JP3090613B2 - 蒸留酒の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フェルラ酸脱炭酸活性
を有するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する新規醸
造用酵母、すなわち、サッカロミセス・セレビシエＴＳ
Ｈ−１（生工研菌寄第１５４２２号）を使用する蒸留酒
の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】泡盛は、米麹を原料に常圧蒸留を行った
沖縄特産の焼酎で、その長期貯蔵酒はクースと呼ばれ、
独特の甘い芳香を有する。この甘い芳香を放つ成分は、
近年の研究によりバニリンであることが明らかにされて
いる。泡盛中のバニリンは、そして以下に述べる生成メ
カニズムにより生成されることが知られている。すなわ
ち、原料である米の細胞壁を構成するアラビノキシラン
とエステル結合したフェルラ酸が、麹菌のエステラーゼ
によってもろみ中に遊離し、このフェルラ酸が常圧蒸留
時に加熱脱炭酸されて４−ビニルグアヤコール（以下、
４−ＶＧという）となり、得られる焼酎（泡盛）中に留
出する。さらに、該焼酎（泡盛）中に含まれる該４−Ｖ
Ｇはその貯蔵中に酸化されてバニリンになる。

【０００３】一方、消費量が最も多い麦焼酎や米焼酎
（泡盛は除く）は減圧蒸留を介して製造されるものが主
流であり、これらの焼酎はクセのない香味を有する。麦
焼酎や米焼酎（泡盛は除く）のもろみ中にもフェルラ酸
は含まれているが、該フェルラ酸は不揮発性成分である
ため、飛沫留出以外にはほとんど得られる焼酎中に留出
しない。また、減圧蒸留に際しては、もろみの品温を６
０℃以下にして行うため、この程度の温度ではフェルラ
酸から４−ＶＧへの脱炭酸の反応はほとんど起こらず、
得られる麦焼酎や米焼酎（泡盛は除く）には４−ＶＧが
ほとんど含まれず、貯蔵中にバニリンか生成することも
ない。また、醸造用もろみ中に含まれているフェルラ酸
は、上述の泡盛の場合のように、加熱により脱炭酸され
て４−ＶＧに変化する以外に、該醸造用もろみ中に含ま
れる酵母などの微生物がフェルラ酸脱炭酸酵素を有する
場合には、当該酵素の作用によって４−ＶＧに変化する
ことが知られている。しかも、４−ＶＧは揮発性成分で
あるので、該４−ＶＧが焼酎醸造用もろみ中に存在する
場合には、該もろみを蒸留に付すことにより該４−ＶＧ
が留出することが知られている。しかし、実用的に使用
される焼酎用酵母にはフェルラ酸脱炭酸酵素を有する菌
株はない。ところで、ワイン用酵母、ビール用酵母およ
びウイスキー用酵母の中にはフェルラ酸脱炭酸活性を有
するものがいくつかある。しかしそうした酵母はいずれ
もクエン酸耐性が実質的にないか、あるいはあったとし
ても焼酎製造に使用する酵母について要求されるほどの
クエン酸耐性はない。したがってこれらのワイン用酵
母、ビール用酵母およびウイスキー用酵母はいずれも焼
酎用酵母として使用することができないものである。

【０００４】さらにフェルラ酸脱炭酸酵素は酵素剤とし
て市販されていないので、そうしたフェルラ酸脱炭酸酵
素を醸造用もろみ中に添加することは不可能である。ま
た、加熱以外の方法で物理的に醸造用もろみ中のフェル
ラ酸を脱炭酸して４−ＶＧに変換する方法が考えられる
が、そうした方法は未だ開発されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】減圧蒸留を介して製造
される麦焼酎や米焼酎（泡盛は除く）は、バニリンを含
有することはあってもその含有量は極めて少ない。この
理由は上述したように、当該麦焼酎や米焼酎（泡盛は除
く）の製造における減圧蒸留が６０℃以下の品温で行わ
れることから、フェルラ酸から４−ＶＧへの脱炭酸反応
が起こらないためである。上述したように、減圧蒸留を
介して製造される麦焼酎や米焼酎（泡盛は除く）中に仮
に比較的多量の４−ＶＧが存在する場合、当該焼酎の貯
蔵中に該４−ＶＧは酸化されてバニリンとなり、このバ
ニリンは甘味を呈し、これが焼酎の官能的評価を好まし
いものとする。ところが、上述したように従来法では、
常圧蒸留によってのみバニリンの前駆体である４−ＶＧ
を焼酎（泡盛）中に留出させることができるにすぎず、
減圧蒸留を介して製造される麦焼酎や米焼酎（泡盛は除
く）においては当該４−ＶＧを比較的多量に含有するよ
うにすることはできない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の課
題を解決すべく、各種実験を介して、鋭意研究を重ね
た。その結果、フェルラ酸脱炭酸酵素を有するサッカロ
ミセス・セレビシエＩＦＯ ２０１８と優れたクエン酸
耐性を有する焼酎酵母サッカロミセス・セレビシエＢＡ
Ｗ−６とを細胞融合した株から、フェルラ酸脱炭酸酵素
を有し、かつ優れたクエン酸耐性を有する菌株（酵母）
を見い出し、これを用いてアルコール発酵する場合、も
ろみ中の４−ＶＧ濃度が顕著に向上することが判った。
本発明は上述した発見事実に基づいたものである。すな
わち、本発明は、上述した新規醸造用酵母を用いてアル
コール発酵を行い、もろみ中の４−ＶＧ濃度を向上さ
せ、該もろみを減圧蒸留に付して、比較的多量のバニリ
ンを含有し、豊かな香味を有する蒸留酒の製造方法を提
供することを目的とする。

【０００７】

【発明の構成・効果】上記目的を達成する本発明は、本
発明者らが発見した新規醸造用酵母のサッカロミセス・
セレビシエＴＳＨ−１（生工研菌寄第１５４２２号）を
アルコール発酵用培地に接種してアルコール発酵を行う
ことを特徴とするものである。本発明によれば、従来の
酵母を使用したときに比べ、アルコール発酵後の発酵液
中の４−ＶＧ濃度が高くなり、減圧蒸留で焼酎などの蒸
留酒中に４−ＶＧが留出することにより、香味の豊かな
蒸留酒を効率的に製造することができる。

【０００８】本発明においていう蒸留酒は、麹、麦芽お
よび／または酵素剤を使用して発酵工程を介した後、減
圧蒸留（すなわち、単式蒸留）によって得られるものを
意味し、代表的には、焼酎、ウイスキー、ブランデー、
スピリッツなどが挙げられるが、これらに限定されるも
のではない。アルコール発酵の発酵形式には、ウイスキ
ーを製造する場合の単発酵と、焼酎などを製造する場合
の並行複発酵とがある。また、仕込み形式には焼酎を製
造する場合の２段仕込み（１次仕込み、２次仕込み）、
ウイスキー、ブランデーなどを製造する場合の１段仕込
みなどがある。本発明はこれらいずれの発酵形式であっ
ても適用でき、いずれの場合にあっても所望の効果が達
成される。

【０００９】本発明において使用するサッカロミセス・
セレビシエＴＳＨ−１（生工研菌寄第１５４２２号）
は、フェルラ酸脱炭酸活性を有するとともに優れたクエ
ン酸耐性を有するものであって、下述するＴＴＣ染色性
（１）およびＤ．Ｃ．染色性（２）により特徴づけられ
る新規酵母である。すなわち、（１）古川、秋山の方法
（古川敏郎、秋山裕一：農化、３７，３９８（１９６
３））に従ってＴＴＣ染色性試験、すなわち菌体を１プ
レートに約２００程度となるように希釈し、ＴＴＣ下層
培地に３０℃で２日間プレート培養したコロニーへ、Ｔ
ＴＣ寒天を溶解後４５℃程度にしてから静かに重層し、
固まった後３０℃に２〜３時間放置し、コロニーの染色
を観察したとき、ピンク色を示し、かつ（２）溝口、藤
田の方法（溝口晴彦、藤田栄信：醗工、５９，１８５
（１９８１））に従って、Ｄ．Ｃ．染色性試験、すなわ
ち菌体を１プレートに約２００程度となるように希釈
し、ＴＴＣ下層培地に３０℃で２日間プレート培養した
コロニーへ、上層用軟寒天を溶解後４５℃程度にしてか
ら静かに重層し、固まった後室温に３０分放置し、コロ
ニーの染色を観察したとき、クリーム色を示すことによ
り識別させられるサッカロミセス・セレビシエに属する
新規酵母である。

【００１０】また該新規酵母は、下述する菌学的性質を
有する。 （ａ）ＹＭ培地を用い、３０℃で２日間培養したときの
菌の形態： 栄養細胞の大きさ：４〜９μｍ 栄養細胞の形状：卵型 増殖の形態：出芽 （ｂ）ＹＭ寒天平板培地を用い、３０℃で２日間培養し
たときのコロニーの形態： 形態：円 隆起：凸円状 周縁：円滑 大きさ（直径）：２〜３ｍｍ 色調：白色で不透明 表面：円滑で光沢あり （ｃ）炭素源資化性：グルコース、ガラクトース、フル
クトース、シュクロース、マルトース、マンノース、ト
レハロース、アラビノース、ラフィノース、エタノー
ル、乳酸、α−メチルグルコシド、メレジトース、コハ
ク酸、グリセロールは資化する；セロビオース、メリビ
オース、エリスリトール、イノシトール、イヌリン、ラ
クトース、マンニトール、メリビオース、ラムノース、
リボース、サリシン、ソルビトール、スターチ、キシロ
ースは資化しない。 （ｄ）増殖阻害薬剤に対する耐性：カナバニン１００ｐ
ｐｍ存在下の寒天培地（２ｗｔ．％グルコース、０．６
７ｗｔ．％イーストナイトロジェンベース）でコロニー
を形成する。セルレニン２０ｐｐｍ存在下の寒天培地
（２ｗｔ．％グルコース、０．６７ｗｔ．％イーストナ
イトロジェンベース）でコロニーを形成しない。

【００１１】本発明において使用する上述した、フェル
ラ酸脱炭酸酵素（すなわちフェルラ酸脱炭酸活性）を有
し、かつ優れたクエン酸耐性を有する新規酵母は、本発
明者らが取得したものである。すなわち、サッカロミセ
ス・セレビシエに属する焼酎用酵母ＢＡＷ−６とビール
用酵母であるサッカロミセス・セレビシエＩＦＯ２０１
８とを細胞融合処理し、該細胞融合処理の結果得られた
菌株の中からフェルラ酸脱炭酸活性を有し、かつ優れた
クエン酸耐性を有していて、菌学的性質が前記のＢＡＷ
−６株およびＩＦＯ ２０１８株のいずれからも明確に
区別できる、従来未知の新規な醸造用酵母として取得し
たものである。

【００１２】以下に、本発明者らが、本発明のサッカロ
ミセス・セレビシエに属する新規酵母、すなわちＴＳＨ
−１株（生工研菌寄第１５４２２号）を見い出すに至っ
た経緯を説明する。

【００１３】１．各種酵母のフェルラ酸脱炭酸活性の検
討 一般に使用される焼酎用酵母（ＢＡＷ−６，Ｋｏ，ＭＫ
およびＳＨ−４酵母）、清酒用酵母（協会７，９，１
０，１３，６０１，７０１および９０１号酵母）、ワイ
ン用酵母（ＯＣ２およびＩＦＯ ２２６０酵母）、ビー
ル用酵母（ＩＦＯ１９５２，１９５３および２０１８酵
母）、ウイスキー用酵母（ＩＦＯ ０２３３，０２３
４，２１１４，２１１５，２１１６および２３７３酵
母）のそれぞれについてフェルラ酸脱炭酸活性測定を介
して検討を行った。当該フェルラ酸脱炭酸活性の測定
は、Ｃｈａｔｏｎｎｅｔらの方法（Ｐ．Ｃｈａｔｏｎｎ
ｅｔ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉ
ｃ．，６２，１９１−２０２（１９９３））に従って行
った。なお、上述した酵母はいずれもサッカロミセス・
セレビシエに属するものである。

【００１４】すなわち、上述した酵母のそれぞれについ
てその一白金耳を、１０ｍｌのＹＰＤ培地（２ｗｔ．％
グルコース、１ｗｔ．％酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペ
プトン）に接種して、所定の時間３０℃で振とう培養
し、培養液を得た。この際、培養液の培養時間は、前記
ＹＰＤ培地を５倍希釈したときの６６０ｎｍの吸光度が
０．４以上になるまでとした。得られた培養液を３００
０ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を捨て、酵母菌体
を得た。得られた該酵母菌体に１０ｍｌのリン酸バッフ
ァー液（０．０５Ｍ，ｐＨ６．０）を加え、懸濁後、再
び３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を捨て、
再度１０ｍｌの前記リン酸バッファー液を加え、懸濁し
懸濁液を得た。得られた懸濁液５００μｌを別の試験管
に取り、脱イオン水４．５ｍｌを加え、これにより前記
懸濁液の５倍希釈液を得、６６０ｎｍの吸光度を測定し
た。ここで得られた吸光度の値に基づいて、６６０ｎｍ
の吸光度が０．４〜０．５になるように、前記懸濁液を
脱イオン水を用いて希釈した。得られた希釈液１０ｍｌ
に１ｍｌのフェルラ酸（１ｇ／ｌ−９５％エタノール）
を添加し、撹拌後、得られた混合液５００μｌを別の試
験管に取り、脱イオン水４．５ｍｌを加え、６６０ｎｍ
の吸光度を測定し、得られた値を該混合液の濁度とし
た。

【００１５】なお、ここにおける濁度は該混合液に含ま
れる酵母数の度合いを示す。残りの前記混合液１０．５
ｍｌを３０℃で２時間静置培養した。かくして培養した
混合液の１．５ｍｌを、５０００ｒｐｍで１５分間遠心
分離し、得られた上清を高速液体クロマトグラフィーに
供し、前記培養後の混合液中に生成した４−ＶＧ濃度を
測定した。この際の高速液体クロマトグラフィー分析は
Ｈｕａｎｇら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，５９（３），２２４４−２２５０，（１９
９３））の方法に従って行った。詳細には、カラムに、
μＢＯＮＤＡＳＰＥＲＥ Ｃ１８（３．９ｍｍ×１５ｃ
ｍ １００Å Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、純水：アセ
トニトリル：酢酸＝７０：３０：１の溶離液を、流速
１．２ｍｌ／分で前記カラムに通じた。４−ＶＧの検出
波長は２６０ｎｍに設定した。そして、前記培養後の混
合液中に生成した４−ＶＧ濃度の値を前記混合液の上述
した濁度の値で除し、得られた値を当該酵母のフェルラ
酸脱炭酸活性の値とした。

【００１６】以上のようにして上述した酵母のそれぞれ
のフェルラ酸脱炭酸活性を測定し、得られた結果を表１
に示す。表１に示す結果から明らかなように、一般に使
用されている焼酎用酵母（ＢＡＷ−６，Ｋｏ，ＭＫおよ
びＳＨ−４酵母）の中にはフェルラ酸脱炭酸活性を示す
ものがないことが判った。また、一般に使用されている
清酒用酵母（協会７，９，１０，１３，６０１，７０１
および９０１号酵母）についてもフェルラ酸脱炭酸活性
はほとんどか、あるいは全くないことが判った。しか
し、ワイン用酵母（ＯＣ２およびＩＦＯ ２２６０酵
母）、ビール用酵母（ＩＦＯ １９５２，１９５３およ
び２０１８酵母）およびウイスキー用酵母（ＩＦＯ ０
２３３，０２３４，２１１４，２１１５，２１１６およ
び２３７３酵母）の中には、フェルラ酸脱炭酸活性を有
するものがあった。中でも、ワイン用酵母ＩＦＯ ２２
６０、ビール用酵母ＩＦＯ １９５３、ビール用酵母Ｉ
ＦＯ２０１８は比較的高いフェルラ酸脱炭酸活性を示す
ことが判った。

【００１７】２．各種酵母のクエン酸耐性試験 上記１．において供試したそれぞれの酵母についてクエ
ン酸耐性試験を行った。すなわち、上記１．に述べた酵
母のそれぞれをＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコース、１
ｗｔ．％酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペプトン）を用い
３０℃で２日間前培養して酵母菌体を得、得られた酵母
菌体を２％クエン酸を含むＹＰＤ培地に植菌し、３０℃
で８日間静置培養を行った。この際、各酵母の増殖の指
標として、６６０ｎｍにおける吸光度（クエン酸耐性）
を観察した。観察結果を表１に示す。なお、クエン酸耐
性の評価は、培養８日目の６６０ｎｍにおける吸光度
が、１．０未満のものを−、１．０以上１．２未満のも
のを＋、１．２以上１．５未満のものを＋＋、１．５以
上のものを＋＋＋とする基準で表１に示した。表１から
明らかなように、実験に供試したそれぞれの酵母のう
ち、焼酎用酵母（ＢＡＷ−６，Ｋｏ，ＭＫおよびＳＨ−
４酵母）はクエン酸耐性が高く、中でもＢＡＷ−６株は
特に高いクエン酸耐性を示すことが判った。また、ワイ
ン用酵母（ＯＣ２およびＩＦＯ ２２６０酵母）につい
てはわずかのクエン酸耐性が認められるが、清酒用酵母
（協会７，９，１０，１３，６０１，７０１および９０
１号酵母）、ビール用酵母（ＩＦＯ １９５２，１９５
３および２０１８酵母）およびウイスキー用酵母（ＩＦ
Ｏ ０２３３，０２３４，２１１４，２１１５，２１１
６および２３７３酵母）についてはいずれもクエン酸耐
性がほとんどないかあったにしても極めて低いことが判
った。

【００１８】３．細胞融合 焼酎もろみの特徴の一つは、該焼酎もろみが焼酎麹が生
産したクエン酸を含むため、ｐＨ３〜４の酸性を呈する
ことである。そのためこうした焼酎に使用される焼酎用
酵母は、クエン酸耐性を有し、かつクエン酸酸性下でも
十分な発酵能を有する。しかし、当該焼酎用酵母はいず
れもフェルラ酸脱炭酸活性を有していないので、焼酎製
造用もろみ中のフェルラ酸は４−ＶＧに変換されない。
従って上述したように減圧蒸留を介して製造される麦焼
酎や米焼酎（泡盛を除く）は４−ＶＧを実質的に含有し
ないものである。

【００１９】一方、上記１．で述べたように、上述した
ワイン用酵母、ビール用酵母およびウイスキー用酵母の
中にはいくつか比較的大きいフェルラ酸脱炭酸活性を有
するものがあるが（表１参照）、そうした酵母はいずれ
もクエン酸耐性が実質的にないか、あるいはあったとし
ても焼酎製造に使用する酵母について要求されるほどの
クエン酸耐性はない。そこで、上記２．において、最も
高いクエン酸耐性を有することの判った焼酎用酵母ＢＡ
Ｗ−６と上記１．において最も高いフェルラ酸脱炭酸活
性を有することの判ったビール用酵母ＩＦＯ ２０１８
株との細胞融合を試みた。すなわち、当該二者の酵母を
以下に述べるようにして細胞融合した。

【００２０】３−（１）親株に対するマーカーの付与 細胞融合により得られる融合株を効率的に分離するため
には、当該細胞融合に付する二者の親株（すなわち両親
株）にマーカーを付与する必要性がある。すなわち、細
胞融合処理後にマーカーを有する融合しなかった両親株
は増殖せず、そしてマーカーが相補された融合株のみが
増殖できる培地を使用することにより、該融合株のみを
選択的に分離することができる。そこで、両親株の一つ
として親株として使用する焼酎用酵母ＢＡＷ−６株にリ
ジン要求性のマーカー付与を行い、他の親株として使用
するビール用酵母ＩＦＯ ２０１８株に呼吸欠損性のマ
ーカー付与を行った。

【００２１】（イ）リジン要求性株の取得：ＢＡＷ−６
株を、ＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコース、１ｗｔ．％
酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペプトン）を用い３０℃で
２日間前培養して酵母菌体を得た。得られた培養液を別
のＹＰＤ培地１０ｍｌに植菌し、３０℃で１２時間振と
う培養し、得られた酵母菌体を３０００ｒｐｍで５分間
遠心分離して集菌し、滅菌水１０ｍｌで洗浄後、３００
０ｒｐｍで５分間遠心分離した。ここで得られた酵母菌
体をリン酸バッファー液（ｐＨ７．０）１０ｍｌに懸濁
後、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）０．３ｍｌ
を添加して、３０℃で４５分間緩やかに振とうすること
により変異処理を行った。かくして変異処理した酵母菌
体を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して集菌し、これ
を５％チオ硫酸ナトリウム溶液１０ｍｌに懸濁し、得ら
れた懸濁液の４００μｌをＡＡプレート（２ｗｔ．％グ
ルコース、２ｗｔ．％イーストナイトロジェンベース、
０．２ｗｔ．％ＤＬ−α−アミノアジピン酸、Ｌ−リジ
ン塩酸塩（３０ｐｐｍ）、２ｗｔ．％寒天）に塗布し
た。得られたものを、３０℃で１週間培養し、複数個の
コロニーの出現をみた。これらのコロニーについて特に
大きなコロニー３０個を釣菌し、それぞれのコロニーを
別々に滅菌水に懸濁してそれぞれの懸濁液を得た。

【００２２】得られたそれぞれの該懸濁液を、ＳＤプレ
ート（２ｗｔ．％グルコース、０．６７ｗｔ．％イース
トナイトロジェンベース、２ｗｔ．％寒天）とＳＤ＋Ｌ
ｙｓプレート（２ｗｔ．％グルコース、０．６７ｗｔ．
％イーストナイトロジェンベース、Ｌ−リジン塩酸塩
（３０ｐｐｍ）、２ｗｔ．％寒天）に接種（スタンプ）
した。得られたもののそれぞれを、３０℃で１週間培養
し、該ＳＤプレート上で出現せず、ＳＤ＋Ｌｙｓプレー
ト上で出現した１０個のコロニー（すなわちＬｙｓ^-−
１，２，３，４，５，６，７，８，９および１０）を目
的とするリジン要求性株とした。

【００２３】（ロ）クエン酸耐性によるリジン要求性株
のスクリーニング：上記（イ）において得たリジン要求
性株（Ｌｙｓ^-−１〜Ｌｙｓ^-−１０）のそれぞれの株に
ついてクエン酸耐性試験を行った。すなわち、リジン要
求性株（Ｌｙｓ^-−１〜Ｌｙｓ^-−１０）のそれぞれをＹ
ＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコース、１ｗｔ．％酵母エキ
ス、２ｗｔ．％ポリペプトン）を用い３０℃で２日間前
培養して酵母菌体を得、得られた酵母菌体を、２％クエ
ン酸を含むＹＰＤ培地に植菌し、３０℃で８日間静置培
養を行った。この際、各酵母の増殖の指標として、培養
８日目の６６０ｎｍにおける吸光度（クエン酸耐性）を
観察した。観察結果を表２に示す。表２から明らかなよ
うに上記（イ）において得たＢＡＷ−６を親株とするリ
ジン要求性株（Ｌｙｓ^-−１〜Ｌｙｓ^-−１０）のうち、
最も高いクエン酸耐性を示したＬｙｓ^-−５をＢＡＷ−
６のリジン要求性株として選抜した。

【００２４】（ハ）呼吸欠損株の取得：ＩＦＯ ２０１
８株を、ＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコース、１ｗｔ．
％酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペプトン）を用い３０℃
で２日間前培養して酵母菌体を得た。得られた酵母菌体
を別のＹＰＤ培地１０ｍｌに植菌し、３０℃で１２時間
振とう培養し培養液を得た。得られた培養液の１００μ
ｌを滅菌水１０ｍｌに懸濁して懸濁液を得、得られた懸
濁液の１００μｌをさらに、アクリフラビン液体培地
（０．１ｗｔ．％リン酸二水素カリウム、０．１５ｗ
ｔ．％硫酸アンモニウム、０．０５ｗｔ．％硫酸マグネ
シウム七水和物、０．１８ｗｔ．％ポリペプトン、０．
２ｗｔ．％酵母エキス、２ｗｔ．％グルコース、３ｐｐ
ｍ．アクリフラビン）２ｍｌに植菌した。得られたもの
を３０℃で４日間培養後、１プレートに出現するコロニ
ーの数が約２００程度となるように前記アクリフラビン
液体培地を希釈し、ＴＴＣ下層培地のプレートに塗布し
た。これを３０℃で２日間培養して、約２００個のコロ
ニーの出現をみた。出現したコロニーのすべてについて
ＴＴＣ染色を行い、白色を呈した５個のコロニーを釣菌
し、それらコロニーのそれぞれを別々に滅菌水に懸濁し
てそれぞれの懸濁液を得た。得られたそれぞれの該懸濁
液、ＳＤプレート（２ｗｔ．％グルコース、０．６７ｗ
ｔ．％イーストナイトロジェンベース、２ｗｔ．％寒
天）とＳＤ＋Ｇｌｙプレート（２ｗｔ．％グルコース、
０．６７ｗｔ．％イーストナイトロジェンベース、２ｗ
ｔ．％グリセロール、２ｗｔ．％寒天）に接種（スタン
プ）した。得られたもののそれぞれを、３０℃で１週間
培養し、コロニーが該ＳＤプレート上で出現し、ＳＤ＋
Ｇｌｙプレート上で出現しなかった株を３株得、該３株
を目的とする呼吸欠損株（ρ^-−１，ρ^-−２およびρ^-
−３）として取得した。

【００２５】（ニ）フェルラ酸脱炭酸活性による呼吸欠
損株のスクリーニング：上記（ハ）で得られた３つの呼
吸欠損株（ρ^-−１，ρ^-−２およびρ^-−３）について
フェルラ酸脱炭酸活性の程度を調べるために以下の実験
を行った。フェルラ酸脱炭酸活性の測定は、Ｃｈａｔｏ
ｎｎｅｔらの方法（Ｐ．Ｃｈａｔｏｎｎｅｔ ｅｔ ａ
ｌ．：Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．，６２，１
９１−２０２（１９９３））に従って行った。

【００２６】すなわち、上記３つの呼吸欠損株（ρ^-−
１，ρ^-−２およびρ^-−３）のそれぞれについて、その
一白金耳を、１０ｍｌのＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコ
ース、１ｗｔ．％酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペプト
ン）に接種して、３０℃で所定時間振とう培養し、培養
液を得た。この際の、培養時間は、前記ＹＰＤ培地を５
倍希釈したときの６６０ｎｍの吸光度が０．４以上にな
るまでとした。得られた培養液を３０００ｒｐｍで１５
分間遠心分離し、上清を捨て、酵母菌体を得た。得られ
た該酵母菌体に１０ｍｌのリン酸バッファー液（０．０
５Ｍ，ｐＨ６．０）を加え、懸濁後、再び３０００ｒｐ
ｍで１５分間遠心分離し、上清を捨て、再度１０ｍｌの
前記リン酸バッファー液を加え、懸濁し懸濁液を得た。
得られた懸濁液５００μｌを別の試験管に取り、脱イオ
ン水４．５ｍｌを加え、これにより前記懸濁液の５倍希
釈液を得、６６０ｎｍの吸光度を測定した。ここで得ら
れた吸光度の値に基づいて、６６０ｎｍの吸光度が０．
４〜０．５になるように、前記懸濁液を脱イオン水を用
いて希釈した。得られた希釈液１０ｍｌに１ｍｌのフェ
ルラ酸（１ｇ／ｌ−９５％エタノール）を添加し、撹拌
して混合液を得た。得られた混合液５００μｌを別の試
験管に取り、脱イオン水４．５ｍｌを加え、６６０ｎｍ
の吸光度を測定し、得られた値を該混合液の濁度とし
た。なお、ここにおける濁度は該混合液に含まれる酵母
数の度合いを示す。残りの前記混合液１０．５ｍｌを３
０℃で２時間静置培養した。かくして培養した混合液の
１．５ｍｌを、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、
得られた上清を高速液体クロマトグラフィーに供し、前
記培養後の混合液中に生成した４−ＶＧ濃度を測定し
た。

【００２７】この際の高速液体クロマトグラフィー分析
はＨｕａｎｇら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，５９（３），２２４４−２２５０，（１
９９３））の方法に従って行った。詳細には、カラム
に、μＢＯＮＤＡＳＰＥＲＥＣ１８（３．９ｍｍ×１５
ｃｍ １００Å Ｗａｔｅｒｓ社製）を用い、純水：ア
セトニトリル：酢酸＝７０：３０：１の溶離液を、流速
１．２ｍｌ／分で前記カラムに通じた。４−ＶＧの検出
波長は２６０ｎｍに設定した。そして、前記培養後の混
合液中に生成した４−ＶＧ濃度の値を前記混合液の上述
した濁度の値で除し、得られた値を当該酵母のフェルラ
酸脱炭酸活性の値とした。３つの表３に得られたフェル
ラ酸脱炭酸活性の測定結果を示す。表３に示した結果に
基づいて、当該３つの呼吸欠損株（ρ^-−１，ρ^-−２お
よびρ^-−３）のうち、最も高いフェルラ酸脱炭酸活性
を示した呼吸欠損株ρ^-−２をＩＦＯ２０１８株の呼吸
欠損株として取得した。

【００２８】３−（２）．プロトプラスト融合 上記３−（１）−（ロ）で得たＢＡＷ−６株のリジン要
求性株Ｌｙｓ^-−５と上記３−（２）−（ニ）で得たＩ
ＦＯ ２０１８株の呼吸欠損株ρ^-−２のそれぞれを、
以下の方法に従ってプロトプラスト融合を行った。すな
わちＬｙｓ^-−５株とρ^-−２株のそれぞれの一白金耳
を、ＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコース、１ｗｔ．％酵
母エキス、２ｗｔ．％ポリペプトン）１０ｍｌに植菌
し、３０℃で２０時間静置培養して培養液を得た。得ら
れた培養液を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得ら
れた酵母菌体をトリス塩酸バッファー液（ｐＨ７．５）
１０ｍｌを用いて洗浄し、３０００ｒｐｍで５分間遠心
分離した。上清を捨て、得られた酵母菌体を０．６Ｍ
ＫＣｌと０．２％ ２−メルカプトエタノールを含む溶
液１０ｍｌに懸濁し、３０℃で３０分間振とう後、０．
２％ ２−メルカプトエタノール、０．６Ｍ ＫＣｌお
よび１ｍｇ／ｍｌ Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ−２０Ｔ（細胞
壁溶解酵素）を含むトリス塩酸バッファー液（ｐＨ７．
５）１０ｍｌを加え、３５℃で２時間振とう処理し、Ｌ
ｙｓ^-−５株とρ^-−２株のそれぞれについてプロトプラ
ストを得た。得られたそれぞれのプロトプラストは２０
００ｒｐｍで５分間遠心分離後、０．６Ｍ ＫＣｌを含
むトリス塩酸バッファー液（ｐＨ７．５）１０ｍｌを用
いて２回洗浄後、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、
上清を捨て、５ｍｌの同バッファー液に懸濁しプロトプ
ラスト液を得た。

【００２９】得られた二者のプロトプラスト液のそれぞ
れの５ｍｌを混合して混合液を得、２０００ｒｐｍで５
分間遠心分離し、上清を捨て酵母菌体を得た。得られた
酵母菌体に、５０ｍＭ塩化カルシウムを含む３５％ＰＥ
Ｇ−４０００溶液５ｍｌを加え、３０℃で１５分間静置
後、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、
酵母菌体を得た。得られた酵母菌体を、０．６Ｍ ＫＣ
ｌを含む０．１Ｍトリス塩酸バッファー液（ｐＨ７．
５）１０ｍｌに懸濁し、得られた懸濁液の１００μｌを
ＳＤ＋Ｇｌｙプレート（２ｗｔ．％グルコース、０．６
７ｗｔ．％イーストナイトロジェンベース、２ｗｔ．％
グリセロール、２ｗｔ．％寒天）に塗布した。次いで該
ＳＤ＋Ｇｌｙプレートと同一組成の培地を用意し、品温
を４５℃程度に調整してから、これを前記ＳＤ＋Ｇｌｙ
プレートに静かに５ｍｌ重層し、得られたものを３０℃
で４日間培養し、２０個のコロニーの出現をみた。かく
して２０個のコロニーすなわち２０個の細胞融合酵母
（ＴＳＨ−１〜２０）を得た。

【００３０】４．有用菌株のスクリーニング ４−（１）．細胞融合株のフェルラ酸脱炭酸活性の測定 得られた上記２０の細胞融合酵母（ＴＳＨ−１〜２０）
のそれぞれについてフェルラ酸脱炭酸活性の有無を調べ
るために以下の実験を行った。フェルラ酸脱炭酸活性の
測定は、Ｃｈａｔｏｎｎｅｔらの方法（Ｐ．Ｃｈａｔｏ
ｎｎｅｔ ｅｔａｌ．：Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒ
ｉｃ．，６２，１９１−２０２（１９９３））に従って
行った。

【００３１】すなわち、上記２０株の細胞融合酵母（Ｔ
ＳＨ−１〜２０）のそれぞれについて、その一白金耳
を、１０ｍｌのＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコース、１
ｗｔ．％酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペプトン）に接種
して、３０℃で所定時間振とう培養し、培養液を得た。
この際の、培養時間は、前記ＹＰＤ培地を５倍希釈した
ときの６６０ｎｍの吸光度が０．４以上になるまでとし
た。得られた培養液を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分
離し、上清を捨て、酵母菌体を得た。得られた該酵母菌
体に１０ｍｌのリン酸バッファー液（０．０５Ｍ，ｐＨ
６．０）を加え、懸濁後、再び３０００ｒｐｍで１５分
間遠心分離し、上清を捨て、再度１０ｍｌの前記リン酸
バッファー液を加え、懸濁し懸濁液を得た。得られた懸
濁液５００μｌを別の試験管に取り、脱イオン水４．５
ｍｌを加え、これにより前記懸濁液の５倍希釈液を得、
６６０ｎｍの吸光度を測定した。ここで得られた吸光度
の値に基づいて、６６０ｎｍの吸光度が０．４〜０．５
になるように、前記懸濁液を脱イオン水を用いて希釈し
た。得られた希釈液１０ｍｌに１ｍｌのフェルラ酸（１
ｇ／ｌ−９５％エタノール）を添加し、撹拌して混合液
を得た。得られた混合液５００μｌを別の試験管に取
り、脱イオン水４．５ｍｌを加え、６６０ｎｍの吸光度
を測定し、得られた値を該混合液の濁度とした。なお、
ここにおける濁度は該混合液に含まれる酵母数の度合い
を示す。残りの前記混合液１０．５ｍｌを３０℃で２時
間静置培養した。かくして培養した混合液の１．５ｍｌ
を、５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた上
清を高速液体クロマトグラフィーに供し、前記培養後の
混合液中に生成した４−ＶＧ濃度を測定した。この際の
高速液体クロマトグラフィー分析はＨｕａｎｇら（Ａｐ
ｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９
（３），２２４４−２２５０，（１９９３））の方法に
従って行った。

【００３２】詳細には、カラムに、μＢＯＮＤＡＳＰＥ
ＲＥ Ｃ１８（３．９ｍｍ×１５ｃｍ １００Å Ｗａ
ｔｅｒｓ社製）を用い、純水：アセトニトリル：酢酸＝
７０：３０：１の溶離液を、流速１．２ｍｌ／分で前記
カラムに通じた。４−ＶＧの検出波長は２６０ｎｍに設
定した。そして、前記培養後の混合液中に生成した４−
ＶＧ濃度の値を前記混合液の上述した濁度の値で除し、
得られた値を当該酵母のフェルラ酸脱炭酸活性の値とし
た。２０株の細胞融合酵母（ＴＳＨ−１〜２０）のフェ
ルラ酸脱炭酸活性の測定結果を表４に示す。表４に示し
た結果に基づいて、当該２０の細胞融合酵母のうち、特
にフェルラ酸脱炭酸活性の高い細胞融合酵母４株（ＴＳ
Ｈ−１，ＴＳＨ−２，ＴＳＨ−５，ＴＳＨ−６）を選抜
した。

【００３３】４−（２）．クエン酸耐性の検討 上記４−（１）．で選抜した４つの細胞融合酵母（ＴＳ
Ｈ−１，ＴＳＨ−２，ＴＳＨ−５，ＴＳＨ−６）につい
てクエン酸耐性試験を行った。すなわち、当該４つの細
胞融合酵母のそれぞれをＹＰＤ培地（２ｗｔ．％グルコ
ース、１ｗｔ．％酵母エキス、２ｗｔ．％ポリペプト
ン）を用い３０℃で２日間前培養して酵母菌体を得、得
られた酵母菌体を２％クエン酸を含むＹＰＤ培地に植菌
し、３０℃で８日間静置培養を行った。この際、各酵母
の増殖の指標として、６６０ｎｍにおける吸光度（クエ
ン酸耐性）の経時変化を観察した。その結果を図１に示
す。図１に示す結果から、前記４つの細胞融合酵母は、
いずれもＩＦＯ ２０１８株より高く、しかもＢＡＷ−
６株より低いクエン酸耐性を示したが、その中でも特に
ＢＡＷ−６株のクエン酸耐性に酷似した菌株ＴＳＨ−１
を選抜した。

【００３４】５．菌学的性質 上記４．において分離した菌株ＴＳＨ−１が、親菌株の
ＢＡＷ−６およびＩＦＯ ２０１８のいずれからも明確
に識別されるものであるか否かを見極めるため、菌学的
性質（形態学的性質および生理学的性質）の異同につい
て以下の検討を行った。

【００３５】５−（１）．形態学的性質 ＹＭ寒天培地（１ｗｔ．％グルコース、０．３ｗｔ．％
酵母エキス、０．５ｗｔ．％ポリペプトン、０．３ｗ
ｔ．％麦芽エキス、２ｗｔ．％寒天）を用い、菌株ＴＳ
Ｈ−１、親菌株のＢＡＷ−６およびＩＦＯ ２０１８の
それぞれの菌体を３０℃の温度で２日間培養し、得られ
たものについて光学顕微鏡で観察した。観察結果を表５
にまとめて示した。表５から明らかなように、いずれの
菌体の栄養細胞もその大きさは４〜９μｍで卵型であ
り、また、ＹＭ寒天培地上ではいずれの菌株もつやのあ
る白色のコロニーを形成することが判った。

【００３６】５−（２）．生理学的性質 ａ．炭素源資化性 菌株ＴＳＨ−１、親菌株のＢＡＷ−６およびＩＦＯ ２
０１８のそれぞれについて、固体培地を使用するレプリ
カ法によって炭素源資化性を試験した。すなわち、表６
に示すそれぞれの炭素化合物を１ｗｔ．％含有するバク
ト社製炭素源資化テスト用培地を用意し、それぞれの寒
天平板に前記菌株を接種（スタンプ）し、３０℃で培養
して炭素源資化性を観察した。炭素源資化性の観察結果
を表６にまとめて示した。表６に示した結果より次のこ
とが判った。すなわち、ＴＳＨ−１株は、親株であるＢ
ＡＷ−６株およびＩＦＯ ２０１８株のいずれからも次
の点で明らかに異なる。すなわち、ＴＳＨ−１株はメレ
ジトースを資化するが、ＢＡＷ−６株は資化しない；ま
た、ＴＳＨ−１株およびＢＡＷ−６株はグリセロールお
よび乳酸を資化するが、ＩＦＯ ２０１８株はこれらを
資化しない。

【００３７】ｂ．増殖阻害物質に対する耐性 菌株ＴＳＨ−１、親菌株のＢＡＷ−６およびＩＦＯ ２
０１８について、固体培地を使用するレプリカ法によっ
て増殖阻害物質に対する耐性を試験した。すなわち、
０，１０，２０および３０ｐｐｍ濃度のセルレニンと、
０，１０，２０および１００ｐｐｍ濃度のカナバニンを
含有するそれぞれのＳＤプレート（２ｗｔ．％グルコー
ス、０．６７ｗｔ．％イーストナイトロジェンベース、
２ｗｔ．％寒天）に前記菌株を接種（スタンプ）し、３
０℃で培養し、増殖の有無を観察した。得られた観察結
果を表７および表８に示した。表７および表８に示した
結果から次のことが判った。すなわち、ＢＡＷ−６株は
セルレニン濃度２０ｐｐｍで増殖するのに対し、ＩＦＯ
２０１８株およびＴＳＨ−１株はいずれもセルレニン
存在下では増殖しない；ＢＡＷ−６株は、カナバニン存
在下では増殖しないのに対して、ＩＦＯ ２０１８株は
カナバニン濃度２０ｐｐｍまで増殖し、ＴＳＨ−１株は
カナバニン濃度１００ｐｐｍまで増殖する。

【００３８】ｃ．ＴＴＣ染色性 古川、秋山の方法（古川ら：農化、３７，３９８−（１
９６３））に従って試験した。すなわち、ＢＡＷ−６
株、ＩＦＯ ２０１８株、ＴＳＨ−１株の３種のそれぞ
れの菌体を１プレートに約２００程度となるように希釈
し、下層培地に３０℃で２日間プレート培養したコロニ
ー上へ、ＴＴＣ寒天を溶解後４５℃程度にしてから静か
に重層し、固まった後３０℃で２〜３時間放置し、コロ
ニーの染色状況を観察した。表５にＴＴＣ染色性の観察
結果を示した。表５に示した結果から明らかなように、
ＢＡＷ−６株、ＩＦＯ ２０１８株、ＴＳＨ−１株とも
いずれもピンクであった。

【００３９】ｄ．Ｄ．Ｃ．染色性 溝口、藤田の方法（溝口ら：醗酵工学、５９，１８５−
１８８（１９８１））に従って試験した。すなわち、Ｂ
ＡＷ−６株、ＩＦＯ ２０１８株、ＴＳＨ−１株のそれ
ぞれの菌体を１プレートに約２００程度となるように希
釈し、下層培地に３０℃で２日間プレート培養したコロ
ニー上へ、上層用軟寒天を溶解後４５℃程度にしてから
静かに重層し、固まった後室温に３０分間放置し、コロ
ニーの染色状況を観察した。表５にＤ．Ｃ．染色性の観
察結果を示した。表５に示した結果から明らかなよう
に、ＢＡＷ−６株は白色、ＩＦＯ ２０１８株は茶色で
あったが、ＴＳＨ−１株はクリーム色であった。

【００４０】以上の菌学的性質の観察結果から、次のこ
とがわかった。すなわち、本菌ＴＳＨ−１株は、（ｉ）
メレジトースの資化性について、ＢＡＷ−６株と異な
る；グリセロールおよび乳酸の資化性について、ＩＦＯ
２０１８株と異なる；（ｉｉ）カナバニンに対する耐
性について、親菌株であるＢＡＷ−６株およびＩＦＯ２
０１８株と異なる；（ｉｉｉ）Ｄ．Ｃ．染色性につい
て、親菌株であるＢＡＷ−６株およびＩＦＯ ２０１８
株と異なる。さらに２０代にわたる本菌ＴＳＨ−１株の
継代培養を行ったところ、上記（ｉ），（ｉｉ）および
（ｉｉｉ）の性質は維持された。従って上述したＴＳＨ
−１株についての上記（ｉ），（ｉｉ）および（ｉｉ
ｉ）の性質は、ＴＳＨ−１株に特有の確定的なものであ
ることが判った。よって、本菌すなわち、ＴＳＨ−１株
は、従来の酵母から客観的に区別されるものであること
が判明し、本発明者らはこれを新菌と認定し、この菌株
をＴＳＨ−１と命名した。本菌株は、平成８年２月２日
に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、ＴＳＨ
−１は生工研菌寄第１５４２２号なる受託番号を得た。

【００４１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明の内容を説明す
るが、本発明はこれらの実施例により限定されるもので
はない。

【００４２】

【実施例１】酵母として純粋培養したサッカロミセス・
セレビシエＴＳＨ−１株（生工研菌寄第１５４２２号）
を用い、原料として大麦（７０％精白）を用い、以下に
述べる手法で大麦製焼酎を製造した。 酵母の前培養：前記酵母（ＴＳＨ−１株）を、１０ｍｌ
の２ｗｔ．％ＹＥＰＤ培地において、３０℃で２日間、
前培養した。 大麦麹の作成：３００ｇの大麦を４０％（Ｗ／Ｗ）吸水
させ、４０分間蒸した後、２５℃まで放冷し、大麦１ｋ
ｇあたり１ｇ量の種麹（焼酎白麹菌）を接種し、３８
℃，相対湿度（ＲＨ）９５％で２４時間、３２℃，ＲＨ
９２％で２０時間培養して大麦麹を得た。 蒸麦の作成：７００ｇの大麦を４０％（Ｗ／Ｗ）吸水さ
せ、４０分間蒸した後、２５℃まで放冷して蒸麦を得
た。 １次仕込みは、上記大麦麹に上述した前培養した酵母を
加え、さらに水３６０ｍｌを加えて１次もろみを得た。
得られた１次もろみを１段目の５日間の発酵に付した。
また２次仕込みは上記１段目の発酵を終えた１次もろみ
に、上記蒸麦と水１１４０ｍｌを加えて２次もろみを得
た。得られた２次もろみを２段目の１０日間の発酵に付
した。全発酵過程における品温経過は図２に示すとおり
であった。上記２段目の発酵を終えた２次もろみの一部
を以下に述べる分析に供し、残りの２次もろみを常法に
より単式蒸留に付した。かくして大麦焼酎を製造した。

【００４３】

【比較例１−１】実施例１において、醸造用酵母として
ＩＦＯ ２０１８を用いた以外は、実施例１と同様にし
て、１次および２次もろみを得、得られた２次もろみを
単式蒸留に付して大麦焼酎を製造した。なお、以下に述
べる分析には、２段目の発酵を終えた２次もろみの一部
を供した。

【００４４】

【比較例１−２】実施例１において、醸造用酵母として
ＢＡＷ−６を用いた以外は、実施例１と同様にして、１
次および２次もろみを得、得られた２次もろみを単式蒸
留に付して大麦焼酎を製造した。なお、以下に述べる分
析には、２段目の発酵を終えた２次もろみの一部を供し
た。

【００４５】

【評価】

（１）発酵曲線 上記実施例１、比較例１−１および比較例１−２におけ
る大麦焼酎製造における発酵曲線を、仕込み容器を含め
た重量を毎日測定して炭酸ガスの減少量を求めることに
より調べた。得られた発酵曲線を図３に示した。当該発
酵曲線から、本発明酵母ＴＳＨ−１株の発酵状態はＩＦ
Ｏ ２０１８株のそれよりも明らかに良好で、ＢＡＷ−
６株のそれと実質的に同じであることが理解される。

【００４６】（２）２次もろみのエタノール濃度 上記実施例１、比較例１−１および比較例１−２におい
て得られた２次もろみのエタノール濃度を浮ひょう法
（国税庁所定分析法注解）に従って測定した。該２次も
ろみのエタノール濃度を表９に示した。表９に示した結
果から、ＴＳＨ−１株を用いたものはＩＦＯ ２０１８
株を用いたものよりエタノール濃度が０．６％高く、Ｂ
ＡＷ−６株と実質的に同じであることが理解される。

【００４７】（３）２次もろみの４−ＶＧ濃度 上記実施例１、比較例１−１および比較例１−２におい
て得られた２次もろみの４−ＶＧの濃度を小関らの方法
（小関ら：醸協，８９，４０８−４１１（１９９４））
に従って測定した。すなわち、該２次もろみ約１００ｍ
ｌをガーゼろ過し、そのろ液を３０００ｒｐｍで５分間
遠心分離し、上清を得た。得られた上清をろ紙（ＮＯ．
５Ｃ）でろ過して、ろ液を得た。該ろ液を５０ｍｌ測り
とり、１０，０００ｐｐｍアニス酸（和光純薬工業社
製，特級）溶液１５０μｌを内部標準として添加し、
０．４Ｍトリクロロ酢酸（和光純薬工業社製，特級）水
溶液５０ｍｌを加え混合液を得た。該混合液を３０分
間、室温で撹拌後、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離
し、上清を得た。該上清を高速液体クロマトグラフィー
に供して、４−ＶＧ濃度を定量した。前記高速液体クロ
マトグラフィー分析は小関ら（醸造協会誌，８９
（５），４０８−４１１（１９９４））の方法に従って
行った。すなわち、カラムはμＢＯＮＤＡＳＰＥＲＥ
Ｃ１８（３．９ｍｍ×１５ｃｍ １００Å Ｗａｔｅｒ
ｓ社製）を用い、６０分間で５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
４．０）／アセトニトリル（９５／５）から５０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０）／アセトニトリル（３５／６
５）までのリニアグラジエントによる溶出条件で、溶離
液を上記カラムに通じ、４−ＶＧの検出波長は２８０ｎ
ｍに設定した。該２次もろみの４−ＶＧの濃度を表９に
示した。表９に示した結果から、ＴＳＨ−１株を用いた
ものはＢＡＷ−６株を用いたものより２次もろみの４−
ＶＧ濃度が３０倍増加したことが理解される。

【００４８】（４）２次もろみの香気成分 上記実施例１および比較例１−２において得られた２次
もろみの香気成分をヘッドスペースガス分析法により分
析した。該２次もろみの香気成分を表１０に示した。表
１０に示した結果から、ＴＳＨ−１株を用いたものは、
ＢＡＷ−６株を用いたものよりも、酢酸イソアミルが約
１．６倍増加し、イソアミルアルコールなどの高級アル
コールも１．３〜１．５倍増加したことが理解される。

【００４９】以上述べたことからも明らかなように、本
発明の酵母ＴＳＨ−１株は、従来の焼酎酵母とは明らか
に異なり、フェルラ酸脱炭酸酵素を有し、かつ優れたク
エン酸耐性を有する菌株で、もろみ中に高濃度の４−Ｖ
Ｇを与えることができるものであることが理解される。
以上述べたことからも明らかなように、上述した新規な
醸造用酵母、すなわち、サッカロミセス・セレビシエＴ
ＳＨ−１（生工研菌寄第１５４２２号）を使用する本発
明によれば、従来の焼酎製造法による場合よりもアルコ
ール発酵後の４−ＶＧ濃度が高くなり、減圧蒸留で焼酎
中に４−ＶＧが留出することにより、所望の焼酎を効率
的に製造することができる。

【００５０】

【実施例２】酵母としてサッカロミセス・セレビシエＴ
ＳＨ−１を用い、原料として粉砕麦芽を用い、以下に述
べる手法でウイスキー原酒を製造した。 酵母の前培養：前記酵母（ＴＳＨ−１株）を、１０ｍｌ
の２ｗｔ．％ＹＥＰＤ培地において、３０℃で２日間、
前培養した。 糖化もろみの作成：ウイスキー製造用の調製された粉砕
麦芽１ｋｇに温水５Ｌを混和し、６３℃で１．５時間糖
化後、室温まで冷却した。 上記糖化もろみに上述した前培養した酵母を加えて、２
７℃で３日間発酵熟成を行い、ウイスキー原酒もろみを
得た。得られたウイスキー原酒もろみを単式蒸留し、ウ
イスキー原酒を得た。かくしてウイスキー原酒を製造し
た。

【００５１】

【比較例２】醸造用酵母としてウイスキー酵母（ＩＦＯ
０２３４株）を用いた以外は実施例２と同様にしてウ
イスキー原酒もろみを得、得られたウイスキー原酒もろ
みを単式蒸留に付してウイスキー原酒を製造した。

【００５２】

【評価】上記実施例２および比較例２において得られた
ウイスキー原酒もろみの４−ＶＧの濃度を小関らの方法
（小関ら：醸協，８９，４０８−４１１（１９９４））
に従って測定した。すなわち、該ウイスキー原酒もろみ
の約１００ｍｌをガーゼろ過し、そのろ液を３０００ｒ
ｐｍで５分間遠心分離し、上清を得た。得られた上清を
ろ紙（ＮＯ．５Ｃ）でろ過して、ろ液を得た。該ろ液を
５０ｍｌ測りとり、１０，０００ｐｐｍアニス酸（和光
純薬工業社製，特級）溶液１５０μｌを内部標準として
添加し、０．４Ｍトリクロロ酢酸（和光純薬工業社製，
特級）水溶液５０ｍｌを加え混合液を得た。該混合液を
３０分間、室温で撹拌後、３０００ｒｐｍで５分間遠心
分離し、上清を得た。該上清を高速液体クロマトグラフ
ィーに供して、４−ＶＧ濃度を定量した。前記高速液体
クロマトグラフィー分析は小関ら（醸造協会誌，８９
（５），４０８−４１１（１９９４））の方法に従って
行った。すなわち、カラムはμＢＯＮＤＡＳＰＥＲＥ
Ｃ１８（３．９ｍｍ×１５ｃｍ １００Å Ｗａｔｅｒ
ｓ社製）を用い、６０分間で５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ
４．０）／アセトニトリル（９５／５）から５０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０）／アセトニトリル（３５／６
５）までのリニアグラジエントによる溶出条件で、溶離
液を上記カラムに通じ、４−ＶＧの検出波長は２８０ｎ
ｍに設定した。実施例２、比較例２のそれぞれにおけ
る、発酵終了時のウイスキー原酒もろみの４−ＶＧ濃度
を表１１にまとめて示した。表１１に示した結果から次
のことが判った。すなわち、ＴＳＨ−１を用いたものは
ＩＦＯ ０２３４株を用いたものより、４−ＶＧ濃度が
１６倍に増加する。

【００５３】以上述べたことからも明らかなように、上
述した新規な醸造用酵母、すなわち、サッカロミセス・
セレビシエＴＳＨ−１（生工研菌寄第１５４２２号）を
使用する本発明によれば、従来のウイスキー原酒製造法
による場合よりもアルコール発酵後のウイスキー原酒も
ろみ中の４−ＶＧ濃度が高くなる。従ってこのようなウ
イスキー原酒もろみを蒸留に付すと、ウイスキー原酒中
に４−ＶＧが留出することにより所望のウイスキー原酒
を効率的に製造することができる。

【００５４】

【表１】

【００５５】

【表２】

【００５６】

【表３】

【００５７】

【表４】

【００５８】

【表５】

【００５９】

【表６】

【００６０】

【表７】

【００６１】

【表８】

【００６２】

【表９】

【００６３】

【表１０】

【００６４】

【表１１】

【００６５】

【発明効果の概要】新規な醸造用酵母、すなわち、サッ
カロミセス・セレビシエＴＳＨ−１（生工研菌寄第１５
４２２号）を使用することにより、従来の蒸留酒の製造
法による場合よりもアルコール発酵後の４−ＶＧ濃度が
高くなり、減圧蒸留で蒸留酒中に４−ＶＧが留出するこ
とにより、所望の蒸留酒を効率的に製造することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】クエン酸耐性試験における、酵母の増殖の経時
変化を示すグラフである。

【図２】発酵における品温経過を示すグラフである。

【図３】大麦焼酎の製造における発酵状態を示す発酵曲
線である。

フロントページの続き (72)発明者 下田 雅彦 大分県宇佐市大字山本2231−１ 三和酒 類株式会社内 (56)参考文献 特開 平７−115957（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−224653（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12G 1/00 - 3/14 C12C 1/00 - 13/10 C12N 1/16 - 1/19 ＪＩＣＳＴ／ＪＡＦＩＣ（ＪＯＩＳ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 サッカロミセス・セレビシエＴＳＨ−１
   （生工研菌寄第１５４２２号）をアルコール発酵用培地
   に接種して、アルコール発酵を行い発酵液を得、得られ
   た発酵液を蒸留することを特徴とする蒸留酒の製造方
   法。
2. 【請求項２】 前記蒸留酒は、焼酎、ウイスキー、ブラ
   ンデー、スピリッツのうちから選ばれるものである請求
   項１に記載の蒸留酒の製造方法。