JPH0368672B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、高いプロテアーゼ生産能及び高いグ
ルタミナーゼ生産能を有する新規な麹菌の育種法
に関する。 〔技術の背景及び従来技術の説明〕 醤油は、アミノ酸の旨味を主体とする調味料で
あるために、醤油の醸造において、窒素の利用率
を向上してアミノ酸の生成量を多くすること、及
びグルタミン酸の生成量を向上することは重要な
ことであり、これらのことは醤油の醸造において
考慮されている。したがつて、醤油の醸造では、
強力なプロテアーゼ及びグルタミナーゼを生産し
うる麹菌を育種することは極めて重要なことであ
る。 これまでに醤油の醸造に使用されていた麹菌に
は、500〜650U／ｇの高いプロテアーゼ生産能を
有する菌株のグルタミナーゼ生産能は0.25〜
1.5U／ｇのように低いか、または3.0〜8.0U／ｇ
の高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株のプロ
テアーゼ生産能は100〜400U／ｇのように低いと
いう傾向があつた。 このために、これまでの醤油の醸造では、プロ
テアーゼ生産能の高い菌株を使用すると、醤油原
料の可溶性窒素の溶解利用率は向上するが、グル
タミナーゼ生産能が低いために諸味液汁における
グルタミン酸の生成が少なく、旨味の豊富な醤油
が得難い傾向があり、またグルタミナーゼ生産能
の高い菌株を使用すると、プロテアーゼ生産能が
低いために醤油原料の可溶性窒素の溶解利用率を
向上することができない。 これまでに、プロテアーゼ生産能及びグルタミ
ナーゼ生産能の高い優秀な麹菌を得るために、麹
菌の菌株を人工変異処理することが試みられたが
（特開昭57−174087号公報）、麹菌の人工変異処理
によつて麹菌のプロテアーゼ生産能またはグルタ
ミナーゼ生産能のどちらか一方だけを向上した菌
株を得ることはできるが、双方の生産能を共に向
上した菌株を得ることは非常に困難であつた。 本発明者らは、麹菌のプロテアーゼ生産能及び
グルタミナーゼ生産能の双方の向上した菌株を得
ることを企図して、多くの検討を行なつた結果、
アスペルギルス属に属する菌株、特にアスペルギ
ルス・ソーヤに属する菌株であつて、プロテアー
ゼ生産能の高い菌株と、グルタミナーゼ生産能の
高い菌株をプロトプラスト融合し、得られた融合
細胞を高張再生培地において培養すると、プロテ
アーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能の双方の高
い融合２倍体株が得られること、ここで得られた
融合２倍体株は、ヘテロカリオンである場合が多
いので元の親株に戻り易く、不安定であるのでこ
れに短時間の紫外線照射をすることによりこれを
安定化させた後これを親株として人口変異処理を
行なうと、親株に比べてプロテアーゼ生産能及び
グルタミナーゼ生産能の双方が高い菌株を育種を
しうること、およびこの人工変異処理によつて得
られた菌株の中に高いプロテアーゼ生産能及び高
いグルタミナーゼ生産能を有する菌株のあること
を見出し、これらの知見にもとづいて本発明に到
達したのである。 〔発明の目的及び発明の要約〕 本発明の目的は、プロトプラストにより得られ
た融合２倍体株を親株として、人口変異処理を行
ないプロテアーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能
の双方が同時に、該融合２倍体株（親株）に比べ
て大幅に向上した菌株を育種することにある。 本発明は、アスペルギルス・ソーヤに属する菌
株であつて、プロテアーゼ生産能の高い菌株及び
グルタミナーゼ生産能の高い菌株のそれぞれの培
養細胞からプロトプラストを得ること、これらを
プロトプラスト融合して、融合細胞を得ること、
該融合細胞を高張再生培地において培養し、得ら
れた培養物からプロテアーゼ生産能及びグルタミ
ナーゼ生産能の双方の酵素生産能の高められた融
合２倍体株を得ること、ここに得られた融合２倍
体株を紫外線照射により安定化させた後人口変異
処理をすることを特徴とする、アスペルギルス・
ソーヤに属する菌株であつて、該安定化させた融
合２倍体株よりも高いプロテアーゼ生産能及び高
いグルタミナーゼ生産能を有する麹菌の育種法で
ある。 〔発明の具体的な説明〕 本発明の、アスペルギルス属に属する菌株であ
つて、高いプロテアーゼ生産能及び高いグルタミ
ナーゼ生産能を有する麹菌は、以下に述べる方法
によつて育種される。たとえば、アスペルギル
ス・ソーヤに属する菌株を親株とした場合は、ア
スペルギルス・ソーヤに属する菌株が育種され、
またアスペルギルス・オリゼーに属する菌株を親
株とした場合は、アスペルギルス・オリゼーに属
する菌株が育種され、さらにアスペルギルス・ニ
ガーに属する菌株を親株とした場合は、アスペル
ギルス・ニガーに属する菌株が育種されるのであ
る。また異なる種同志を親株として育種すること
もできる。 本発明の麹菌を育種するに際して、先ずアスペ
ルギルス属に属する菌株であつて、高いプロテア
ーゼ生産能を有する菌株の分生胞子が栄養培地に
おいて培養され、これとは別に、アスペルギルス
属に属する菌株であつて、高いグルタミナーゼ生
産能を有する菌株の分生胞子が栄養培地において
培養される。 アスペルギルス属に属する菌株であつて、高い
プロテアーゼ生産能を有する菌株（親株）として
は、アスペルギルス属に属していて、高いプロテ
アーゼ生産能を有する菌株であれば、いかなるも
のであつても、これを使用することができる。し
たがつて、醤油、味噌または清酒の醸造に使用す
る麹菌の中から、プロテアーゼ生産能の高い菌株
を検索することによつて、上記の親株を容易に入
手することができるが、たとえば、アスペルギル
ス・ソーヤATCC42249、アスペルギルス・ソー
ヤATCC42250、アスペルギルス・ソーヤ
ATCC42251及びアスペルギルス・オリゼー460
（FERM−ＰNo.1149）の各菌株を使用することが
できるが、これらの変種または変異株を使用する
こともできる。 またアスペルギルス属に属する菌株であつて、
高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株（親株）
としては、アスペルギルス属に属していて、高い
グルタミナーゼ生産能を有する菌株であれば、い
かなるものであつても、これを使用することがで
きる。したがつて醤油、味噌または清酒の醸造に
使用する麹菌の中からグルタミナーゼ生産能の高
い菌株を検索することによつて、上記の親株を容
易に入手することができるが、たとえば、アスペ
ルギルス・ソーヤ262（FERM Ｐ−2128）、アス
ペルギルス・ソーヤ2165（FERM Ｐ−7280）及
びアスペルギルス・オリゼー（IAM2638）の各
菌株を使用することもできる。 上記の菌株（親株）の分生胞子を培養する栄養
培地は、麹菌が必要とする栄養源を含む培地であ
れば、いかなる培地であつてもこれを使用するこ
とができるが、たとえば、ツアペツク（Czapek）
培地に、0.5％の酵母エキス及び0.2％のカザミノ
酸を加え、PHを6.0に調整したものを、水で10倍
に希釈した培地（以下において「ツアペツク変形
培地」と略記する）、他の合成培地、半合成培地
あるいは天然培地を使用することができる。合成
培地における炭素源としては、グルコース、サツ
カロース等、窒素源としては硫酸アンモニウム、
硝酸アンモニウム等を使用することができ、また
天然培地における炭素源としては、割砕小麦、麦
皮等、窒素源としては、スキムミルク、脱脂大豆
等を使用することができる。さらに上記の培地
に、リン酸、カリウム、マグネシウム、カルシウ
ム等の無機塩類を加えることができ、さらにな
お、菌の生育に必要なアミノ酸、ビタミン等を必
要に応じて培地に添加することもできる。 通常の場合、培養は25〜35℃の温度において行
なわれ、ほとんどの発芽胞子の長さ（胞子とそこ
から伸びる菌糸の長さを合わせたもの）が、もと
の胞子（培養開始時）の外径の５〜15倍に生育す
るのに充分な時間（通常、５〜15時間）、静置、
振とうまたは通気培養等の好気的条件において培
養する。 またこの培養は、固体培養によることもでき
る。固体培養を行なう場合、麦皮、小麦などの炭
素源、大豆などの窒素源、その他の有機質あるい
は無機質を原料とし、これらを蒸煮などの殺菌処
理をした後に、種菌を接種混合し、25〜38℃で、
発芽胞子の長さがもとの胞子外径の５〜15倍にな
るように生育するのに充分な時間、無菌的に培養
するのが好ましい。これらの培養において、発芽
胞子の長さが、もとの胞子外径の５倍未満である
と、この後に行なう麹菌のプロトプラストをほと
んど形成することができず、また15倍を超える
と、麹菌のプロトプラストの形成率が非常に低く
なるので好ましくない。 次に、こうして得られた培養細胞からプロトプ
ラストを得るには、上記各々の発芽胞子につい
て、10⁶〜10⁸個／ml（高張液）の濃度の発芽胞子
ケン濁液を調製し、各調製ケン濁液を等量混合
し、遠心分離して集菌したのち、これに予じめ無
菌処理した細胞壁溶解酵素を添加し処理するか、
又は各々の発芽胞子ケン濁液を遠心分離して集菌
したのち、これを最初、細胞壁溶解酵素を添加し
て処理を行い、次いで各処理液を等量混合するこ
とにより得られる。 ここに用いられる細胞壁溶解酵素としては、麹
菌の細胞壁を溶解する活性を有するものであれば
いずれでもよく、セルラーゼ、β−１，３−グル
カナーゼ及びキチナーゼ等を単独、または混合し
て用い、或いは一般に細胞壁溶解酵素として用い
られている混合酵素等を用いることができる。本
発明者らが実験したところ、これらの酵素のうち
β−１，３−グルカナーゼとキチナーゼを併用す
ると、麹菌のプロトプラストの形成率を著しく高
めることが判明したので、上記２つの酵素を併用
することが好ましい。 上記キチナーゼとしては、キチナーゼ活性を有
する酵素剤が用いられ、例えば米国ICN社製キチ
ナーゼNo.100466、米国シグマ社製キチナーゼNo.Ｃ
−6137、生化学工業社販売キチナーゼ・フアンガ
ル（fungal）No.100290等が挙げられる。 またβ−１，３−グルカナーゼとしてはキリン
ビール社製、ザイモリアーゼ（Zymolyase）
5000、同60000及び本発明者らが微生物バチラ
ス・サーキユランスIAM1165及びストレプトマ
イセス0143（FERM Ｐ−7276）のそれぞれの培
養液から調製した２つの粗酵素等が挙げられる
が、特に後者の２つの粗酵素が好ましい。 上記バチラス・サーキユランスIAM1165から
調製した粗酵素及びストレプトマイセス0143株か
ら調製した粗酵素は以下のようにして得られたも
のである。 〔１〕 バチラス・サーキユランスIAM1165か
らの粗酵素調製法 肉エキス１％、ポリペプトン１％、麹菌湿潤菌
体２％及び水からなる培地（PH7.2）１を５
容三角フラスコに入れ、高圧滅菌したものに、麹
菌湿潤菌体を入れない以外は上記と全く同じ培地
で前培養（30℃で48時間）したバチラス・サーキ
ユランスIAM1165の種菌液10mlを接種し、30℃
で48時間、振とう培養（170r.p.m.）した。こう
して得た培養液から粗酵素を得るには、これを遠
心分離して上清液を分離取得し、これに硫安を加
えて常法により塩析し、生成した沈澱区分を採取
した。これを水25mlに溶解し、セロフアンチユー
ブに入れ、１夜５℃で蒸留水を用いて透析処理
し、得られた透析内液を凍結乾燥し、粗酵素（以
下、「バチラス・サーキユランス起源の粗酵素」
と称す）を得た。 〔２〕 ストレプトマイセス0143からの粗酵素調
製法 培地組成 １ KH₂PO₄ 0.2％ 酵母エキス 0.05％ Kcl 0.05％ グルコース 0.25％ MgSO₄・7H₂O 0.1％ ネオペプトン 0.1％ Nacl 0.05％ NaNO₃ 0.1％ 麹菌湿潤菌体 2.1％ 蒸留水 1.0 PH 5.0 上記組成の培地１（PH5.0）に、これと同一組成
の培地にて前培養したストレプトマイセス0143
（FERM Ｐ−7276）の種菌液10mlを接種し、30
℃で培養液のPHが7.0に上昇する迄（７日間）、振
とう培養（170r.p.m.）した。以下、上記バチラ
ス・サーキユランスの培養液から粗酵素を得る方
法と全く同様にして、培養液から粗酵素（以下、
「ストレプトマイセス起源の粗酵素」と称す）を
得た。 尚、上記で得られる２つの粗酵素は、β−１，
３−グルカンを基質として、常法によりβ−１，
３−グルカナーゼ活性の有無を調べた結果、強力
に基質を分解することが確認され、β−１，３−
グルカナーゼとして使用できることが判明した。 また、洗滌し、ホモゲナイズされた麹菌湿潤菌
体を含む寒天平板培地に上記の両粗酵素は作用
し、透明なハローを形成することから、該粗酵素
はいずれも麹菌菌体の細胞壁を溶解することも確
認された。 次に、麹菌の発芽胞子と細胞壁溶解酵素との処
理条件について説明する。すなわち、細胞壁溶解
酵素の使用濃度は、麹菌発芽胞子の細胞壁を溶解
し、完全なプロトプラストを得るのに充分な濃度
とすることが好ましく、例えばバチラス・サーキ
ユランス起源の粗酵素の場合、10〜50mg／ml、好
ましくは25〜35mg／mlである。またキチナーゼを
併用する場合、その使用濃度は１〜10mg／ml、好
ましくは３〜５mg／mlである。酵素処理の時間は
麹菌の細胞壁を溶解し、プロトプラストを得るの
に充分な時間とすることが必要で、通常30分〜６
時間が好ましい。またPHは6.0〜7.0、特に6.5が好
ましい。 次いで、酵素処理が終了したら、菌体を保護す
る洗滌液、例えば0.7〜1.5Mソルビトール或いは
0.5〜1.0M塩化カリウム溶液等で、菌体を洗滌
し、麹菌の細胞壁が溶解除去されたプロトプラス
トを得る。 次に、ここで得られたプロトプラストの融合処
理及び融合プロトプラストの再生は、例えば、
Ann′e等の方法〔J.Gen.Microbiol.，92，413
（1976）〕に準じて行うことができる。 即ち、0.7〜1.5M・ソルビトール、５〜
100mM・CaCl₂及び30〜80mMグリシンを含む15
〜33％ポリエチレングリコール6000（PH7.5）中
に、上記で得られた高プロテアーゼ生産株と高グ
ルタミナーゼ生産株のそれぞれの洗滌プロトプラ
ストを添加混合し、20〜30℃で15〜45分処理する
ことによりプロトプラスト融合細胞を得ることが
できる。 次に、こうして得られたプロトプラスト融合細
胞の再生は、プロトプラストを保護しつつ細胞壁
を再生することが可能な高張再生培地、例えば
0.7〜1.5Mのソルビトールを含む米麹汁（又は麦
芽汁）に寒天２％を含有させた高張再生寒天培地
（PH6.5）及び、0.7〜1.5Mのソルビツトを含むツ
アペツク液体培地に寒天２％を含有させた高張最
小再生寒天培地（PH6.5）に上記で得られたプロ
トプラスト融合細胞を移し、25℃〜35℃で２〜10
日間培養する方法により行なわれる。こうして、
プロトプラストの融合細胞は、その周囲に細胞壁
が再生し、培地上で生育して再生コロニーを形成
する。 次に、こうして得られた再生コロニーから、プ
ロトプラスト融合細胞の選別は、予じめその親株
である高プロテアーゼ生産株と、親株である高グ
ルタミナーゼ生産株の洗滌プロトプラストについ
て、それぞれ融合細胞の場合と同様に再生させ、
得られた再生コロニーの形態学的性質（色相、色
彩、明度、光沢、形状、大きさ等）及び生理学的
性質等の特徴を把握しておくことによつて、それ
らとは異なる特徴を備えた再生コロニーとして、
選別採取することができる。 尚、上記高プロテアーゼ生産株と高グルタミナ
ーゼ生産株のそれぞれの親株の分生胞子に、人工
変異処理（Ｘ線、紫外線等の照射、ニトロソグア
ニジン、エチルメチルサルフイート等の化学変異
処理）を施して、それぞれ親株の分生胞子に特徴
ある色や各種の栄養要求性、例えばアラニン、メ
チオニン等のアミノ酸要求性、ビオチン、ニコチ
ン酸、パラアミノ安息香酸等の要求性を付与した
変異株を得、この変異株を親株として上記と同様
に酵素処理、プロトプラスト融合処理を行ない、
次いで再生し、再生コロニーとすると、親株であ
る変異株は特徴ある色を有し、この色を有しない
プロトプラスト融合細胞を明確に区別し、採取す
ることができる。また栄養要求変異株のプロトプ
ラストは再生の際、特定の栄養源が存在しないと
生育出来ないので、特定の栄養源が存在しなくて
も生育できるプロトプラスト融合細胞を容易に区
別し採取することができる。このように両親株に
色及び栄養要求性等のマーカーを付しておくと、
目的とする融合細胞の分離操作が極めて容易とな
る。 上記で得られる高プロテアーゼ生産株の変異株
としては、例えば分生胞子が白色で、パラアミノ
安息香酸要求性の付与されたアスペルギルス・ソ
ーヤW2−91（FERM Ｐ−7277）が挙げられ、ま
た高グルタミナーゼ生産株の変異株としては、例
えば分生胞子が黄色で、ニコチン酸要求性の付与
されたアスペルギルス・ソーヤM12−２−61
（FERM Ｐ−7281）等が挙げられる。 次に、こうして高張再生培地で再生したプロト
プラスト融合株は、ヘテロカリオンである場合が
多いので親株に戻り易く、不安定である。そこ
で、これらヘテロカリオン株の分生胞子に、小田
等の方法〔Agric.Biol.Chem.，27，758（1963）〕
に従つて、紫外線照射（距離39cm、１〜５分）を
施し、検定することによつて、安定な融合２倍体
株を得ることができる。 アスペルギルス・ソーヤＤ−78はこうして得た
高プロテアーゼ生産能を有し且つ高グルタミナー
ゼ生産能を有する安定な融合２倍体株であり、工
業技術院微生物工業技術研究所（以下、微工研と
略記する）に、微工研菌寄第7279号として寄託さ
れている。 次に上記で得られた融合２倍体株を親株として
人工変異処理を行なう。 本発明において、プロトプラスト融合により得
られた融合２倍体株を、人工変異処理することは
極めて重要であつて、他の、たとえば吻合融合に
より得られた融合２倍体株や、市販されている種
麹菌に、紫外線照射等の変異処理を施しても、該
変異処理によつてプロテアーゼ生産能とグルタミ
ナーゼ生産能の双方が同時に、２倍体親株に比べ
て高い菌株を育種することはできない。 しかし、プロトプラスト融合により得られた融
合２倍体株を人工変異処理するときは、プロテア
ーゼ生産能とグルタミナーゼ生産能の双方が同時
に、該２倍体親株に比べて大幅に増強された菌株
を高い頻度において育種することができる。 人工変異処理の手段としては、麹菌の上記融合
２倍体株に対して周知の突然変異処理、たとえば
紫外線照射、Ｘ線照射、放射線照射、エチルメタ
ンスルホン酸（以下、EMSと略記する）、Ｎ−メ
チル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（以下、MNNGと略記する）などの突然変異誘
起剤との接触処理を行なう。 たとえば、紫外線照射による方法としては、上
記融合２倍体株を米麹汁スラント培地、麦芽汁ス
ラント培地などの寒天栄養スラント培地に接種
し、麹菌の生育適温の25〜35℃で、２〜７日間培
養して分生胞子を得、この胞子懸濁液に20〜50cm
の距離から紫外線を、生存率が５％以下、好まし
くは0.01〜１％になるのに充分な時間、たとえば
３〜60分間照射し、次いで得られた胞子を米麹汁
平板培地、麦芽汁寒天平板培地などの寒天栄養平
板培地に塗沫し、25〜35℃で２〜７日間培養し、
生じた大きなコロニーを釣菌することにより得
る。 また突然変異誘起剤としてEMSを用いる方法
としては、上記融合２倍体株を寒天栄養スラント
培地（７％マルツスラント培地）に接種し、30℃
で４日間培養して分生胞子を得、このスラントに
胞子分散剤、0.05％ソルゲンTW−60溶液９mlを
注入して胞子懸濁液８mlを得、これにEMS150μ
を加えて、EMSの最終濃度を２％とし、30℃、
４時間反応させ、生存率４〜10％の反応液を得、
この反応液１mlに、反応停止剤、６％Na₂S₂O₃溶
液９mlを加え、15分放置して反応を止め、これを
寒天栄養平板培地に塗沫し、25〜35℃で２〜７日
間培養し、生じた大きなコロニーを釣菌すること
により得られる。 また突然変異誘起剤としてMNNGを用いる方
法としては、１mg／mlの濃度のMNNG10mlに、
融合２倍体株の胞子懸濁液を、胞子数が10⁶個／
mlになるように加え、30℃で５〜15分間反応さ
せ、この反応液を上記と同様に寒天栄養平板培地
に塗沫し、25〜35℃で２〜７日間培養し、生じた
大きなコロニーを釣菌することにより得られる。 アスペルギルス・ソーヤＤ−78Mは、こうして
得られた高プロテアーゼ生産能を有し且つ高グル
タミナーゼ生産能を有する、多くの麹菌の中から
選ばれた１菌株で、微工研にFERM Ｐ−7523と
して寄託されている。 本発明の利点は次のとおりである。 従来一般に採用されていた紫外線照射等の変異
処理による変異株の分離は、極めて偶然性が高
く、スクリーニングに膨大な労力を要するなど効
率が極めて悪く、たまたま酵素生産性に優れた変
異株が得られても、逆に生育が悪くなつたり、直
ちに復帰突然変異を起したりして実用に供し得な
いものが多かつた。 そして、変異処理による変異株の育種法で最も
大きな欠点は、取得される変異株は、プロテアー
ゼ生産能あるいはグルタミナーゼ生産能のうち一
方については高くても、他方は逆に低い場合が多
く、両方とも高い菌株を取得することは困難であ
つたことである。 これに対して、本発明は、プロトプラスト融合
により得られた融合２倍体株に人工変異処理する
ものであるから、プロテアーゼ生産能とグルタミ
ナーゼ生産能の双方が同時に、該２倍体親株に比
べて大幅に増強された菌株を高頻度に育成するこ
とができる。 そして本発明で育成した麹菌を醤油麹原料に接
種、培養して麹をつくり、この麹を用いて仕込を
行ない醤油を製造すると、醤油原料は頗る良く分
解されて、窒素利用率が著しく向上するばかり
か、グルタミン酸が著しく増加するので、非常に
旨味の強い醤油が得られるという、産業上画期的
な効果を奏する。 以下において、実施例を示して本発明を更に詳
細に説明するが、本発明は実施例に限定されるも
のではなく、技術の開示の１つと考えられるべき
である。 実施例 １ 分生胞子が白色で、パラアミノ安息香酸要求性
を有するアスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus
soya）W2−91（FERM Ｐ−7277）株を高プロテ
アーゼ生産株として使用し、この菌株の分生胞子
を米麹汁スラント培地に接種し、30℃の温度にお
いて66時間培養し、得られた培地から、常法によ
つて、分生胞子を採取した。得られた分生胞子を
0.01％ソルビタン脂肪酸エステル〔ソルゲンTW
−60、第１工業製薬(株)製〕溶液に分散して５×
10⁷個／mlの胞子ケン濁液を調製した。 ここに得られた胞子ケン濁液１mlを、150ml容
三角フラスコに入れたツアペツク変形培地〔ツア
ペツク（Czapek）培地に酵母エキス0.5％及びカ
ザミノ酸0.2％を加え、PHを6.0に調整したものを
水で10倍に希釈した培地〕30mlに接種し、30℃の
温度において12時間振とう培養して、発芽胞子の
長さがもとの胞子外径の10倍の発芽胞子（培養細
胞）を得た。 ここに得られた発芽胞子ケン濁液を、4500Gに
おいて20分間遠心分離して、発芽胞子を集め、こ
れを水で充分に洗滌し、水切りした後、細胞壁溶
解酵素液〔バチラス・サーキユランス起源の粗酵
素を30mg／１ml及びキチナーゼ（米国ICN社製）
を５mg／１mlの割合で溶解して得られたもの〕１
mlと混合し、この混合液を27℃の温度で２時間ゆ
るやかに振とうして、酵素処理を行なつて、アス
ペルギルス・ソーヤW2−91（FERM Ｐ−7277）
株のプロトプラストを得た。 ここに得られたプロトプラストをＧ−３規格の
ガラスフイルターで分離し、これを0.8Mソルビ
トール溶液で３回洗滌し、得られた洗滌プロトプ
ラストを0.8Mソルビトール溶液１mlに移し、ケ
ン濁してプロトプラストのケン濁液を得た。 これとは別に、分生胞子が黄色で、ニコチン酸
要求性を有するアスペルギルス・ソーヤ
（Aspergillus sojae）M12−２−61（FERM Ｐ−
7281）株を高グルタミナーゼ生産株として使用
し、この菌株の分生胞子を前記のアスペルギル
ス・ソーヤW2−91株と同様に処理して、アスペ
ルギルス・ソーヤM12−２−61（FERM Ｐ−
7281）株のプロトプラストがケン濁された0.8M
ソルビトール溶液を得た。 次にこのプロトプラストのケン濁された0.8M
ソルビトール溶液に、前記のアスペルギルス・ソ
ーヤW2−91（FERM Ｐ−7277）（高プロテアー
ゼ生産株）がケン濁された0.8Mソルビトール溶
液を加え、よく混合した後、混合ケン濁液を、20
℃の温度において、700Gで15分間遠心分離して、
アスペルギルス・ソーヤW2−91株（高プロテア
ーゼ生産株）とアスペルギルス・ソーヤM12−２
−61株（高グルタミナーゼ生産株）の混合プロト
プラストのペレツトを得た。 ここに得られた混合プロトプラストのペレツト
を0.8Mソルビトール、10mM CaCl₂及び50mM
グリシンを含む20％ポリエチレングリコール6000
（PH：7.5）溶液１mlと混合し、25℃の温度におい
て30分間、プロトプラスト融合反応を行なわせ
て、プロトプラスト融合細胞を得た。 ここに得られたプロトプラスト融合細胞に、
0.8Mソルビトール溶液を加えて、適当な濃度の
ケン濁液とし、これを予めシヤーレ内に流し固め
た高張最小再生寒天培地〔0.8Mソルビトールを
含むツアペツク寒天培地（寒天２％）〕に播種し、
その上に、寒天が0.5％である以外は全く同じ高
張最小再生寒天培地を流し込んで固化して重層
し、30℃の温度において５日間培養して、プロト
プラスト融合細胞の再生コロニーを得た。 ここに得られた再生株を米麹汁スラント培地に
接種し、30℃の温度において４日間培養して、緑
色、黄色、白色の胞子をもつヘテロカリオン株の
胞子を得た。ここに得られたヘテロカリオン株の
胞子に、39cmの距離から紫外線を１分間照射し、
得られた胞子を再び最小寒天平板培地に塗布し、
30℃の温度において４日間培養して、緑色の胞子
のみからなり、安定なコロニーを生成しうる菌株
を得た。この菌株の中から高いプロテアーゼ生産
能と高いグルタミナーゼ生産能の双方を有する融
合２倍体株のアスペルギルス・ソーヤＤ−78
（FERM Ｐ−7279）株を得た。 このようにして得られた融合２倍体株を米麹汁
スラント培地に接種し、30℃の温度において４日
間培養して、胞子を着生させ、この胞子ケン濁液
に、39cmの距離から紫外線を10分間照射し、得ら
れた照射液を再び米麹汁寒天平板培地に塗布し、
30℃の温度において４日間培養して分生胞子を着
生させ、この中から本発明の目的とする高いプロ
テアーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を
有する菌株のアスペルギルス・ソーヤＤ−78M
（FERM Ｐ−7523）を選抜した。 ここに得られた本発明の菌株と、その育種の過
程で使用した親株の酵素生産能を調べた。その結
果を第１表に示す。

【表】

【表】 うにして求められた。
脱脂大豆30ｇと炒熬割砕小麦30ｇを原料にし
て、直径15cmのシヤーレ内で、通常の醤油麹と同
じ方法で製麹し、得られた醤油麹に10倍量の水を
加えて、２時間抽出し、得られた抽出液のプロテ
アーゼ活性がアンソンー萩原法を用いて測定され
た。第１表のプロテアーゼ活性は、麹１ｇ当り１
分間に1μモルのチロシンを生成する活性を１単
位として表示した。 またグルタミナーゼ活性は、前記の抽出残渣を
ホモジナイズして得られた液とＬ−グルタミンを
30℃において１時間振とう反応させ、濾過した
後、濾液のグルタミン酸量を測定して求めた。第
１表のグルタミナーゼ活性は、麹１ｇ当り１分間
に1μモルのグルタミン酸量を生成する活性を１
単位として表示した。 第１表の結果から、融合２倍体株を親株とし
て、人工変異処理を行なうと、プロテアーゼ生産
能とグルタミナーゼ生産能の双方が同時に、該融
合２倍体株（親株）に比べて大幅に向上した菌株
を育種することができたことがわかる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アスペルギルス・ソーヤに属する菌株であつ
   て、高いプロテアーゼ生産能を有する菌株を培養
   し、得られた培養細胞からプロトプラストを得る
   こと、アスペルギルス・ソーヤに属する菌株であ
   つて、高いグルタミナーゼ生産能を有する菌株を
   培養し、得られた培養細胞からプロトプラストを
   得ること、これらをプロトプラスト融合させて融
   合細胞を得ること、融合細胞を高張再生倍地にお
   いて培養し、得られた培養物から高いプロテアー
   ゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有する
   融合２倍体株を選抜すること、およびここに選抜
   された融合２倍体株を紫外線照射により安定化さ
   せた後人口変異処理をすることを特徴とする、ア
   スペルギルス・ソーヤに属する菌株であつて、前
   記安定化させた融合２倍体株よりも高いプロテア
   ーゼ生産能及び高いグルタミナーゼ生産能を有す
   る麹菌の育種法。 ２ 麹菌が、アスペルギルス・ソーヤＤ−78Mで
   ある特許請求の範囲第１項に記載の麹菌の育種
   法。