JP2003093092A - エタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地、同酵母株の分離法及び同酵母株を用いる含塩醗酵食品の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】醤油諸味液汁での培養評価試験を行うことな
く、醤油主発酵酵母のエタノール醗酵能を非常に簡単
に、正確かつ迅速に評価できる培地を得る。また同培地
を用いてエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株を確実に
分離する。また分離された酵母株を醤油製造などに用い
て、エタノール発酵の適正化と迅速化を図り、３．５〜
３．８％のエタノールを含有する醤油諸味液汁（生醤
油）、及び芳醇な風味を有する熟成味噌を、確実にしか
も容易に得る。 【解決手段】酵母用栄養培地に３．５〜１０％グルコー
ス及び０．８〜１．２％塩化マンガンを含み、１％以上
の食塩を含まない寒天培地。酵母用栄養培地に３．５〜
１０％グルコース及び０．１２〜０．２４％硫酸銅を含
み、１％以上の食塩を含まない寒天培地。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、エタノール高生産
性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地、同培地を用
いるエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離法並び
に同培地により分離されたエタノール高生産性醤油主醗
酵酵母株を用いる、醤油及び味噌などの含塩醗酵食品の
製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】醤油は大豆及び小麦蛋白質を麹菌酵素に
より加水分解して得られる調味料であると同時に、耐塩
性の醤油酵母及び醤油乳酸菌の醗酵作用による発酵調味
料でもあり、醤油醸造において、それらの微生物管理は
品質のよい醤油を製造するための重要な因子である。

【０００３】醤油醸造に関わる耐塩性の醤油酵母には、
分類学的にはチゴサッカロマイセスルーキシー（Ｚｙｇ
ｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）の１属
１種に属し、１０〜２０％の塩化ナトリウムの存在下で
もグルコースをもとに旺盛なエタノール醗酵を行なう能
力を有することから、主に醤油諸味のエタノール醗酵に
寄与する醤油主発酵酵母と、この醤油主発酵酵母による
エタノール発酵が終了した頃から活躍し始めて、主とし
て醤油特有の香気の生成に関与する、かつては後熟酵母
群とも呼ばれていた、耐塩性キャンディダ（Ｃａｎｄｉ
ｄａ）属酵母ないしは耐塩性トルロープシス（Ｔｏｒｕ
ｌｏｐｓｉｓ）属酵母とがある（栃倉辰六郎編著、醤油
の科学と技術、日本醸造協会、１６３〜１７０ （１９
８８））。

【０００４】この醤油主醗酵酵母と後熟酵母群とを分離
識別する方法としては、下記のものが既に報告されてい
る。 （１）醤油主醗酵酵母は高濃度の塩化ナトリウム存在下
でもマルトースを資化できるが、後熟酵母群（例えば耐
塩性トルロープシス属酵母）は資化できないので、この
高塩下におけるマルトース資化性の差を利用して、マル
トースを唯一の炭素源とする加塩寒天栄養平板培地上で
の生育の有無に基づいて、これらの酵母を分離識別する
（茂木恵太郎ら、農化、４２、４６６ （１９６
８））。 （２）後熟酵母群は、１８％の塩化ナトリウム存在下、
かつｐＨ４．５以上の条件下において、亜鉛イオンに対
する耐性を示すが、醤油主醗酵酵母はその耐性を持たな
いことを利用して、１８％塩化ナトリウム及び特定濃度
の亜鉛イオン（塩化亜鉛）ないしはリチウムイオン（リ
チウムイオン）を含有することを特徴とする寒天栄養平
板培地上での生育の有無に基づいて、これらの酵母を分
離識別する（馬場林留ら、農化、５１、２６１ （１９
７７））。以下、これらの培地をそれぞれ「Ｚ培地」及
び「Ｌ培地」と略す。 （３）醤油主醗酵酵母はオルソバニリンにより生育が阻
害されないが、後熟酵母群（例えば耐塩性トルロープシ
ス属酵母）は生育が阻害されることを利用して、オルソ
バニリン加寒天栄養平板培地上での生育の有無に基づい
て、これらの酵母を分離識別する（奥沢洋平ら、醤研、
６、１３８（１９８０））。この培地を「ＯＶ培地」と
略す。

【０００５】（４）しかしながら、一概に醤油主醗酵酵
母と言っても、株によってその性質は異なっており、醤
油諸味中での増殖能やエタノール醗酵能にも大きな違い
がある。そのために、実際の醤油醸造工程の諸味中に
は、多数の醤油主醗酵酵母株が混在して、醤油主醗酵酵
母叢を形成しているが、これらの醤油主醗酵酵母株のす
べてが醤油諸味のエタノール醗酵に同等に関与している
わけではなく、主にエタノール醗酵を担っている株はほ
んのごく少数に過ぎないことを、醤油主醗酵酵母叢のフ
ローラ解析を通じて確認した。

【０００６】このような、醤油諸味のエタノール醗酵を
担っている主要株の性質としては、（１）諸味中での増
殖が良好であり、それゆえにエタノール醗酵過程におけ
る諸味中での醤油主醗酵酵母叢に占めるその株の占有率
が高く、（２）しかも株そのもののエタノール生産性が
高いことが必要であろうと推察される。

【０００７】醤油主醗酵酵母株のエタノール生産性を評
価する従来の方法としては、１０〜２０％塩化ナトリウ
ムを含む酵母用栄養培地（以下、「Ｃ培地」と略す）
か、あるいはオルソバニリン及び１０〜１８％塩化ナト
リウムを含む酵母用栄養培地「ＯＶ培地」に適当量の被
検菌を塗抹して、３０℃条件下で３〜１０日間培養し、
寒天培地上に形成された醤油主醗酵酵母株のコロニーに
ついて、あるいは更に１８％塩化ナトリウムを含む酵母
用栄養培地「Ｌ」培地上で生育が阻害される事を調べた
上で、これらのコロニーを無作為ないしは全数釣菌し
て、醤油諸味又は諸味液汁に個別接種して、更に３０℃
条件下で所定時間培養して、それぞれのエタノール生産
量ないしは炭酸ガス生産量をガスクロマトグラフィー法
などによりいちいち計測し、それぞれの株の乾燥ないし
は湿菌体重量当たり、時間当たりのエタノール生産量な
いしは炭酸ガス生産量を算出して、この値を株間で比較
することを通して評価する方法しかなく、多大な時間と
労力を要する面倒な作業である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、醤油
諸味中での被検菌の増殖能検査や諸味又はその液汁での
培養評価試験を行うことなく、醤油主発酵酵母のエタノ
ール醗酵能を非常に簡単に、正確かつ迅速に評価できる
培地を得ること、また同培地を用いてエタノール高生産
性醤油主醗酵酵母株を確実に分離すること、またさらに
分離されたエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株を醤油
製造などに用いて、エタノール発酵の適正化と迅速化を
図り、優れた風味を有する醤油及び味噌などの含塩醗酵
食品を得ることにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の目的
を達成するために、鋭意研究を重ねた結果、醤油諸味中
に混在する多数の醤油酵母の中から、まず従来公知の醤
油主醗酵酵母と後熟酵母群とを分離識別する方法、例え
ばＯＶ培地及びＬ培地を利用して醤油諸味、或いは発酵
熟成中の味噌から醤油主醗酵酵母株のみを分離した。そ
して得られた醤油主醗酵酵母株の集団を「特定濃度のグ
ルコース及び硫酸銅を含む寒天培地」及び／又は「特定濃
度のグルコース及び塩化マンガンを含む寒天培地」に接
種し、生育が観察されたコロニーから高頻度にエタノー
ル高生産性株のみを簡便かつ迅速に分離できること、ま
たこの培地を用いて分離した醤油主醗酵酵母株が醤油諸
味中で、或いは味噌の発酵熟成中に比較的高いエタノー
ル生産性を示すという新事実を発見した。以下、この点
について詳述する。 （１）本発明者は、醤油主発酵酵母株の集団を、１〜３
％（Ｗ／Ｖ（＝５５〜１６０ｍＭ））グルコースを加え
た醤油主醗酵酵母用の無塩栄養培地に、更に０．８〜
１．２％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガンを添加含有させた培地
に接種培養すると、ほとんどすべての醤油主醗酵酵母株
の生育が阻害され、培地上に集落が形成されない。しか
し、グルコース濃度を３．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）に高め
てやると、０．８〜１．２％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガンが
加えられた無塩培地であっても、醤油主醗酵酵母株の中
でも一部の株については生育が認められる（加糖による
マンガン耐性能の獲得）ようになることを知った。そし
て、添加するグルコース濃度を、この濃度範囲内でより
低く制限した場合に生育してくる株のエタノール生産性
を調べてみると、いずれの株もが高いエタノール生産性
を示すことを知った。なお、無塩培地における「無塩」
とは、１％（Ｗ／Ｖ）以上の食塩を含まないことを意味
する。 （２）また１〜３％（Ｗ／Ｖ（＝５５〜１６０ｍＭ））
グルコースを加えた醤油主醗酵酵母用の無塩栄養培地に
更に０．１２〜０．２４％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅を加える
と、ほとんどすべての醤油主醗酵酵母株の生育が阻害さ
れ、培地上に集落が形成されない。しかし、グルコース
濃度を３．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）以上に高めてやると、
０．１２〜０．２４％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅が加えられた無
塩培地であっても、醤油主醗酵酵母株の中でも一部の株
については生育が認められる（加糖による銅耐性能の獲
得）ようになることを知った。そして添加するグルコー
ス濃度を、この濃度範囲内でより低く制限した場合に生
育してくる株のエタノール生産性能を調べてみると、い
ずれの株もが高いエタノール生産性を示すことを知っ
た。

【００１０】本発明は、これらの知見に基づいて完成し
たものであって、すなわち本発明は、 （１）酵母用栄養培地に３．５〜１０％（Ｗ／Ｖ）グル
コース及び０．８〜１．２％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガンを
含み、１％（Ｗ／Ｖ）以上の食塩を含まないエタノール
高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培地であ
る。 （２）また本発明は、酵母用栄養培地に３．５〜１０％
（Ｗ／Ｖ）グルコース及び０．１２〜０．２４％（Ｗ／
Ｖ）硫酸銅を含み、１％（Ｗ／Ｖ）以上の食塩を含まな
いエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒
天培地である。 (３)また本発明は、被検菌を、上記(１)及び／又は(２)
に記載の培地に接種し、培地上で生育が観察されたコロ
ニーから目的とする株を分離することを特徴とするエタ
ノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離法である。 (４)また本発明は上記分離法で分離されたエタノール高
生産性醤油酵母株を用いることを特徴とする、醤油及び
味噌などの含塩発酵食品の製造法である。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。

【００１２】本発明を実施するには、まず通常の醤油主
発酵酵母株を分離法に従い、既知の寒天培地(Ｃ培地)、
奥沢らの方法による寒天培地（ＯＶ培地）及び馬場らの
方法による寒天培地（Ｌ培地）を利用して醤油諸味中に
混在する多数の醤油酵母の中から醤油主醗酵酵母株のみ
を分離する。これら３種類の培地組成及びその調製法の
詳細を以下に示す。

【００１３】Ｃ培地の培地組成：３．０％（Ｗ／Ｖ）グ
ルコース、０．５％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス［ＤＩＦＣＯ
製］、０．５％（Ｗ／Ｖ）燐酸二水素カリウム、０．０
５％（Ｗ／Ｖ）硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄・４Ｈ
₂Ｏ）、１０〜２０％塩化ナトリウム、２．２％寒天
（ｐＨ４．８〜５．２） 調製法：培地成分を蒸留水に
溶かし、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ４．８〜
５．２に調整してから、更に蒸留水を加えて容量を整
え、加圧加熱殺菌器で１２１℃、１５分間殺菌する。殺
菌した培地は、無菌条件下でその１０ｍｌずつを無菌の
シャーレに分注し、冷却して固め、Ｃ培地とした。

【００１４】ＯＶ培地の基本培地組成：３％（Ｗ／Ｖ）
グルコース、０．４％（Ｗ／Ｖ）カザミノ酸［ＤＩＦＣ
Ｏ製］、０．２％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス［ＤＩＦＣＯ
製］、０．１％（Ｗ／Ｖ）燐酸二水素カリウム、０．０
５％（Ｗ／Ｖ）硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄・４Ｈ
₂Ｏ）、０．０１％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム（ＣａＣ
ｌ₂・２Ｈ₂Ｏ）、１８％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウム、
２．２％（Ｗ／Ｖ）寒天（ｐＨ４．９）。

【００１５】ＯＶ培地の調製法：基本培地成分を蒸留水
に溶かし、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ４．９
に調整してから、更に蒸留水を加えて容量を整え、加圧
加熱殺菌器で１２１℃、１５分間殺菌する。殺菌した培
地１００ｍｌは、４６±２℃にまで冷却した後、無菌条
件下で８ｍｇ／ｍｌのオルソバリニンを含む９９．５％
エタノール溶液１ｍｌを加えてよくかき混ぜ、その１０
ｍｌずつを無菌のシャーレに分注し、冷却して固め、Ｏ
Ｖ培地とした。

【００１６】Ｌ培地の組成：３％（Ｗ／Ｖ）グルコー
ス、０．４％（Ｗ／Ｖ）カザミノ酸［ＤＩＦＣＯ製］、
０．２％（Ｗ／Ｖ）酵母エキス［ＤＩＦＣＯ製］、０．
１％（Ｗ／Ｖ）燐酸二水素カリウム、０．０５％（Ｗ／
Ｖ）硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ）、０．０
１％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂・２Ｈ
₂Ｏ）、０．４２％（Ｗ／Ｖ）塩化リチウム、１８％
（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウム、２．２％（Ｗ／Ｖ）寒天
（ｐＨ４．９）。

【００１７】Ｌ培地の調製法：培地成分を蒸留水に溶か
し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ４．９に調整
してから、更に蒸留水を加えて容量を整え、加圧加熱殺
菌器で１２１℃、１５分間殺菌する。この培地１０ｍｌ
ずつを無菌条件下でシャーレに分注し、冷却して固め、
Ｌ培地とした。

【００１８】次に本発明は、この得られた醤油主醗酵酵
母株の集団、すなわち被検菌を、「酵母の生育可能な酵
母用栄養培地であって、特定濃度のグルコース及び硫酸
銅を含む寒天培地(以下、Ｍｎ培地という)」及び／又は
「酵母の生育可能な酵母用栄養培地であって、特定濃度
のグルコース及び塩化マンガンを含む寒天培地(以下、
Ｃｕ培地という)」に対して、接種培養し、培地上で生育
が観察されたコロニーを釣菌してエタノール高生産性株
を得ることができる。

【００１９】上記、酵母用栄養培地としては、適当なＮ
源、Ｃ源、及びこれらに必要により各種ビタミン、無機
塩類（ミネラル）などを含有させた、酵母が旺盛に生育
可能な任意の培地（ｐＨ４．８〜５．４）が挙げられ、
例えばイーストカーボンベース及び硫酸アンモニウムか
ら構成される培地（ｐＨ４．８〜５．４）、あるいはグ
ルコース、酵母エキス、各種無機塩類及びこれらに必要
によりカザミノ酸を加えた構成からなる培地（ｐＨ４．
８〜５．４）などが挙げられる。

【００２０】以下にＭｎ培地とＣｕ培地の組成及び調製
法の詳細を示す。Ｍｎ培地の培地組成としては、上記に
挙げた培地が挙げられるが、特に、酵母用栄養培地に
７．５（Ｗ／Ｖ）グルコース及び１．０％（Ｗ／Ｖ）塩
化マンガンを含み食塩を含まない培地が好ましい。すな
わち、５．８５％（Ｗ／Ｖ）イースト・カーボン・ベー
ス（ＹｅａｓｔＣａｒｂｏｎ Ｂａｓｅ）［ＤＩＦＣＯ
製、５．８５％のうち５％はグルコースが占める］、
２．５％（Ｗ／Ｖ）グルコース、０．７％（Ｗ／Ｖ）硫
酸アンモニウム、１．０％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガン、
２．０％（Ｗ／Ｖ）寒天（ｐＨ５．４）が好ましい。

【００２１】Ｍｎ培地の調製法：５．８５ｇイースト・
カーボン・ベース、０．７ｇ、硫酸アンモニウムを蒸留
水に溶かし、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ５．
４に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を２５ｍｌと
する（以下、これを「Ａ液」と略す）。これとは別に、
１．０ｇ塩化マンガンを蒸留水２５ｍｌに（以下、これ
を「Ｂ液」と略す）、また２．５ｇグルコース及び２．
０ｇ寒天を蒸留水５０ｍｌに溶かす（以下、これを「Ｃ
液」と略す）。Ｂ液及びＣ液は加圧加熱殺菌器で１２１
℃、１５分間殺菌し、またＡ液は無菌条件下でワットマ
ン製シリンジフィルター（２５ｍｍＧＤ／Ｘ）を用いて
除菌濾過し、無菌化する。加熱殺菌の済んだＢ液及びＣ
液は４６±２℃にまで冷却した後、無菌条件下でＡ液２
５ｍｌ、Ｂ液２５ｍｌ、Ｃ液５０ｍｌの割合ですばやく
混合し、その混合液１０ｍｌずつを無菌シャーレに流し
込んで固め、Ｍｎ培地とする（Ａ液、Ｂ液、Ｃ液を混合
すると、Ｂ液中の塩化マンガンが不溶化して、培地が白
濁するので、すばやく混合してシャーレに分注しない
と、シャーレ一枚一枚ごとに培地に含まれる塩化マンガ
ンの濃度に誤差を生ずることになるので注意する）。

【００２２】Ｃｕ培地の培地組成としては、上記に挙げ
た培地が用いられるが、特に酵母用栄養培地に４．０％
（Ｗ／Ｖ）グルコース及び０．２％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅を
含み食塩を含まない培地が好ましい。すなわち、４．６
８％（Ｗ／Ｖ）イースト・カーボン・ベース（Ｙｅａｓ
ｔＣａｒｂｏｎ Ｂａｓｅ）［ＤＩＦＣＯ製、４．６８
％のうち４％はグルコースが占める］、０．７％（Ｗ／
Ｖ）硫酸アンモニウム、０．２％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅、
２．０％（Ｗ／Ｖ）寒天（ｐＨ５．４）が好ましい。

【００２３】Ｃｕ培地の調製法：４．６８ｇイースト・
カーボン・ベース、０．７ｇ硫酸アンモニウムを蒸留水
に溶かし、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ５．４
に調整した後、更に蒸留水を加えて全量を２５ｍｌとす
る（以下、これを「ａ液」と略す）。これとは別に、
０．２ｇ硫酸銅を蒸留水２５ｍｌに（以下、これを「ｂ
液」と略す）、また２．０ｇ寒天を蒸留水５０ｍｌに溶
かす（以下、これを「ｃ液」と略す）。ｂ液及びｃ液は
加圧加熱殺菌器で１２１℃、１５分間殺菌し、またａ液
は無菌条件下でワットマン製シリンジフィルター（２５
ｍｍＧＤ／Ｘ）を用いて除菌濾過し、無菌化する。加熱
殺菌の済んだｂ液及びｃ液は４６±２℃にまで冷却した
後、無菌条件下でａ液２５ｍｌ、ｂ液２５ｍｌ、ｃ液５
０ｍｌの割合ですばやく混合し、その混合液１０ｍｌず
つを無菌シャーレに流し込んで固め、Ｃｕ培地とする。

【００２４】次に、こうして得られた醤油主醗酵酵母株
は、生醤油液体培地などによりエタノール生産性を調
べ、評価した後本発明のに用いるエタノール高生産性醤
油主醗酵酵母株として醤油或いは味噌など含塩発酵食品
に利用される。

【００２５】生醤油液体培地の調製法を以下に示す。生
醤油液体培地の調製法：仕込み後３５日目の醤油諸味
（ｐＨ５．１〜５．３）を濾紙（東洋濾紙社製、ＡＤＶ
ＡＮＴＥＣ−ＴＯＹＯ．Ｎｏ．２）して得られる濾液
を、無菌条件下でワットマン社製シリンジフィルター
（２５ｍｍＧＤ／Ｘ）を用いて除菌濾過し、無菌化して
調製する。

【００２６】

【実施例】実施例１ Ｍｎ培地の培地の調製例 （Ｍｎ培地の培地組成）：５．８５％（Ｗ／Ｖ）イース
ト・カーボン・ベース（Ｙｅａｓｔ ＣａｒｂｏｎＢａ
ｓｅ）［ＤＩＦＣＯ製、５．８５％のうち５．０％はグ
ルコースが占める］、２．５％（Ｗ／Ｖ）グルコース、
０．７％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモニウム、１．０％（Ｗ／
Ｖ）塩化マンガン、２．０％（Ｗ／Ｖ）寒天（ｐＨ５．
４） （Ｍｎ培地の調製法）：５．８５ｇイースト・カーボン
・ベース、０．７ｇ硫酸アンモニウムを蒸留水に溶か
し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ５．４に調整
した後、更に蒸留水を加えて全量を２５ｍｌとする（以
下、これを「Ａ液」と略す）。これとは別に、１．０ｇ
塩化マンガンを蒸留水２５ｍｌに（以下、これを「Ｂ
液」と略す）、また２．５ｇグルコース及び２．０ｇ寒
天を蒸留水５０ｍｌに溶かす（以下、これを「Ｃ液」と
略す）。Ｂ液及びＣ液は加圧加熱殺菌器で１２１℃、１
５分間殺菌し、またＡ液は無菌条件下でワットマン社製
シリンジフィルター（２５ｍｍＧＤ／Ｘ）を用いて除菌
濾過し、無菌化する。加熱殺菌の済んだＢ液及びＣ液は
４６±２℃にまで冷却した後、無菌条件下でＡ液２５ｍ
ｌ、Ｂ液２５ｍｌ、Ｃ液５０ｍｌの割合ですばやく混合
し、その混合液１０ｍｌずつを無菌シャーレに流し込ん
で固め、Ｍｎ培地とする（Ａ液、Ｂ液、Ｃ液を混合する
と、Ｂ液中の塩化マンガンが不溶化して、培地が白濁す
るので、すばやく混合してシャーレに分注しないと、シ
ャーレ一枚一枚ごとに培地に含まれる塩化マンガンの濃
度に誤差を生ずることになるので注意する）。

【００２７】実施例２ Ｃｕ培地の培地の調製例 （Ｃｕ培地の培地組成）：４．６８％（Ｗ／Ｖ）イース
ト・カーボン・ベース（Ｙｅａｓｔ Ｃａｒｂｏｎ Ｂ
ａｓｅ）［ＤＩＦＣＯ製、４．６８％のうち４．０％は
グルコースが占める］、０．７％（Ｗ／Ｖ）硫酸アンモ
ニウム、０．２％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅、２．０％（Ｗ／
Ｖ）寒天（ｐＨ５．４） （Ｃｕ培地の調製法）：４．６８ｇイースト・カーボン
・ベース、０．７ｇ硫酸アンモニウムを蒸留水に溶か
し、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨ５．４に調整
した後、更に蒸留水を加えて全量を２５ｍｌとする（以
下、これを「ａ液」と略す）。これとは別に、０．２ｇ
硫酸銅を蒸留水２５ｍｌに（以下、これを「ｂ液」と略
す）、また２．０ｇ寒天を蒸留水５０ｍｌに溶かす（以
下、これを「ｃ液」と略す）。ｂ液及びｃ液は加圧加熱
殺菌器で１２１℃、１５分間殺菌し、またａ液は無菌条
件下でワットマン製シリンジフィルター（２５ｍｍＧＤ
／Ｘ）を用いて除菌濾過し、無菌化する。加熱殺菌の済
んだｂ液及びｃ液は４６±２℃にまで冷却した後、無菌
条件下でａ液２５ｍｌ、ｂ液２５ｍｌ、ｃ液５０ｍｌの
割合ですばやく混合し、その混合液１０ｍｌずつを無菌
シャーレに流し込んで固め、Ｃｕ培地とする。

【００２８】実施例３ （エタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離法）試料
として醤油諸味５ｇを採取し、通常の方法でホモジナイ
ズした後、殺菌した１０％塩化ナトリウム水溶液４５ｍ
ｌに懸濁した。この懸濁液を２〜３分静置して固形物を
沈殿させた後、その上清液０．１ｍｌを、殺菌した１０
％塩化ナトリウム水溶液９．９ｍｌで希釈した。上記の
Ｃ培地及びＯＶ培地に、この希釈液０．１ｍｌを各々塗
抹した。これらの培地を３０℃の培養器に入れ、７日間
放置した。その結果、培地１枚当たり平均１６０個のコ
ロニーが出現した。Ｃ培地上に出現したコロニーの中か
ら１０個、ＯＶ培地上に出現したコロニーを更にＬ培地
に植え継ぎ、Ｌ培地上では生育が観察されなかったコロ
ニーの中から１０個をそれぞれ無作為に釣菌し、前者の
コロニーをＣ−１〜１０株、後者をＯＶ−１〜１０株と
命名した（図１：酵母株の分離手順参照）。また、これ
とは別に、ＯＶ培地上ではコロニーを形成したが、Ｌ培
地上では生育が観察されなかったコロニーすべてを釣菌
してＭｎ培地及びＣｕ培地に植え継ぎ、３０℃で３〜７
日間培養した後、このＭｎ培地及びＣｕ培地上で生育が
観察されたコロニーの中からそれぞれ１０個を無作為に
釣菌して、これらのコロニーをＭｎ−１〜１０株及びＣ
ｕ−１〜１０株と命名した（図１参照）。更にＭｎ培地
上で生育が観察されたコロニーすべてを釣菌してＣｕ培
地に植え継ぎ、３０℃で３〜７日間培養した後、このＣ
ｕ培地上で生育が観察されたコロニーの中から１０個を
無作為に釣菌して、これらのコロニーをＣｕＭｎ−１〜
１０株と命名した（図１参照）。これらのＣ−１〜１０
株、ＯＶ−１〜１０株、Ｍｎ−１〜１０株、Ｃｕ−１〜
１０株、ＣｕＭｎ−１〜１０株の計５０株を、それぞれ
１５％（Ｖ／Ｖ）濃口生醤油、７％グルコース（Ｗ／
Ｖ）、８．５％（Ｗ／Ｖ）ＮａＣｌから構成される生醤
油液体培地（ｐＨ５．２）中で３０℃、７２時間振とう
培養（１４０ｒｐｍ）した種培養液を得た。次いで、上
記微生物をそれぞれ５０本の前記生醤油液体培地１０ｍ
ｌに対して１×１０⁷個／ｍｌずつ接種し、３０℃で２
４時間培養した後、培養液中に生産されたエタノールの
量をガスクロマトグラフィー法にて測定し、これを「エ
タノール生産性値」とした。測定結果を表１〜表５に示
す。

【００２９】

【表１】

【００３０】

【表２】

【００３１】

【表３】

【００３２】

【表４】

【００３３】

【表５】

【００３４】表１に示す通り、Ｃ培地で分離した酵母株
（Ｃ−１〜１０株）のエタノール生産性は０．１１〜
１．３１％(平均０．６４９％)を示し、一方表２に示す
通り、ＯＶ培地及びＬ培地で分離した酵母株(ＯＶ−１
〜１０株)のそれは０．８３〜１．５８％(平均１．１４
１％)を示し、いずれも低濃度のエタノール生産性を示
すことが判る。これに対し、表３に示す通り、Ｍｎ培地
で分離した酵母株（Ｍｎ−１〜１０株）のそれは１．３
１〜１．６９％（平均１．５３３％）を示し、また表４
に示す通りＣｕ培地で分離した酵母株（Ｃｕ−１〜１０
株）のそれは１．４８〜１．７２％(平均１．５９５)を
示し、更にまた表５に示す通りＭｎ培地及びＣｕ培地で
分離した酵母株（ＣｕＭｎ−１〜１０株）のそれは１．
５６〜１．７６％(平均１．６３７)を示すことが判る。
これらの結果から、本発明によれば、従来法で得られる
エタノール生産性醤油主発酵酵母（ＯＶ−１〜１０株）
（エタノール生産性：平均１．１４１％）に比べて、３
４〜４３％も高いエタノール生産性を有する醤油主発酵
酵母株のみを、高頻度で分離できることが判る。

【００３５】先にも記した通り、醤油諸味中に存在する
酵母には、主として醤油諸味エタノール醗酵に寄与する
醤油主醗酵酵母の他にも、エタノール醗酵は微弱で醤油
独特の香り成分の生産に関与する、キャンディダ バー
サティルス（Ｃａｎｄｉｄａｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ）な
どに代表される後熟酵母群があるが、ＯＶ培地にはこの
後者、後熟酵母群の生育を抑える働きがあるために、培
地上に形成されたコロニーは主としてエタノール醗酵に
寄与する醤油主醗酵酵母の株のみであり、Ｌ培地には逆
に醤油主醗酵酵母の株のみの生育を阻害する働きがある
ために、ＯＶ培地ではコロニーを形成するものの、Ｌ培
地では生育できない株は醤油主醗酵酵母の株に限定され
るのに対して、Ｃ培地にはそのような選抜効果がないた
めに、醤油諸味のエタノール醗酵にあまり寄与しない後
熟酵母群の株のコロニーも混在しているために、ＯＶ−
１〜１０株に較べてＣ培地から釣菌された１０株、すな
わちＣ−１〜１０株によるエタノール生産性はより低く
なった。また、Ｍｎ培地及びＣｕ培地の両方を用いて分
離した株１０株（ＣｕＭｎ−１〜１０株）のエタノール
生産性は、１．５６〜１．７６％と更に高い値を示し、
Ｍｎ培地及びＣｕ培地を併用することにより、より効率
的にエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株を分離するこ
とができることが確認された。このことから、本発明
は、エタノール高生産性醤油主醗酵酵母株の迅速かつ効
率的で簡便な分離識別法として有効である。

【００３６】実施例４ 実施例３にて分離したＣｕＭｎ−８株を用いた小規模の
醤油醸造試験 本発明の方法にしたがって醤油諸味から分離されたエタ
ノール高生産性醤油主醗酵酵母株ＣｕＭｎ−８株につい
て、小規模の醤油醸造試験を行い、そのエタノール生産
性を試験した。実際の醤油醸造工程における諸味仕込み
工程は、通常、完全な無菌状態ではないために、半年か
ら長い場合には一年以上の時間を要して醸造される醤油
諸味に野生酵母株が混入するのはごく当たり前のことで
あり、醤油の品質向上や生産性の効率化の目的のために
選抜したある種の醤油主醗酵酵母株を醤油諸味中に添加
したとしても、醸造中に混入した野生酵母株の諸味中に
おける生存性の方が強く、添加酵母株が駆逐されてしま
い、結果的に選抜株の添加効果を生み出さず、緩慢なエ
タノール生産を引き起こす場合も少なくない。そこで、
本発明において分離されたＣｕＭｎ−８株を種酵母とし
た小規模の醤油醸造試験を行い、醤油諸味のエタノール
醗酵を観察するとともに、本株の諸味中における生存
性、すなわち諸味中に含まれる醤油主醗酵酵母群に占め
るＣｕＭｎ−８株の比率を調べた。

【００３７】諸味の調製は、関根らの方法（醤研、１
３、１４９ （１９８７））に従った。また、諸味に添
加するＣｕＭｎ−８株の種酵母液は、７．０％（Ｗ／
Ｖ）グルコース、１５％（Ｖ／Ｖ）濃口生醤油、８．５
％（Ｗ／Ｖ）塩化ナトリウムから構成されるｐＨ５．２
の液体培地で、３０℃、３日間振盪培養したものを用
い、諸味への添加（接種）時期は諸味のｐＨが５．３を
示した時点とし、添加量は添加後の諸味中の菌数が１０
⁵ｃｆｕ／ｇとなるように調節した。種酵母液を添加し
て撹拌してやると、醤油諸味は直ちにエタノール醗酵を
開始するため、添加後毎日諸味を採取して、その諸味を
適宜希釈してＣ培地及びＯＶ培地に塗抹し、３０℃条件
下で、Ｃ培地は３日間、ＯＶ培地は７日間培養した後、
ＯＶ培地上に形成されたすべてのコロニーを釣菌してＬ
培地上及びＣ培地上に接種し、Ｌ培地上で生育が観察さ
れなかったコロニーの数を計測するとともに、このＬ培
地上で生育しなかったコロニーに相当するＣ培地上のコ
ロニーすべてを釣菌して、まずＭｎ培地に接種し、本培
地上で生育してコロニーを形成した株のみを更にＣｕ培
地に植え継いで、本培地上でも生育してコロニーを形成
した株の数を計測した。そして、Ｃ培地上に形成された
コロニーの数を諸味中に存在する醤油酵母の数、ＯＶ培
地ではコロニーを形成したが、Ｌ培地では生育しなかっ
たコロニーの数を醤油主醤油酵母の数、Ｍｎ培地及びＣ
ｕ培地上でも生育性を示したコロニーの数を添加したＣ
ｕＭｎ−８株と見做し、醤油酵母ないしは醤油主醗酵酵
母に占めるＣｕＭｎ−８株の比率を算出した。以上、小
規模の醤油醸造試験における、醤油諸味中における醤油
酵母数及び醤油主発酵酵母数の変化とこれらに占めるＣ
ｕＭｎ−８株の比率の変化を調べた結果を表６に示す。

【００３８】

【表６】

【００３９】表６の結果から、添加したＣｕＭｎ−８株
は諸味中に混在する野生酵母群の中においても良好で旺
盛な増殖を示し、諸味中エタノール濃度の迅速な上昇に
伴い、その醤油酵母群ないしは醤油主醗酵酵母群に占め
る割合も高まり、醤油酵母群に占める割合に換算した場
合には最大８０．０％、醤油主醗酵酵母群に占める割合
に換算した場合には最大９２．９％にまで到達した。本
試験を通じて、本発明の方法にしたがって分離したＣｕ
Ｍｎ−８株は、醤油諸味中に添加した場合に、混在する
野生酵母群を越える増殖を示して、その醤油酵母群に占
める割合を高め、きわめて迅速かつ安定的なエタノール
生産を成就したことが確認された。

【００４０】実施例５ 実施例３にて分離されたＣｕＭｎ−８株及びＯＶ−２株
の同種２株混合培養系における、培養経過に伴うＣｕＭ
ｎ−８株及びＯＶ−２株の増殖と、酵母群全体に占める
比率の変化試験例 上記２の試験において確認された、他の醤油酵母株の混
在条件下におけるＣｕＭｎ−８株の旺盛な増殖をより厳
密に確認する目的で、７．０％（Ｗ／Ｖ）グルコース、
１５％（Ｖ／Ｖ）濃口生醤油、８．５％（Ｗ／Ｖ）塩化
ナトリウムから構成される、ｐＨ５．２に調整された液
体培地で３０℃、２〜３日間培養して、生育活性を安定
化させたＣｕＭｎ−８株、実施例１にて分離された、Ｃ
ｕ培地及びＭｎ培地上で生育しないＯＶ−２株を同一の
同組成の液体培地中に、１０⁵ｃｆｕ／ｍｌずつ接種し
て、３０℃条件下で２日間混合培養した。培養の終了し
た培養液を殺菌済みの１０％塩化ナトリウム水溶液で適
宜希釈した後、Ｃ培地及びＣｕ培地上に塗抹して、３０
℃条件下で、Ｃ培地は３日間培養し、培地上に形成され
たコロニーの数を計測してから、このコロニーすべてを
Ｃｕ培地及びＭｎ培地に植え継ぎ、両培地上でも生育し
てコロニーを形成する株の数を計測、Ｃ培地上のコロニ
ー数を全酵母数、Ｃｕ培地及びＭｎ培地上でコロニー数
をＣｕＭｎ−８株、両培地上で生育しない株の数をＯＶ
−２株と見做し、全酵母数に占めるＣｕＭｎ−８株及び
ＯＶ−２株の比率を調べた。結果（液体培地中での同種
酵母２株混合培養系における培養前後の総酵母数に占め
る各株の比率の変化）を図２に示す。

【００４１】図２に示す通り、ＣｕＭｎ−８株はＯＶ−
２株との混在下においても高い増殖性を示してＯＶ−２
株を駆逐し、培養終了後には全酵母数１．６×１０⁸ｃ
ｆｕ／ｍｌ中の８８．７％をＣｕＭｎ−８株が占める形
に変化することが確認された。この試験からも、本発明
の方法を用いて分離した株の良好な増殖性が確認され
た。

【００４２】実施例６ 実験室株を供試株とした高エタノール生産性株の選択試
験例 種々の研究機関において保管されているチゴサッカロマ
イセス ルーキシー（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）には、分離源が醤油や味噌に限ら
ず、蜂蜜やジャム、シロップなどから分離された株も存
在する。そして、経験的に、これらの醤油や味噌以外の
分離源から分離された株は、分類学的には同属同種のチ
ゴサッカロマイセス ルーキシーであっても、醤油諸味
や味噌に人為的に接種した場合にも、エタノール生産性
は低く、あるいは生育自体が不良な場合が多い。同属同
種のチゴサッカロマイセス ルーキシーであっても、醤
油や味噌以外の分離源から分離された株の中は、グルコ
ースとフラクトースとが等量ずつ含まれるような培養条
件下で培養した際に、まずフラクトースの方から選択的
に消費し始めるという、醤油や味噌から分離された株で
は決して観察されない特異な性質を示す株が存在すると
いった森治彦の報告（醸協、９６（７）、４７５〜４８
２（２００１））などからも、両者の生理学的な違いに
関する若干の報告もあるが、現在のところ、分類学的に
はこれらの株は一括してチゴサッカロマイセスルーキシ
ーと見なされている。そこで、このようなさまざまな分
離源から分離されたチゴサッカロマイセスルーキシーの
実験室株計２７株について、Ｍｎ培地及びＣｕ培地上で
の生育の有無と生醤油液体培地中での増殖及びそれに伴
うエタノール生産性との関係を調べてみた。すなわち、
醤油諸味液汁培地(ｐＨ５．３)におけるチゴサッカロマ
イセス ルーキシーのさまざまな株のエタノール生産量
を調べた結果を図３に示す。また実験室株のエタノール
生産性と本発明培地での生育を調べた結果を表７に示
す。

【００４３】

【表７】

【００４４】図３に示す通り、３０℃、７２時間の振盪
培養条件（１４０ｒｐｍ．）及び１４０時間の静置培養
下における実験株のエタノール生産性は株によって大き
く異なっており、表７に示す通り、醤油や味噌から分離
された株のうち、比較的高いエタノール生産性を示した
株については、Ｍｎ培地及びＣｕ培地の両方の培地上で
良好な生育を示したのに対して、フランスのビターオレ
ンジシロップから分離されたＩＦＯ０４８７株、カナダ
のハチミツから分離されたＩＦＯ０６８６株、イタリア
の濃縮黒ブドウ粕から分離されたＩＦＯ１１３０株など
の、すなわち醤油や味噌以外の分離源から分離された株
を含むエタノール生産性の低い株はいずれもＣｕ培地な
いしは、Ｃｕ培地及びＭｎ培地の両方の培地上で生育を
示さず、Ｍｎ培地及びＣｕ培地をもって前者の高エタノ
ール生産性株と明確に区別された。この事からも本発明
の培地は高エタノール生産性株の分離、選択に有効であ
る。

【００４５】

【発明の効果】本発明によれば、醤油諸味中での被検菌
の増殖能検査、醤油諸味又はその液汁での培養評価試験
を行うことなく、醤油主発酵酵母のエタノール醗酵能を
非常に簡単に、正確かつ迅速に評価できる培地を得るこ
とができる。また同培地を用いてエタノール高生産性醤
油主醗酵酵母株を確実に分離することができる。また分
離されたエタノール高生産性醤油主醗酵酵母株を醤油製
造などに用いて、エタノール発酵の適正化と迅速化を図
り、優れた風味を有する醤油及び味噌などの含塩醗酵食
品を得ることができる。さらにまた本発明によれば、
３．５〜３．８％（Ｗ／Ｖ）のエタノールを含有する醤
油諸味液汁（生醤油）及び芳醇な風味を有する熟成味噌
を、確実にしかも容易に得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のエタノール高生産性醤油主発酵酵母株
の分離手順を示す。

【図２】液体培地中での同種酵母２株混合培養系におけ
る培養前後の総酵母数に占める各株の比率の変化を示
す。

【図３】醤油諸味液汁培地(ｐＨ５．３)におけるチゴサ
ッカロマイセス ルーキシーのさまざまな株のエタノー
ル生産量を調べた結果を示す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】酵母用栄養培地に３．５〜１０％（Ｗ／
   Ｖ）グルコース及び０．８〜１．２％（Ｗ／Ｖ）塩化マ
   ンガンを含み、１％（Ｗ／Ｖ）以上の食塩を含まないエ
   タノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培
   地。
2. 【請求項２】酵母用栄養培地に７．５（Ｗ／Ｖ）グルコ
   ース及び１．０％（Ｗ／Ｖ）塩化マンガンを含み食塩を
   含まない、請求項１記載のエタノール高生産性醤油主醗
   酵酵母株の分離識別用寒天培地。
3. 【請求項３】酵母用栄養培地に３．５〜１０％（Ｗ／
   Ｖ）グルコース及び０．１２〜０．２４％（Ｗ／Ｖ）硫
   酸銅を含み、１％（Ｗ／Ｖ）以上の食塩を含まないエタ
   ノール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離識別用寒天培
   地。
4. 【請求項４】酵母用栄養培地に４．０％（Ｗ／Ｖ）グル
   コース及び０．２％（Ｗ／Ｖ）硫酸銅を含み食塩を含ま
   ない、請求項３記載のエタノール高生産性醤油主醗酵酵
   母株の分離識別用寒天培地。
5. 【請求項５】被検菌を、請求項１及び／又は請求項３に
   記載の培地に接種し、培地上で生育が観察されたコロニ
   ーから目的とする株を分離することを特徴とするエタノ
   ール高生産性醤油主醗酵酵母株の分離法。
6. 【請求項６】請求項５で分離されたエタノール高生産性
   醤油酵母株を用いることを特徴とする含塩発酵食品の製
   造法。
7. 【請求項７】含塩発酵食品が、醤油又は味噌である請求
   項６に記載の含塩発酵食品の製造法。