｍｏｎａａ　）に属する難消化性多糖類の加水分
   解能を有する微生物を、海苔もしくは海苔由来の多糖類
   を誘導物質として含む培地中で培養して得られる培養液
   から調製した少なくともマンナン加水分解酵素とキシラ
   ン加水分解酵素とを含有する酵素液で処理することを特
   徴とするアマノリ糸状体のプロトプラストを調製する方
   法。 （２）　グロテアーゼヲ作用させたアマノリ糸状体ｉ　
   シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　）に属す
   る難消化性多糖類の加水分解能を肩する微生物を、海苔
   又は海苔由来の多ｔｓ類を誘導物質として含む培地中で
   培養して侍ら扛る培養液からｇ製した少なくともマンナ
   ン加水分解酵素とキシラン加水分解酵素とを含有する酵
   素液で処理することを特徴とするアマノリ糸状体のプロ
   トプラストを調製する方法。 （３）　アマノリ糸状体を、プロテアーゼと、シュード
   モナス属（Ｐｓ＊ｕｄｏｍｏｎａりに属する離消化性多
   楯胡の加水分解面を有する微生物ｔ、海苔または海苔由
   来の多糖類を誘４物質として含む培地中で培養して侍ら
   ｎる培養液から調製した少なくともマンナン加水分解酵
   素とキシラン加水分解酵素とを含有する酵素液で処理す
   ることを特徴とするアマノリ糸状体のプロトプラストを
   調製する方法。 （４）　海藻由来の多糖類は海苔を熱水抽出して得られ
   る多種類含有残渣である特許請求の範囲第１項乃至第３
   項のいずれかに記載の方法。 （５）海苔由来の多糖類は海苔を熱水抽出して得られる
   残渣を精製処理したものである特許請求の範囲第１項乃
   至第３項のいすｎかに記載の方法。 ｔ６ｒ　＃ｘｇはボルフイラン加水分ｍ酵素も含Ｍ゛す
   るものでめる％軒請求の範囲第１項乃至第３項のいすｎ
   かに記載の方法。 （７）酵素液はマンナン加水分解酵素を含有するｌ＃累
   液とキシラン加水分解酵素を含有する酵素液とを組付せ
   たものでめる特許請求の範囲第１項乃至第３項のいすｎ
   かに記載の方法。 （８）培地は窒素源としてペプトンおよび酵母エキスｒ
   含有するものである特許請求の範囲第１項乃至２ｇ３項
   のいずれかに記載の方法。 （９）　グロテアーゼがパパインである特許請求の範囲
   第２項又は第３項にｉｃｅ載の方法。