JP3835564B2 - 新規酵母及びその用途 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、優れた発酵性能及び生成エチルアルコール存在下で強い発酵力を示し、生成エチルアルコール濃度に対する耐性を有する新規酵母及び該酵母を用いた酒類の製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
現在までに、清酒酵母にエチルアルコール耐性を獲得させる方法としては、20%エチルアルコール溶液中に放置後、生存している酵母を分離する方法(特公昭57−29990号)、エチルアルコール耐性酵母が、酵母生菌体溶菌酵素によって溶解されにくいという性質を利用する方法(特公昭55−30355号)、高級アルコール類に対して耐性を獲得した酵母がエチルアルコールに対しても高い耐性を有することを利用する方法(特公平6−55134号)が公開されている。また、焼酎酵母に関しては、TTC染色性試験でピンク色を示し、かつD.C.染色性試験で白色を示す株を取得することにより、大麦焼酎醪において増殖速度が高く、エチルアルコール耐性を有する酵母(特開平6−62838号)が公開されている。更に、エチルアルコール耐性酵母に関しては、クロトリマゾールに耐性を有するものの中から選択する方法(特開平6−205667号)が公開されている。
現在のところ、エチルアルコール耐性の実用酵母の育種例としては、20%エチルアルコールを含む緩衝液中で生存する酵母を植え継ぐ方法により分離した協会11号酵母が実用化されているにすぎない(特公昭57−29990号)。エチルアルコール耐性の協会11号酵母については、清酒醪中での発酵速度が緩慢であること、香気バランスの面で協会7号酵母に劣るなどの問題がある。
従来のエチルアルコール耐性酵母の取得方法は、20%エチルアルコール中で生存可能な酵母、低級アルコール中で生存可能な酵母、あるいは溶菌酵素に耐性な酵母を選択する方法であり、醪末期における高濃度のエチルアルコール存在下でも死滅しにくく酒質の劣化も起きにくい。しかし、これらすべての方法は、高エチルアルコール濃度状態でも発酵できる酵母を取得する方法ではない。また、クロトリマゾールに耐性を有する酵母は、親株以上のエチルアルコール耐性を示し優れているが、香りの面で官能的には向上していない。更に、ジオキサンを培地に添加して培養すると、生育が速くなり収量が多くなる方法(特開昭48−58186号)が公開されているが、ジオキサン耐性株を取得し、発酵能力を高める報告ではない。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
現在、一般に使用されている清酒酵母は、清酒醪中において20〜22%のエチルアルコールを生成する。しかし、原料米や麹の品質により発酵が遅滞することがあり、このようなとき酵母は自己消化し色度とアミノ酸度が増加する。この場合、酒質を損なうばかりか、製造現場においては、製造計画に変更が生じ、生産性を低下させる要因となっている。このような現況から、自己消化を起こさず、かつ優れた発酵性能及び生成エチルアルコール存在下でエチルアルコール耐性の性格を有する清酒酵母が必要とされていた。また同様に、優れた発酵性能及び生成エチルアルコール存在下でエチルアルコール耐性の性格を有する焼酎酵母も必要とされていた。
本発明の目的は、前記従来技術の問題点を解決すべく、醪末期において自己消化を起こしにくく、香りの面で官能的にも向上し、かつ発酵性能に優れたエチルアルコール耐性酵母を分離、育種する方法を提供すること、及び該酵母を用いて淡麗ですっきりした酒質の清酒及び焼酎等の酒類を製造する方法を提供することにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第1の発明は、エチルアルコール耐性及びジオキサン類耐性を有することを特徴とするサッカロミセス・セレビシエに属する酒類酵母変異株Saccharomyces cerevisiae 9D27株(FERM P−15497)に関する。
また、本発明の第2の発明は、本発明の第1の発明に記載のサッカロミセス・セレビシエに属する酒類酵母変異株Saccharomyces cerevisiae 9D27株(FERM P−15497)を用いることを特徴とする酒類の製造方法に関し、第3の発明は、酵母細胞の母集団から、ジオキサン類に対して耐性を示すサッカロミセス・セレビシエに属する酒類酵母変異株Saccharomyces cerevisiae 9D27株(FERM P−15497)を選択することを特徴とする本発明の第1の発明に記載の酒類酵母変異株の取得方法に関する。
【0005】
本発明者らは、酵母の自己消化の際に働くカルボキシペプチダーゼYをジオキサンが最終濃度30%で活性化すること、また構造的にエチルアルコールが2分子連なった化学構造式をしていることからエチルアルコールと性質が似ている点に着目し、清酒酵母からジオキサン類耐性株を分離し、この中から親株以上のエチルアルコール耐性を示し、発酵性能に優れ、かつ香気豊かな株が存在することを見出し、本発明を完成した。
【0006】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明で用いるジオキサン類は、1,4−ジオキサン、1,3−ジオキサン、1,2−ジオキサン、1,4−ジオキセン等、ヘテロ原子として酸素2個を含む6員環を基本骨格としてもつ類縁又は類似化合物をいう。
【0007】
ここでいうジオキサン類耐性株とは、親株が生育しないジオキサン類濃度条件下でも生育可能な酵母菌株であって遺伝的にあるいは形質的に性質の変化した酵母菌株をいう。
【0008】
本発明において優れた発酵性能とは、醪末期における生成エチルアルコール濃度が高くなることや、例えば清酒を例にとると日本酒度の切れがよくなるといった残存エキス分が少なくなること、すわなち発酵力が強くなることをいい、またエチルアルコール耐性とは、醪末期における高濃度のエチルアルコール存在下でも死滅しにくいことに加えて、発酵性能が低下せずにエチルアルコールを生成することができることをいう。
【0009】
本発明においてジオキサン類耐性株を取得するときに選択される酵母細胞の母集団は、野性株、馴養株、人工的な変異誘発(物理的手段、化学的手段)を行った変異処理株、交雑株、細胞融合株及びプラスミド等による形質転換株のいずれでもよい。
変異処理としては、酵母に公知の変異誘導法、例えば、変異誘発の物理的手段としては、紫外線照射、放射線照射等があり、化学的手段としては、エチルメタンスルホネート(EMS)、N−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン等の変異例を接触させる方法を適宜用いることにより行えばよい。
清酒醸造に使用される酵母では例えば日本醸造協会で純粋培養して頒布されている協会6号酵母、協会7号酵母、協会9号酵母、協会10号酵母、協会11号酵母、協会12号酵母、協会13号酵母、協会14号酵母、協会601号酵母、協会701号酵母、協会901号酵母、協会1001号酵母等が挙げられ、焼酎酵母では例えば協会焼酎2号酵母、鹿児島工試酵母、宮崎工試酵母、泡盛1号酵母等が挙げられるが、ワイン酵母、シェリー酵母、ビール酵母、ウイスキー酵母、及びアルコール酵母でも本発明の方法により同様の結果が得られる。
【0010】
ここに得られるジオキサン類耐性株は、清酒酵母、焼酎酵母、ワイン酵母、シェリー酵母、ビール酵母、ウイスキー酵母、及びアルコール酵母等のいずれでも、エチルアルコール耐性を有するので、これらの酵母を用いて清酒、焼酎、ワイン、ビール、ウイスキー等の酒類を製造すれば、淡麗ですっきりした酒質の製品を製造することができる。更に、これらの酵母を用いて香気液を製造することも可能である。
【0011】
清酒、焼酎、ワイン、ビール、ウイスキー、香気液等の製造方法は特に限定するものではなく、一般的な方法に従って製造することができる。
【0012】
本発明において分離したジオキサン類耐性株からエチルアルコール耐性株を分離するには、例えば清酒酵母を例にとると、まず初めに一次スクリーニングとして耐エチルアルコール性試験を行い、親株よりもメチレンブルー染色率の低い株を選択し、その中で比較的メチレンブルー染色率の低い株に対して小仕込試験を行い、総炭酸ガス減量が親株より多く、エチルアルコール生成量、日本酒度の切れが親株よりよく、かつ上槽直前の酵母のメチレンブルー染色率の低い株を選択すればよい。
馴養株、変異処理株あるいは交雑株の中からジオキサン類耐性株を選択すると、かなりの高頻度でエチルアルコール耐性株が得られる。
この理由として自己消化の際働くプロテアーゼが抑制(発現量低下あるいは活性低下)されたか、あるいはジオキサン類により酵母の細胞膜の構造を変化してエチルアルコールに耐性な構造になったのではないかと推定される。
【0013】
後述する本発明の方法により分離された9D27株のジオキサン類に対する最小生育阻害濃度(以下、MICと略称する)は8.8%であり、イミダゾール系阻害剤(ミコナゾール、エコナゾール、クロトリマゾール等)に対しては耐性を示さないことから、クロトリマゾール耐性酵母とジオキサン類耐性酵母とではエチルアルコール耐性機構が異なるものと推定される。
本発明により得られるエチルアルコール耐性酵母は、純米酒などの日本酒度目標値の高い清酒製造においては、親株と比較して、日本酒度の切れに優れ、アミノ酸度の増加も少なく、従来にない淡麗辛口の清酒製造が可能となる。清酒以外の酒類の製造においても同様に従来にない淡麗ですっきりした酒質の製品の製造が可能となる。
【0014】
以下にその分離方法の1例を示す。
(酵母の処理方法並びに耐エチルアルコール性試験)
清酒用泡なし酵母、日本醸造協会901号(以下、K−901と略述する)株を、SD培地〔イーストニトロゲンベース(アミノ酸不含)0.67w/v%、グルコース2w/v%〕5mlで1日培養後、その50μlを1,4−ジオキサン(6.1%、6.3%、以下0.2%刻み9.0%まで)含有SD培地5mlに加えて、25℃で10日間静置培養した。その結果、K−901株は7.2%で生育が阻害されたので、MICは7.2%と判定した。なお、K−701株についても同様にMICを測定した結果、7.0%であった。
次に、K−901株を1,4−ジオキサン含有SD培地を用いて馴養し、ジオキサン類耐性株を取得した。
7.2%の1,4−ジオキサン含有SD培地で生育した株を0.2%増(7.4%)の1,4−ジオキサン含有SD培地に植え継ぎ、OD610nmの吸光度が2.0になるまで25℃で静置培養した。この操作を順次繰り返し、8.2%の1,4−ジオキサン含有SD培地、8.8%の1,4−ジオキサン含有SD培地で生育する変異株を平板寒天培地にてコロニーを分離した。
上記で得られた株に対して耐エチルアルコール性試験を行った。
YPD液体培地(酵母エキス1w/v%、ポリペプトン2w/v%、グルコース2w/v%)5mlで30℃にて前培養後、水で洗浄し0.3mlの滅菌水に懸濁した。麹汁培地(ブリックス度1.8、pH4.4)8.2mlにエチルアルコール1.8ml、培養した酵母菌体を加え、10℃で10日間静置後、メチレンブルー染色率を測定した。
【0015】
(エチルアルコール耐性の高い菌株の分離方法)
ジオキサン類耐性の馴養株のうち、耐エチルアルコール性試験でメチレンブルー染色率の低い菌株(9D9、9D18、9D27、9D30)について表1に示す仕込配合で総米200gの清酒の小仕込試験を行った。
【0016】
【表1】
【0017】
掛米は精米歩合77%(w/w)のα米〔セブンライス工業(株)製〕を使用した。麹は、精米歩合72%(w/w)の白米を用いて製造した。酵母は5ml中に1×109 個含むものを添加した。発酵温度は15℃一定で行った。留後18日目で上槽し、国税庁所定分析法に従って分析を行った。低沸点香気成分はヘッドスペースガスクロマトグラフィーにて測定した。一般分析の結果、いずれの変異株も親株(K−901株)より生成エチルアルコール濃度は高く、日本酒度の切れはよく、炭酸ガス減量は大きかった。以上の形質は、当該変異株がK−901株とは異なる新規酵母菌であることを示すものである。
【0018】
上記のように、本発明による菌株{馴養株:9D9、9D18、9D27、9D30}は、K−901株の変異株であるが、その菌学的性質を以下に示す。
(菌学的性質)
1.形態学的性質
YPD培地で30℃、2日間培養した後、顕微鏡で観察した。
a)形:卵円形
b)大きさ:長さ4.7〜7.9μm、幅3.8〜5.5μm
2.胞子形成:有り
胞子形成用培地(酢酸カリウム2w/v%、グルコース0.05w/v%、寒天2w/v%)で30℃、5日間培養し、顕微鏡で観察した。
3.増殖の形態:出芽
4.生化学的観察
a)糖の発酵性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地(ディフコ社製)をダーラム管入り試験管に分注して、当該4菌株を接種し、30℃で7日間培養して、その炭酸ガス発生の有無を観察した。
グルコース (+) ガラクトース (+)
スクロース (+) マルトース (+)
ラクトース (−) メリビオース (−)
ラフィノース(+)
b)糖の資化性
ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地(ディフコ社製)を用いて、オキザノグラフ法により、30℃、14日後の生育を観察した。
グルコース (+) ガラクトース (+)
スクロース (+) マルトース (+)
ラクトース (−)
c)硝酸塩の同化性:(−)
硝酸塩は硝酸カリウムとし、ウイッカーハムの炭素化合物同化試験用培地(ディフコ社製)を用いて、オキザノグラフ法により生育を観察した。
d)TTC染色:赤
e)β−アラニン培地、35℃での生育:(+)
5.高泡の形成
清酒の小仕込を行った結果、高泡の形成は観察されなかった。
以上、形態学的、生化学的結果は、本発明酵母4菌株がサッカロミセス・セレビシエに属する酵母菌であることを示すものである。また、清酒の小仕込試験において高泡の形成も認められないことから、当該4菌株はK−901株の変異株であることを示すものである。
6.薬剤に対する耐性
それぞれの薬剤を含むSD培地を用いて、30℃で3日間培養した。その結果を表2に示す。
【0019】
【表2】
【0020】
a)クロトリマゾール耐性
b)ミコナゾール耐性
c)エコナゾール耐性
【0021】
かくして、本発明により、K−901株を馴養させた後、ジオキサン類を含む培地で選択することによって、優れた発酵性能及び生成エチルアルコール存在下で強い発酵力を示し生成エチルアルコール濃度に対する耐性を有する酵母が提供された。
【0022】
代表的な菌株である9D27株は、Saccharomyces cerevisiae 9D27と表示し、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P−15497として寄託してある。
【0023】
本発明の清酒、焼酎及びその他の酒類の製造方法は、これらの酵母菌株を用いることを特徴とし、醸造方法は特に限定するものではない。
【0024】
【実施例】
次に、本発明の菌株を用いた酒類製造の具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【0025】
実施例1
ジオキサン類耐性変異株4株について、表1に示す仕込配合で清酒の製造を行った。掛米は、精米歩合77%(w/w)のα米〔セブンライス工業(株)製〕を使用した。麹は、精米歩合72%(w/w)の白米を用いて製造した。酵母は5ml中に1×109 個含むものを添加した。発酵温度は15℃一定で行い、留後18日目で上槽した。対照株として親株のK−901株を用いた。上槽液の分析結果を表3に示す。
【0026】
【表3】
【0027】
官能検査は3点法(1:良、2:普通、3:悪)で行い、パネラー10名の平均値で表した。
【0028】
この結果、ジオキサン類耐性株9D9株、9D18株、9D27株、及び9D30株は、親株よりも多量のエチルアルコールを生成し、醪の日本酒度の切れがよく、上槽清酒のアミノ酸度、グルコース、酵母の染色率は低かった。また、上槽清酒は、親株と比較して、官能的にも味と香りのバランスに優れていた。
【0029】
【発明の効果】
ジオキサン類に耐性を有する酵母の変異株から、発酵性能に優れ、エチルアルコールを高生成し、高濃度のエチルアルコール存在下でも死滅しにくいエチルアルコール耐性の新菌株を取得することができた。本発明による新規酵母菌を用いることにより、清酒製造においては、日本酒度の切れがよく、かつアミノ酸度の低い酒質劣化の少ない清酒を製造することができ、淡麗ですっきりした酒質の清酒の製造を行うことが可能となる。また、清酒以外の酒類の製造においても同様に淡麗ですっきりした酒質の製品の製造を行うことが可能となる。
Claims (3)
- エチルアルコール耐性及びジオキサン類耐性を有することを特徴とするサッカロミセス・セレビシエに属する酒類酵母変異株Saccharomyces cerevisiae 9D27株(FERM P−15497)。
- 請求項1に記載のサッカロミセス・セレビシエに属する酒類酵母変異株Saccharomyces cerevisiae 9D27株(FERM P−15497)を用いることを特徴とする酒類の製造方法。
- 酵母細胞の母集団から、ジオキサン類に対して耐性を示すサッカロミセス・セレビシエに属する酒類酵母変異株Saccharomyces cerevisiae 9D27株(FERM P−15497)を選択することを特徴とする請求項1に記載の酒類酵母変異株の取得方法。
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- 1996-03-12 JP JP8192896A patent/JP3835564B2/ja not_active Expired - Lifetime
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