JP3176842B2 - 新規な醸造用酵母 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サッカロミセス・セレ
ビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）に属し、フェルラ酸脱炭酸酵素を有する新規醸
造用酵母、すなわちサッカロミセス・セレビシエＴＳＨ
−１（生工研菌寄第１５４２２号）に関する。

【０００２】

【従来の技術】泡盛は、米麹を原料に常圧蒸留を行った
沖縄特産の焼酎で、その長期貯蔵酒はクースと呼ばれ、
独特の甘い芳香を有する。この甘い芳香を放つ成分は、
近年の研究によりバニリンであることが明らかにされて
いる。泡盛中のバニリンは、そして以下に述べる生成メ
カニズムにより生成されることが知られている。すなわ
ち、原料である米の細胞壁を構成するアラビノキシラン
とエステル結合したフェルラ酸が、麹菌のエステラーゼ
によってもろみ中に遊離し、このフェルラ酸が常圧蒸留
時に加熱脱炭酸されて４−ビニルグアヤコール（以下、
４−ＶＧという）となり、得られる焼酎（泡盛）中に留
出する。さらに、該焼酎（泡盛）中に含まれる該４−Ｖ
Ｇはその貯蔵中に酸化されてバニリンになる。

【０００３】一方、消費量が最も多い麦焼酎や米焼酎
（泡盛は除く）は減圧蒸留を介して製造されるものが主
流であり、これらの焼酎はクセのない香味を有する。麦
焼酎や米焼酎（泡盛は除く）のもろみ中にもフェルラ酸
は含まれているが、該フェルラ酸は不揮発性成分である
ため、飛沫留出以外にはほとんど得られる焼酎中に留出
しない。また、減圧蒸留に際しては、もろみの品温を６
０℃以下にして行うため、この程度の温度ではフェルラ
酸から４−ＶＧへの脱炭酸の反応はほとんど起こらず、
得られる麦焼酎や米焼酎（泡盛は除く）には４−ＶＧが
ほとんど含まれず、貯蔵中にバニリンが生成することも
ない。

【０００４】また、醸造用もろみ中に含まれているフェ
ルラ酸は、上述の泡盛の場合のように、加熱により脱炭
酸されて４−ＶＧに変化する以外に、該醸造用もろみ中
に含まれる酵母などの微生物がフェルラ酸脱炭酸酵素を
有する場合には、当該酵素の作用によって４−ＶＧに変
化することが知られている。しかも、４−ＶＧは揮発性
成分であるので、該４−ＶＧが焼酎醸造用もろみ中に存
在する場合には、該もろみを蒸留に付すことにより該４
−ＶＧが留出することが知られている。しかし、実用的
に使用される焼酎用酵母にはフェルラ酸脱炭酸酵素を有
する菌株はない。

【０００５】ところで、ワイン用酵母、ビール用酵母お
よびウイスキー用酵母の中にはフェルラ酸脱炭酸活性を
有するものがいくつかある。しかしそうした酵母はいず
れもクエン酸耐性が実質的にないか、あるいはあったと
しても焼酎製造に使用する酵母について要求されるほど
のクエン酸耐性はない。したがってこれらのワイン用酵
母、ビール用酵母およびウイスキー用酵母はいずれも焼
酎用酵母として使用することができないものである。さ
らにフェルラ酸脱炭酸酵素は酵素剤として市販されてい
ないので、そうしたフェルラ酸脱炭酸酵素を醸造用もろ
み中に添加することは不可能である。また、加熱以外の
方法で物理的に醸造用もろみ中のフェルラ酸を脱炭酸し
て４−ＶＧに変換する方法が考えられるが、そうした方
法は未だ開発されていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】減圧蒸留を介して製造
される麦焼酎や米焼酎（泡盛は除く）は、バニリンを含
有することはあってもその含有量は極めて少ない。この
理由は上述したように、当該麦焼酎や米焼酎（泡盛は除
く）の製造における減圧蒸留が６０℃以下の品温で行わ
れることから、フェルラ酸から４−ＶＧへの脱炭酸反応
が起こらないためである。上述したように、減圧蒸留を
介して製造される麦焼酎や米焼酎（泡盛は除く）中に仮
に比較的多量の４−ＶＧが存在する場合、当該焼酎の貯
蔵中に該４−ＶＧは酸化されてバニリンとなり、このバ
ニリンは甘味を呈し、これが焼酎の官能的評価を好まし
いものとする。ところが、上述したように従来法では、
常圧蒸留によってのみバニリンの前駆体である４−ＶＧ
を焼酎（泡盛）中に留出させることができるにすぎず、
減圧蒸留を介して製造される麦焼酎や米焼酎（泡盛は除
く）においては当該４−ＶＧを比較的多量に含有するよ
うにすることはできない。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の課
題を解決すべく、各種実験を介して、鋭意研究を重ね
た。その結果、フェルラ酸脱炭酸酵素を有し、かつ優れ
たクエン酸耐性を有する酵母を見い出すに至った。本発
明は、減圧蒸留においてもバニリンを含有する焼酎の製
造を可能にする、フェルラ酸脱炭酸酵素を有し、かつク
エン酸耐性を有する従来未知の酵母を提供することを目
的とする。

【０００８】

【発明の構成・効果】本発明により提供される、フェル
ラ酸脱炭酸酵素を有し、かつ優れたクエン酸耐性を有す
る従来未知の醸造用酵母は、下述するサッカロミセス・
セレビシエに属する菌株である。すなわち、（１）古
川、秋山の方法（古川敏郎、秋山裕一：農化、３７，３
９８（１９６３））に従ってＴＴＣ染色性試験、すなわ
ち菌体を１プレートに約２００程度となるように希釈
し、ＴＴＣ下層培地に３０℃で２日間プレート培養した
コロニーへ、ＴＴＣ寒天を溶解後４５℃程度にしてから
静かに重層し、固まった後３０℃に２〜３時間放置し、
コロニーの染色を観察したとき、ピンク色を示し、かつ
（２）溝口、藤田の方法（溝口晴彦、藤田栄信：醗工、
５９，１８５（１９８１））に従って、Ｄ．Ｃ．染色性
試験、すなわち菌体を１プレートに約２００程度となる
ように希釈し、ＴＴＣ下層培地に３０℃で２日間プレー
ト培養したコロニーへ、上層用軟寒天を溶解後４５℃程
度にしてから静かに重層し、固まった後室温に３０分放
置し、コロニーの染色を観察したとき、クリーム色を示
すことにより識別させられるサッカロミセス・セレビシ
エに属する新規酵母である。

【０００９】本発明により提供される上記新規酵母は、
下述する菌学的性質を有する。 （ａ）ＹＭ培地を用い、３０℃で２日間培養したときの
菌の形態： 栄養細胞の大きさ：４〜９μｍ 栄養細胞の形状：卵型 増殖の形態：出芽 （ｂ）ＹＭ寒天平板培地を用い、３０℃で２日間培養し
たときのコロニーの形態： 形態：円 隆起：凸円状 周縁：円滑 大きさ（直径）：２〜３ｍｍ 色調：白色で不透明 表面：円滑で光沢あり （ｃ）炭素源資化性：グルコース、ガラクトース、フル
クトース、シュクロース、マルトース、マンノース、ト
レハロース、アラビノース、ラフィノース、エタノー
ル、乳酸、α−メチルグルコシド、メレジトース、コハ
ク酸、グリセロールは資化する；セロビオース、メリビ
オース、エリスリトール、イノシトール、イヌリン、ラ
クトース、マンニトール、メリビオース、ラムノース、
リボース、サリシン、ソルビトール、スターチ、キシロ
ースは資化しない。 （ｄ）増殖阻害薬剤に対する耐性：カナバニン１００ｐ
ｐｍ存在下の寒天培地（２ｗｔ．％グルコース、０．６
７ｗｔ．％イーストナイトロジェンベース）でコロニー
を形成する。セルレニン２０ｐｐｍ存在下の寒天培地
（２ｗｔ．％グルコース、０．６７ｗｔ．％イーストナ
イトロジェンベース）でコロニーを形成しない。

【００１０】本発明者らは、フェルラ酸脱炭酸酵素（す
なわちフェルラ酸脱炭酸活性）を有し、かつ優れたクエ
ン酸耐性を有する酵母を分離すべく、サッカロミセス・
セレビシエに属する焼酎用酵母ＢＡＷ−６とビール用酵
母であるサッカロミセス・セレビシエＩＦＯ ２０１８
とを細胞融合処理し、該細胞融合処理の結果得られた菌
株の中からフェルラ酸脱炭酸活性を有し、かつ優れたク
エン酸耐性を有していて、菌学的性質が前記のＢＡＷ−
６株およびＩＦＯ ２０１８株のいずれからも明確に区
別できる、従来未知の新規な醸造用酵母を取得すること
ができた。

【００１１】以下に、本発明者らが、本発明のサッカロ
ミセス・セレビシエに属する新規酵母、すなわちＴＳＨ
−１株（生工研菌寄第１５４２２号）を見い出すに至っ
た経緯を説明する。

【００１２】１．各種酵母のフェルラ酸脱炭酸活性の検
討 一般に使用される焼酎用酵母（ＢＡＷ−６，Ｋｏ，ＭＫ
およびＳＨ−４酵母）、清酒用酵母（協会７，９，１
０，１３，６０１，７０１および９０１号酵母）、ワイ
ン用酵母（ＯＣ２およびＩＦＯ ２２６０酵母）、ビー
ル用酵母（ＩＦＯ１９５２，１９５３および２０１８酵
母）、ウイスキー用酵母（ＩＦＯ ０２３３，０２３
４，２１１４，２１１５，２１１６および２３７３酵
母）のそれぞれについてフェルラ酸脱炭酸活性測定を介
して検討を行った。当該フェルラ酸脱炭酸活性の測定
は、Ｃｈａｔｏｎｎｅｔらの方法（Ｐ．Ｃｈａｔｏｎｎ
ｅｔ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉ
ｃ．，６２，１９１−２０２（１９９３））に従って行
った。なお、上述した酵母はいずれもサッカロミセス・
セレビシエに属するものである。

【００１３】すなわち、上述した酵母のそれぞれについ
てその一白金耳を、１０ｍｌのＹＰＤ培地（２ｗｔ．％
グルコース、１ｗｔ．％酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペ
プトン）に接種して、所定の時間３０℃で振とう培養
し、培養液を得た。この際、培養液の培養時間は、前記
ＹＰＤ培地を５倍希釈したときの６６０ｎｍの吸光度が
０．４以上になるまでとした。得られた培養液を３００
０ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を捨て、酵母菌体
を得た。得られた該酵母菌体に１０ｍｌのリン酸バッフ
ァー液（０．０５Ｍ，ｐＨ６．０）を加え、懸濁後、再
び３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を捨て、
再度１０ｍｌの前記リン酸バッファー液を加え、懸濁し
懸濁液を得た。得られた懸濁液５００μｌを別の試験管
に取り、脱イオン水４．５ｍｌを加え、これにより前記
懸濁液の５倍希釈液を得、６６０ｎｍの吸光度を測定し
た。ここで得られた吸光度の値に基づいて、６６０ｎｍ
の吸光度が０．４〜０．５になるように、前記懸濁液を
脱イオン水を用いて希釈した。得られた希釈液１０ｍｌ
に１ｍｌのフェルラ酸（１ｇ／Ｌ−９５％エタノール）
を添加し、撹拌後、得られた混合液５００μｌを別の試
験管に取り、脱イオン水４．５ｍｌを加え、６６０ｎｍ
の吸光度を測定し、得られた値を該混合液の濁度とし
た。なお、ここにおける濁度は該混合液に含まれる酵母
数の度合いを示す。残りの前記混合液１０．５ｍｌを３
０℃で２時間静置培養した。かくして培養した混合液の
１．５ｍｌを、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、
得られた上清を高速液体クロマトグラフィーに供し、前
記培養後の混合液中に生成した４−ＶＧ濃度を測定し
た。この際の高速液体クロマトグラフィー分析はＨｕａ
ｎｇら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，５９（３），２２４４−２２５０，（１９９
３））の方法に従って行った。詳細には、カラムに、μ
ＢＯＮＤＡＳＰＥＲＥ Ｃ１８（３．９ｍｍ×１５ｃｍ
１００Å Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、純水：アセト
ニトリル：酢酸＝７０：３０：１の溶離液を、流速１．
２ｍｌ／分で前記カラムに通じた。４−ＶＧの検出波長
は２６０ｎｍに設定した。そして、前記培養後の混合液
中に生成した４−ＶＧ濃度の値を前記混合液の上述した
濁度の値で除し、得られた値を当該酵母のフェルラ酸脱
炭酸活性の値とした。

【００１４】以上のようにして上述した酵母のそれぞれ
のフェルラ酸脱炭酸活性を測定し、得られた結果を表１
に示す。表１に示す結果から明らかなように、一般に使
用されている焼酎用酵母（ＢＡＷ−６，Ｋｏ，ＭＫおよ
びＳＨ−４酵母）の中にはフェルラ酸脱炭酸活性を示す
ものがないことが判った。また、一般に使用されている
清酒用酵母（協会７，９，１０，１３，６０１，７０１
および９０１号酵母）についてもフェルラ酸脱炭酸活性
はほとんどか、あるいは全くないことが判った。しか
し、ワイン用酵母（ＯＣ２およびＩＦＯ ２２６０酵
母）、ビール用酵母（ＩＦＯ １９５２，１９５３およ
び２０１８酵母）およびウイスキー用酵母（ＩＦＯ ０
２３３，０２３４，２１１４，２１１５，２１１６およ
び２３７３酵母）の中には、フェルラ酸脱炭酸活性を有
するものがあった。中でも、ワイン用酵母ＩＦＯ ２２
６０、ビール用酵母ＩＦＯ １９５３、ビール用酵母Ｉ
ＦＯ２０１８は比較的高いフェルラ酸脱炭酸活性を示す
ことが判った。

【００１５】２．各種酵母のクエン酸耐性試験 上記１．において供試したそれぞれの酵母についてクエ
ン酸耐性試験を行った。すなわち、上記１．に述べた酵
母のそれぞれをＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコース、１
ｗｔ．％酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペプトン）を用い
３０℃で２日間前培養して酵母菌体を得、得られた酵母
菌体を２％クエン酸を含むＹＰＤ培地に植菌し、３０℃
で８日間静置培養を行った。この際、各酵母の増殖の指
標として、６６０ｎｍにおける吸光度（クエン酸耐性）
を観察した。観察結果を表１に示す。なお、クエン酸耐
性の評価は、培養８日目の６６０ｎｍにおける吸光度
が、１．０未満のものを−、１．０以上１．２未満のも
のを＋、１．２以上１．５未満のものを＋＋、１．５以
上のものを＋＋＋とする基準で表１に示した。表１から
明らかなように、実験に供試したそれぞれの酵母のう
ち、焼酎用酵母（ＢＡＷ−６，Ｋｏ，ＭＫおよびＳＨ−
４酵母）はクエン酸耐性が高く、中でもＢＡＷ−６株は
特に高いクエン酸耐性を示すことが判った。また、ワイ
ン用酵母（ＯＣ２およびＩＦＯ ２２６０酵母）につい
てはわずかのクエン酸耐性が認められるが、清酒用酵母
（協会７，９，１０，１３，６０１，７０１および９０
１号酵母）、ビール用酵母（ＩＦＯ １９５２，１９５
３および２０１８酵母）およびウイスキー用酵母（ＩＦ
Ｏ ０２３３，０２３４，２１１４，２１１５，２１１
６および２３７３酵母）についてはいずれもクエン酸耐
性がほとんどないかあったにしても極めて低いことが判
った。

【００１６】３．細胞融合 焼酎もろみの特徴の一つは、該焼酎もろみが焼酎麹が生
産したクエン酸を含むため、ｐＨ３〜４の酸性を呈する
ことである。そのためこうした焼酎に使用される焼酎用
酵母は、クエン酸耐性を有し、かつクエン酸酸性下でも
十分な発酵能を有する。しかし、当該焼酎用酵母はいず
れもフェルラ酸脱炭酸活性を有していないので、焼酎製
造用もろみ中のフェルラ酸は４−ＶＧに変換されない。
従って上述したように減圧蒸留を介して製造される麦焼
酎や米焼酎中（泡盛を除く）は４−ＶＧを実質的に含有
しないものである。一方、上記１．で述べたように、上
述したワイン用酵母、ビール用酵母およびウイスキー用
酵母の中にはいくつか比較的大きいフェルラ酸脱炭酸活
性を有するものがあるが（表１参照）、そうした酵母は
いずれもクエン酸耐性が実質的にないか、あるいはあっ
たとしても焼酎製造に使用する酵母について要求される
ほどのクエン酸耐性はない。そこで、上記２．におい
て、最も高いクエン酸耐性を有することの判った焼酎用
酵母ＢＡＷ−６と上記１．において最も高いフェルラ酸
脱炭酸活性を有することの判ったビール用酵母ＩＦＯ
２０１８株との細胞融合を試みた。すなわち、当該二者
の酵母を以下に述べるようにして細胞融合した。

【００１７】３−（１）親株に対するマーカーの付与 細胞融合により得られる融合株を効率的に分離するため
には、当該細胞融合に付する二者の親株（すなわち両親
株）にマーカーを付与する必要性がある。すなわち、細
胞融合処理後にマーカーを有する融合しなかった両親株
は増殖せず、そしてマーカーが相補された融合株のみが
増殖できる培地を使用することにより、該融合株のみを
選択的に分離することができる。そこで、両親株の一つ
として親株として使用する焼酎用酵母ＢＡＷ−６株にリ
ジン要求性のマーカー付与を行い、他の親株として使用
するビール用酵母ＩＦＯ ２０１８株に呼吸欠損性のマ
ーカー付与を行った。

【００１８】（イ）リジン要求性株の取得：ＢＡＷ−６
株を、ＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコース、１ｗｔ．％
酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペプトン）を用い３０℃で
２日間前培養して酵母菌体を得た。得られた培養液を別
のＹＰＤ培地１０ｍｌに植菌し、３０℃で１２時間振と
う培養し、得られた酵母菌体を３０００ｒｐｍで５分間
遠心分離して集菌し、滅菌水１０ｍｌで洗浄後、３００
０ｒｐｍで５分間遠心分離した。ここで得られた酵母菌
体をリン酸バッファー液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに懸濁
後、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）０．３ｍｌ
を添加して、３０℃で４５分間緩やかに振とうすること
により変異処理を行った。かくして変異処理した酵母菌
体を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して集菌し、これ
を５％チオ硫酸ナトリウム溶液１０ｍｌに懸濁し、得ら
れた懸濁液の４００μｌをＡＡプレート（２ｗｔ．％グ
ルコース、２ｗｔ．％イーストナイトロジェンベース、
０．２ｗｔ．％ＤＬ−α−アミノアジピン酸、Ｌ−リジ
ン塩酸塩（３０ｐｐｍ）、２ｗｔ．％寒天）に塗布し
た。得られたものを、３０℃で１週間培養し、複数個の
コロニーの出現をみた。これらのコロニーについて特に
大きなコロニー３０個を釣菌し、それぞれのコロニーを
別々に滅菌水に懸濁してそれぞれの懸濁液を得た。

【００１９】得られたそれぞれの該懸濁液を、ＳＤプレ
ート（２ｗｔ．％グルコース、０．６７ｗｔ．％イース
トナイトロジェンベース、２ｗｔ．％寒天）とＳＤ＋Ｌ
ｙｓプレート（２ｗｔ．％グルコース、０．６７ｗｔ．
％イーストナイトロジェンベース、Ｌ−リジン塩酸塩
（３０ｐｐｍ）、２ｗｔ．％寒天）に接種（スタンプ）
した。得られたもののそれぞれを、３０℃で１週間培養
し、該ＳＤプレート上で出現せず、ＳＤ＋Ｌｙｓプレー
ト上で出現した１０個のコロニー（すなわちＬｙｓ^-−
１，２，３，４，５，６，７，８，９および１０）を目
的とするリジン要求性株とした。

【００２０】（ロ）クエン酸耐性によるリジン要求性株
のスクリーニング：上記（イ）において得たリジン要求
性株（Ｌｙｓ^-−１〜Ｌｙｓ^-−１０）のそれぞれの株に
ついてクエン酸耐性試験を行った。すなわち、リジン要
求性株（Ｌｙｓ^-−１〜Ｌｙｓ^-−１０）のそれぞれをＹ
ＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコース、１ｗｔ．％酵母エキ
ス、２ｗｔ．％ポリペプトン）を用い３０℃で２日間前
培養して酵母菌体を得、得られた酵母菌体を、２％クエ
ン酸を含むＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で８日間静置培
養を行った。この際、各酵母の増殖の指標として、培養
８日目の６６０ｎｍにおける吸光度（クエン酸耐性）を
観察した。観察結果を表２に示す。表２から明らかなよ
うに上記（イ）において得たＢＡＷ−６を親株とするリ
ジン要求性株（Ｌｙｓ^-−１〜Ｌｙｓ^-−１０）のうち、
最も高いクエン酸耐性を示したＬｙｓ^-−５をＢＡＷ−
６のリジン要求性株として選抜した。

【００２１】（ハ）呼吸欠損株の取得：ＩＦＯ ２０１
８株を、ＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコース、１ｗｔ．
％酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペプトン）を用い３０℃
で２日間前培養して酵母菌体を得た。得られた酵母菌体
を別のＹＰＤ培地１０ｍｌに植菌し、３０℃で１２時間
振とう培養し培養液を得た。得られた培養液の１００μ
ｌを滅菌水１０ｍｌに懸濁して懸濁液を得、得られた懸
濁液の１００μｌをさらに、アクリフラビン液体培地
（０．１ｗｔ．％リン酸二水素カリウム、０．１５ｗ
ｔ．％硫酸アンモニウム、０．０５ｗｔ．％硫酸マグネ
シウム七水和物、０．１８ｗｔ．％ポリペプトン、０．
２ｗｔ．％酵母エキス、２ｗｔ．％グルコース、３ｐｐ
ｍ．アクリフラビン）２ｍｌに植菌した。得られたもの
を３０℃で４日間培養後、１プレートに出現するコロニ
ーの数が約２００程度となるように前記アクリフラビン
液体培地を希釈し、ＴＴＣ下層培地のプレートに塗布し
た。これを３０℃で２日間培養して、約２００個のコロ
ニーの出現をみた。出現したコロニーのすべてについて
ＴＴＣ染色を行い、白色を呈した５個のコロニーを釣菌
し、それらコロニーのそれぞれを別々に滅菌水に懸濁し
てそれぞれの懸濁液を得た。得られたそれぞれの該懸濁
液、ＳＤプレート（２ｗｔ．％グルコース、０．６７ｗ
ｔ．％イーストナイトロジェンベース、２ｗｔ．％寒
天）とＳＤ＋Ｇｌｙプレート（２ｗｔ．％グルコース、
０．６７ｗｔ．％イーストナイトロジェンベース、２ｗ
ｔ．％グリセロール、２ｗｔ．％寒天）に接種（スタン
プ）した。得られたもののそれぞれを、３０℃で１週間
培養し、コロニーが該ＳＤプレート上で出現し、ＳＤ＋
Ｇｌｙプレート上で出現しなかった株を３株得、該３株
を目的とする呼吸欠損株（ρ^-−１，ρ^-−２およびρ^-
−３）として取得した。

【００２２】（ニ）フェルラ酸脱炭酸活性による呼吸欠
損株のスクリーニング：上記（ハ）で得られた３つの呼
吸欠損株（ρ^-−１，ρ^-−２およびρ^-−３）について
フェルラ酸脱炭酸活性の程度を調べるために以下の実験
を行った。フェルラ酸脱炭酸活性の測定は、Ｃｈａｔｏ
ｎｎｅｔらの方法（Ｐ．Ｃｈａｔｏｎｎｅｔ ｅｔ ａ
ｌ．：Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．，６２，１
９１−２０２（１９９３））に従って行った。

【００２３】すなわち、上記３つの呼吸欠損株（ρ^-−
１，ρ^-−２およびρ^-−３）のそれぞれについて、その
一白金耳を、１０ｍｌのＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコ
ース、１ｗｔ．％酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペプト
ン）に接種して、３０℃で所定時間振とう培養し、培養
液を得た。この際の、培養時間は、前記ＹＰＤ培地を５
倍希釈したときの６６０ｎｍの吸光度が０．４以上にな
るまでとした。得られた培養液を３０００ｒｐｍで１５
分間遠心分離し、上清を捨て、酵母菌体を得た。得られ
た該酵母菌体に１０ｍｌのリン酸バッファー液（０．０
５Ｍ，ｐＨ６．０）を加え、懸濁後、再び３０００ｒｐ
ｍで１５分間遠心分離し、上清を捨て、再度１０ｍｌの
前記リン酸バッファー液を加え、懸濁し懸濁液を得た。
得られた懸濁液５００μｌを別の試験管に取り、脱イオ
ン水４．５ｍｌを加え、これにより前記懸濁液の５倍希
釈液を得、６６０ｎｍの吸光度を測定した。ここで得ら
れた吸光度の値に基づいて、６６０ｎｍの吸光度が０．
４〜０．５になるように、前記懸濁液を脱イオン水を用
いて希釈した。得られた希釈液１０ｍｌに１ｍｌのフェ
ルラ酸（１ｇ／Ｌ−９５％エタノール）を添加し、撹拌
して混合液を得た。得られた混合液５００μｌを別の試
験管に取り、脱イオン水４．５ｍｌを加え、６６０ｎｍ
の吸光度を測定し、得られた値を該混合液の濁度とし
た。なお、ここにおける濁度は該混合液に含まれる酵母
数の度合いを示す。残りの前記混合液１０．５ｍｌを３
０℃で２時間静置培養した。かくして培養した混合液の
１．５ｍｌを、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、
得られた上清を高速液体クロマトグラフィーに供し、前
記培養後の混合液中に生成した４−ＶＧ濃度を測定し
た。

【００２４】この際の高速液体クロマトグラフィー分析
はＨｕａｎｇら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，５９（３），２２４４−２２５０，（１
９９３））の方法に従って行った。詳細には、カラム
に、μＢＯＮＤＡＳＰＥＲＥＣ１８（３．９ｍｍ×１５
ｃｍ １００Å Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、純水：ア
セトニトリル：酢酸＝７０：３０：１の溶離液を、流速
１．２ｍｌ／分で前記カラムに通じた。４−ＶＧの検出
波長は２６０ｎｍに設定した。そして、前記培養後の混
合液中に生成した４−ＶＧ濃度の値を前記混合液の上述
した濁度の値で除し、得られた値を当該酵母のフェルラ
酸脱炭酸活性の値とした。３つの表３に得られたフェル
ラ酸脱炭酸活性の測定結果を示す。表３に示した結果に
基づいて、当該３つの呼吸欠損株（ρ^-−１，ρ^-−２お
よびρ^-−３）のうち、最も高いフェルラ酸脱炭酸活性
を示した呼吸欠損株ρ^-−２をＩＦＯ２０１８株の呼吸
欠損株として取得した。

【００２５】３−（２）．プロトプラスト融合 上記３−（１）−（ロ）で得たＢＡＷ−６株のリジン要
求性株Ｌｙｓ^-−５と上記３−（２）−（ニ）で得たＩ
ＦＯ ２０１８株の呼吸欠損株ρ^-−２のそれぞれを、
以下の方法に従ってプロトプラスト融合を行った。すな
わちＬｙｓ^-−５株とρ^-−２株のそれぞれの一白金耳
を、ＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコース、１ｗｔ．％酵
母エキス、２ｗｔ．％ポリペプトン）１０ｍｌに植菌
し、３０℃で２０時間静置培養して培養液を得た。得ら
れた培養液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得ら
れた酵母菌体をトリス塩酸バッファー液（ｐＨ７．５）
１０ｍｌを用いて洗浄し、３０００ｒｐｍで５分間遠心
分離した。上清を捨て、得られた酵母菌体を０．６Ｍ
ＫＣｌと０．２％ ２−メルカプトエタノールを含む溶
液１０ｍｌに懸濁し、３０℃で３０分間振とう後、０．
２％ ２−メルカプトエタノール、０．６Ｍ ＫＣｌお
よび１ｍｇ／ｍｌ Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ（細胞
壁溶解酵素）を含むトリス塩酸バッファー液（ｐＨ７．
５）１０ｍｌを加え、３５℃で２時間振とう処理し、Ｌ
ｙｓ^-−５株とρ^-−２株のそれぞれについてプロトプラ
ストを得た。得られたそれぞれのプロトプラストは２０
００ｒｐｍで５分間遠心分離後、０．６Ｍ ＫＣｌを含
むトリス塩酸バッファー液（ｐＨ７．５）１０ｍｌを用
いて２回洗浄後、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、
上清を捨て、５ｍｌの同バッファー液に懸濁しプロトプ
ラスト液を得た。

【００２６】得られた二者のプロトプラスト液のそれぞ
れの５ｍｌを混合して混合液を得、２０００ｒｐｍで５
分間遠心分離し、上清を捨て酵母菌体を得た。得られた
酵母菌体に、５０ｍＭ塩化カルシウムを含む３５％ＰＥ
Ｇ−４０００溶液５ｍｌを加え、３０℃で１５分間静置
後、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、
酵母菌体を得た。得られた酵母菌体を、０．６Ｍ ＫＣ
ｌを含む０．１Ｍトリス塩酸バッファー液（ｐＨ７．
５）１０ｍｌに懸濁し、得られた懸濁液の１００μｌを
ＳＤ＋Ｇｌｙプレート（２ｗｔ．％グルコース、０．６
７ｗｔ．％イーストナイトロジェンベース、２ｗｔ．％
グリセロール、２ｗｔ．％寒天）に塗布した。次いで該
ＳＤ＋Ｇｌｙプレートと同一組成の培地を用意し、品温
を４５℃程度に調整してから、これを前記ＳＤ＋Ｇｌｙ
プレートに静かに５ｍｌ重層し、得られたものを３０℃
で４日間培養し、２０個のコロニーの出現をみた。かく
して２０個のコロニーすなわち２０個の細胞融合酵母
（ＴＳＨ−１〜２０）を得た。

【００２７】４．有用菌株のスクリーニング ４−（１）．細胞融合株のフェルラ酸脱炭酸活性の測定 得られた上記２０の細胞融合酵母（ＴＳＨ−１〜２０）
のそれぞれについてフェルラ酸脱炭酸活性の有無を調べ
るために以下の実験を行った。フェルラ酸脱炭酸活性の
測定は、、Ｃｈａｔｏｎｎｅｔらの方法（Ｐ．Ｃｈａｔ
ｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａ
ｇｒｉｃ．，６２，１９１−２０２（１９９３））に従
って行った。

【００２８】すなわち、上記２０株の細胞融合酵母（Ｔ
ＳＨ−１〜２０）のそれぞれについて、その一白金耳
を、１０ｍｌのＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコース、１
ｗｔ．％酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペプトン）に接種
して、３０℃で所定時間振とう培養し、培養液を得た。
この際の、培養時間は、前記ＹＰＤ培地を５倍希釈した
ときの６６０ｎｍの吸光度が０．４以上になるまでとし
た。得られた培養液を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分
離し、上清を捨て、酵母菌体を得た。得られた該酵母菌
体に１０ｍｌのリン酸バッファー液（０．０５Ｍ，ｐＨ
６．０）を加え、懸濁後、再び３０００ｒｐｍで１５分
間遠心分離し、上清を捨て、再度１０ｍｌの前記リン酸
バッファー液を加え、懸濁し懸濁液を得た。得られた懸
濁液５００μｌを別の試験管に取り、脱イオン水４．５
ｍｌを加え、これにより前記懸濁液の５倍希釈液を得、
６６０ｎｍの吸光度を測定した。ここで得られた吸光度
の値に基づいて、６６０ｎｍの吸光度が０．４〜０．５
になるように、前記懸濁液を脱イオン水を用いて希釈し
た。得られた希釈液１０ｍｌに１ｍｌのフェルラ酸（１
ｇ／Ｌ−９５％エタノール）を添加し、撹拌して混合液
を得た。得られた混合液５００μｌを別の試験管に取
り、脱イオン水４．５ｍｌを加え、６６０ｎｍの吸光度
を測定し、得られた値を該混合液の濁度とした。なお、
ここにおける濁度は該混合液に含まれる酵母数の度合い
を示す。残りの前記混合液１０．５ｍｌを３０℃で２時
間静置培養した。かくして培養した混合液の１．５ｍｌ
を、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた上
清を高速液体クロマトグラフィーに供し、前記培養後の
混合液中に生成した４−ＶＧ濃度を測定した。この際の
高速液体クロマトグラフィー分析はＨｕａｎｇら（Ａｐ
ｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９
（３），２２４４−２２５０，（１９９３））の方法に
従って行った。

【００２９】詳細には、カラムに、μＢＯＮＤＡＳＰＥ
ＲＥ Ｃ１８（３．９ｍｍ×１５ｃｍ １００Å Ｗａ
ｔｅｒｓ社製）を用い、純水：アセトニトリル：酢酸＝
７０：３０：１の溶離液を、流速１．２ｍｌ／分で前記
カラムに通じた。４−ＶＧの検出波長は２６０ｎｍに設
定した。そして、前記培養後の混合液中に生成した４−
ＶＧ濃度の値を前記混合液の上述した濁度の値で除し、
得られた値を当該酵母のフェルラ酸脱炭酸活性の値とし
た。２０株の細胞融合酵母（ＴＳＨ−１〜２０）のフェ
ルラ酸脱炭酸活性の測定結果を表４に示す。表４に示し
た結果に基づいて、当該２０の細胞融合酵母のうち、特
にフェルラ酸脱炭酸活性の高い細胞融合酵母４株（ＴＳ
Ｈ−１，ＴＳＨ−２，ＴＳＨ−５，ＴＳＨ−６）を選抜
した。

【００３０】４−（２）．クエン酸耐性の検討 上記４−（１）．で選抜した４つの細胞融合酵母（ＴＳ
Ｈ−１，ＴＳＨ−２，ＴＳＨ−５，ＴＳＨ−６）につい
てクエン酸耐性試験を行った。すなわち、当該４つの細
胞融合酵母のそれぞれをＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコ
ース、１ｗｔ．％酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペプト
ン）を用い３０℃で２日間前培養して酵母菌体を得、得
られた酵母菌体を２％クエン酸を含むＹＰＤ培地に植菌
し、３０℃で８日間静置培養を行った。この際、各酵母
の増殖の指標として、６６０ｎｍにおける吸光度（クエ
ン酸耐性）の経時変化を観察した。その結果を図１に示
す。図１に示す結果から、前記４つの細胞融合酵母は、
いずれもＩＦＯ ２０１８株より高く、しかもＢＡＷ−
６株より低いクエン酸耐性を示したが、その中でも特に
ＢＡＷ−６株のクエン酸耐性に酷似した菌株ＴＳＨ−１
を選抜した。

【００３１】５．菌学的性質 上記４．において分離した菌株ＴＳＨ−１が、親菌株の
ＢＡＷ−６およびＩＦＯ ２０１８のいずれからも明確
に識別されるものであるか否かを見極めるため、菌学的
性質（形態学的性質および生理学的性質）の異同につい
て以下の検討を行った。

【００３２】５−（１）．形態学的性質 ＹＭ寒天培地（１ｗｔ．％グルコース、０．３ｗｔ．％
酵母エキス、０．５ｗｔ．％ポリペプトン、０．３ｗ
ｔ．％麦芽エキス、２ｗｔ．％寒天）を用い、菌株ＴＳ
Ｈ−１、親菌株のＢＡＷ−６およびＩＦＯ ２０１８の
それぞれの菌体を３０℃の温度で２日間培養し、得られ
たものについて光学顕微鏡で観察した。観察結果を表５
にまとめて示した。表５から明らかなように、いずれの
菌体の栄養細胞もその大きさは４〜９μｍで卵型であ
り、また、ＹＭ寒天培地上ではいずれの菌株もつやのあ
る白色のコロニーを形成することが判った。

【００３３】５−（２）．生理学的性質 ａ．炭素源資化性 菌株ＴＳＨ−１、親菌株のＢＡＷ−６およびＩＦＯ ２
０１８のそれぞれについて、固体培地を使用するレプリ
カ法によって炭素源資化性を試験した。すなわち、表６
に示すそれぞれの炭素化合物を１ｗｔ．％含有するバク
ト社製炭素源資化テスト用培地を用意し、それぞれの寒
天平板に前記菌株を接種（スタンプ）し、３０℃で培養
して炭素源資化性を観察した。炭素源資化性の観察結果
を表６にまとめて示した。表６に示した結果より次のこ
とが判った。すなわち、ＴＳＨ−１株は、親株であるＢ
ＡＷ−６株およびＩＦＯ ２０１８株のいずれからも次
の点で明らかに異なる。すなわち、ＴＳＨ−１株はメレ
ジトースを資化するが、ＢＡＷ−６株は資化しない；ま
た、ＴＳＨ−１株およびＢＡＷ−６株はグリセロールお
よび乳酸を資化するが、ＩＦＯ ２０１８株はこれらを
資化しない。

【００３４】ｂ．増殖阻害物質に対する耐性 菌株ＴＳＨ−１、親菌株のＢＡＷ−６およびＩＦＯ ２
０１８について、固体培地を使用するレプリカ法によっ
て増殖阻害物質に対する耐性を試験した。すなわち、
０，１０，２０および３０ｐｐｍ濃度のセルレニンと、
０，１０，２０および１００ｐｐｍ濃度のカナバニンを
含有するそれぞれのＳＤプレート（２ｗｔ．％グルコー
ス、０．６７ｗｔ．％イーストナイトロジェンベース、
２ｗｔ．％寒天）に前記菌株を接種（スタンプ）し、３
０℃で培養し、増殖の有無を観察した。得られた観察結
果を表７および表８に示した。表７および表８に示した
結果から次のことが判った。すなわち、ＢＡＷ−６株は
いずれもセルレニン濃度２０ｐｐｍで増殖するのに対
し、ＩＦＯ ２０１８株およびＴＳＨ−１株はセルレニ
ン存在下では増殖しない；ＢＡＷ−６株は、カナバニン
存在下では増殖しないのに対して、ＩＦＯ ２０１８株
はカナバニン濃度２０ｐｐｍまで増殖し、ＴＳＨ−１株
はカナバニン濃度１００ｐｐｍまで増殖する。

【００３５】ｃ．ＴＴＣ染色性 古川、秋山の方法（古川ら：農化、３７，３９８−（１
９６３））に従って試験した。すなわち、ＢＡＷ−６
株、ＩＦＯ ２０１８株、ＴＳＨ−１株の３種のそれぞ
れの菌体を１プレートに約２００程度となるように希釈
し、下層培地に３０℃で２日間プレート培養したコロニ
ー上へ、ＴＴＣ寒天を溶解後４５℃程度にしてから静か
に重層し、固まった後３０℃で２〜３時間放置し、コロ
ニーの染色状況を観察した。表５にＴＴＣ染色性の観察
結果を示した。表５に示した結果から明らかなように、
ＢＡＷ−６株、ＩＦＯ ２０１８株、ＴＳＨ−１株とも
いずれもピンクであった。

【００３６】ｄ．Ｄ．Ｃ．染色性 溝口、藤田の方法（溝口ら：醗酵工学、５９，１８５−
１８８（１９８１））に従って試験した。すなわち、Ｂ
ＡＷ−６株、ＩＦＯ ２０１８株、ＴＳＨ−１株のそれ
ぞれの菌体を１プレートに約２００程度となるように希
釈し、下層培地に３０℃で２日間プレート培養したコロ
ニー上へ、上層用軟寒天を溶解後４５℃程度にしてから
静かに重層し、固まった後室温に３０分間放置し、コロ
ニーの染色状況を観察した。表５にＤ．Ｃ．染色性の観
察結果を示した。表５に示した結果から明らかなよう
に、ＢＡＷ−６株は白色、ＩＦＯ ２０１８株は茶色で
あったが、ＴＳＨ−１株はクリーム色であった。

【００３７】以上の菌学的性質の観察結果から、次のこ
とがわかった。すなわち、本菌ＴＳＨ−１株は、（ｉ）
メレジトースの資化性について、ＢＡＷ−６株と異な
る；グリセロールおよび乳酸の資化性について、ＩＦＯ
２０１８株と異なる；（ｉｉ）カナバニンに対する耐
性について、親菌株であるＢＡＷ−６株およびＩＦＯ２
０１８株と異なる；（ｉｉｉ）Ｄ．Ｃ．染色性につい
て、親菌株であるＢＡＷ−６株およびＩＦＯ ２０１８
株と異なる。さらに２０代にわたる本菌ＴＳＨ−１株の
継代培養を行ったところ、上記（ｉ），（ｉｉ）および
（ｉｉｉ）の性質は維持された。従って上述したＴＳＨ
−１株についての上記（ｉ），（ｉｉ）および（ｉｉ
ｉ）の性質は、ＴＳＨ−１株に特有の確定的なものであ
ることが判った。よって、本菌すなわち、ＴＳＨ−１株
は、従来の酵母から客観的に区別されるものであること
が判明し、本発明者らはこれを新菌と認定し、この菌株
をＴＳＨ−１と命名した。本菌株は、平成８年２月２日
に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、ＴＳＨ
−１は生工研菌寄第１５４２２号なる受託番号を得た。

【００３８】

【使用例】本発明の酵母ＴＳＨ−１（生工研菌寄第１５
４２２号）を使用して大麦焼酎を製造した。原料として
大麦（７０％精白）を用い、以下に述べる手法で大麦製
焼酎を製造した。 酵母の前培養：前記酵母（ＴＳＨ−１株）を、１０ｍｌ
の２ｗｔ．％ＹＥＰＤ培地において、３０℃で２日間、
前培養した。 大麦麹の作成：１００ｇの大麦を４０％（Ｗ／Ｗ）吸水
させ、４０分間蒸した後、２５℃まで放冷し、０．１ｇ
の種麹（焼酎白麹菌）を接種し、３８℃，相対湿度（Ｒ
Ｈ）９５％で２４時間、３２℃，ＲＨ９２％で２０時間
培養して大麦麹を得た。 蒸麦の作成：２００ｇの大麦を４０％（Ｗ／Ｗ）吸水さ
せ、４０分間蒸した後、２５℃まで放冷して蒸麦を得
た。１次仕込みは、上記大麦麹に前培養した酵母を加
え、さらに水１２０ｍｌを加えて１次もろみを得た。得
られた１次もろみを１段目の５日間の発酵に付した。ま
た２次仕込みは上記１段目の発酵を終えた１次もろみ
に、上記蒸麦と水３８０ｍｌを加えて２次もろみを得
た。得られた２次もろみを２段目の１０日間の発酵に付
した。発酵温度は、１次仕込み、２次仕込みとも２５℃
とした。上記２段目の発酵を終えた２次もろみの一部を
以下に述べる分析に供し、残りを常法により単式蒸留に
付した。

【００３９】

【比較例１】使用例において、醸造用酵母としてＩＦＯ
２０１８を用いた以外は、使用例と同様にして、１次
および２次もろみを得、得られた２次もろみを単式蒸留
に付して大麦焼酎を製造した。なお、以下に述べる分析
には、２段目の発酵を終えた２次もろみの一部を供し
た。

【００４０】

【比較例２】使用例において、醸造用酵母としてＢＡＷ
−６を用いた以外は、使用例と同様にして、１次および
２次もろみを得、得られた２次もろみを単式蒸留に付し
て大麦焼酎を製造した。なお、以下に述べる分析には、
２段目の発酵を終えた２次もろみの一部を供した。

【００４１】

【評価】

（１）発酵曲線 上記使用例、比較例１および比較例２における大麦焼酎
製造における発酵曲線を、仕込み容器を含めた重量を毎
日測定して炭酸ガスの減少量を求めることにより調べ
た。得られた発酵曲線を図２に示した。当該発酵曲線か
ら、本発明酵母ＴＳＨ−１株の発酵状態はＩＦＯ ２０
１８株のそれよりも明らかに良好で、ＢＡＷ−６株のそ
れと実質的に同じであることが理解される。

【００４２】（２）２次もろみのエタノール濃度 使用例、比較例１および比較例２において得られた２次
もろみのエタノール濃度を浮ひょう法（国税庁所定分析
法注解）に従って測定した。該２次もろみのエタノール
濃度を表９に示した。表９に示した結果から、ＴＳＨ−
１株を用いたものはＩＦＯ ２０１８株を用いたものよ
りエタノール濃度が０．６％高く、ＢＡＷ−６株と実質
的に同じであることが理解される。

【００４３】（３）２次もろみの４−ＶＧ濃度 使用例、比較例１および比較例２において得られた２次
もろみの４−ＶＧの濃度を小関らの方法（小関ら：醸
協，８９，４０８−４１１（１９９４））に従って測定
した。すなわち、該２次もろみ約１００ｍｌをガーゼろ
過し、そのろ液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、
上清を得た。得られた上清をろ紙（ＮＯ．５Ｃ）でろ過
して、ろ液を得た。該ろ液を５０ｍｌ測りとり、１０，
０００ｐｐｍアニス酸（和光純薬工業社製，特級）溶液
１５０μｌを内部標準として添加し、０．４Ｍトリクロ
ロ酢酸（和光純薬工業社製，特級）水溶液５０ｍｌを加
え混合液を得た。該混合液を３０分間、室温で撹拌後、
３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を得た。該上
清を高速液体クロマトグラフィーに供して、４−ＶＧ濃
度を定量した。前記高速液体クロマトグラフィー分析は
小関ら（醸造協会誌，８９（５），４０８−４１１（１
９９４））の方法に従って行った。すなわち、カラムは
μＢＯＮＤＡＳＰＥＲＥ Ｃ１８（３．９ｍｍ×１５ｃ
ｍ １００ÅＷａｔｅｒｓ社製）を用い、６０分間で５
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）／アセトニトリル（９
５／５）から５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）／アセ
トニトリル（３５／６５）までのリニアグラジエントに
よる溶出条件で、溶離液を上記カラムに通じ、４−ＶＧ
の検出波長は２８０ｎｍに設定した。該２次もろみの４
−ＶＧの濃度を表９に示した。表９に示した結果から、
ＴＳＨ−１株を用いたものはＢＡＷ−６株を用いたもの
より２次もろみの４−ＶＧ濃度が約３０倍多いことが理
解される。

【００４４】（４）２次もろみの香気成分 使用例、比較例１および比較例２において得られた２次
もろみの香気成分をヘッドスペースガス分析法により分
析した。該２次もろみの香気成分を表１０に示した。表
１０に示した結果から、ＴＳＨ−１株を用いたものは、
ＢＡＷ−６株を用いたものよりも、酢酸イソアミルが約
１．６倍多く、イソアミルアルコールなどの高級アルコ
ールも１．３〜１．５倍多いことが理解される。以上述
べたことからも明らかなように、本発明の酵母ＴＳＨ−
１株は、従来の焼酎酵母とは明らかに異なり、フェルラ
酸脱炭酸酵素を有し、かつ優れたクエン酸耐性を有する
菌株で、もろみ中に高濃度の４−ＶＧを与えることがで
きるものであることが判った。

【００４５】

【表１】

【００４６】

【表２】

【００４７】

【表３】

【００４８】

【表４】

【００４９】

【表５】

【００５０】

【表６】

【００５１】

【表７】

【００５２】

【表８】

【００５３】

【表９】

【００５４】

【表１０】

【００５５】

【発明効果の概要】フェルラ酸脱炭酸酵素を有し、かつ
優れたクエン酸耐性を有する新規な醸造用酵母。

【図面の簡単な説明】

【図１】クエン酸耐性試験における、酵母の増殖の経時
変化を示すグラフである。

【図２】大麦焼酎の製造における発酵状態を示す発酵曲
線である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 下田 雅彦 大分県宇佐市大字山本2231−１ 三和酒 類株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/16 - 1/19 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】焼酎酵母BAW−６株とビール酵母ＩＦＯ
   ２０１８株とを使用し、プロトプラスト融合し、スクリ
   ーニングを行うことにより得られた、フェルラ酸脱炭酸
   酵素活性を有し且つクエン酸耐性を有するサッカロミセ
   ス・セレビシエに属する醸造用酵母ＴＳＨ−１．
2. 【請求項２】下記の菌学的性質を示す請求項１に記載の
   醸造用酵母ＴＳＨ−１。（１）ＴＴＣ染色性試験、すな
   わち菌体を１プレートに約２００程度となるように希釈
   し、ＴＴＣ下層培地に３０℃で２日間プレート培養した
   コロニーへ、ＴＴＣ寒天を溶解後４５℃程度にしてから
   静かに重層し、固まった後３０℃に２〜３時間放置し、
   コロニーの染色を観察したとき、ピンク色を示し、且つ
   （２）Ｄ．Ｃ．染色性試験、すなわち菌体を１プレート
   に約２００程度となるように希釈し、ＴＴＣ下層培地に
   ３０℃で２日間プレート培養したコロニーへ、上層用軟
   寒天を溶解後４５℃程度にしてから静かに重層し、固ま
   った後室温に３０分放置し、コロニーの染色を観察した
   とき、クリーム色を示す。
3. 【請求項３】下記の菌学的性質を示す請求項１に記載の
   醸造用酵母ＴＳＨ−１。 （ａ）ＹＭ培地を用い、３０℃で２日間培養したときの
   菌の形態： 栄養細胞の大きさ：４〜９μｍ 栄養細胞の形状：卵型 増殖の形態：出芽 （ｂ）ＹＭ寒天平板培地を用い、３０℃で２日間培養し
   たときのコロニーの形態： 形態：円 隆起：凸円状 周縁：円滑 大きさ（直径）：２〜３ｍｍ 色調：白色で不透明 表面：円滑で光沢あり （ｃ）炭素源資化性： グルコース、ガラクトース、フルクトース、シュクロ
   ース、マルトース、マンノース、トレハロース、アラビ
   ノース、ラフィノース、エタノール、乳酸、α−メチル
   グルコシド、メレジトース、コハク酸、及びグリセロー
   ルは資化する； セロビオース、メリビオース、エリスリトール、イノ
   シトール、イヌリン、ラクトース、マンニトール、メリ
   ビオース、ラムノース、リボース、サリシン、ソルビト
   ール、スターチ、及びキシロースは資化しない。 （ｄ）増殖阻害薬剤に対する耐性： カナバニン１００ｐｐｍ存在下の寒天培地（２ｗｔ．％
   グルコース、０．６７ｗｔ．％イーストナイトロジェン
   ベース）でコロニーを形成するが、セルレニン２０ｐｐ
   ｍ存在下の寒天培地（２ｗｔ．％グルコース、０．６７
   ｗｔ．％イーストナイトロジェンベース）でコロニーを
   形成しない。
4. 【請求項４】 生工研菌寄第１５４２２号である請求項
   １に記載の醸造用酵母ＴＳＨ−１。