CN102093960A

CN102093960A - 一种高产β-葡萄糖苷酶产香酵母及在无醇苹果饮料的应用

Info

Publication number: CN102093960A
Application number: CN 201010565278
Authority: CN
Inventors: 王德良; 薛洁; 葛有辉; 宋绪磊; 郭阳; 李涛
Original assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Current assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2011-06-15
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: CN102093960B

Abstract

本发明公开了一种高产β-葡萄糖苷酶的产香酵母，保藏号为CGMCC NO.4343，并且利用该酵母发酵酿制增香型无醇苹果饮料的方法，属于微生物和发酵酿造工程领域。该产香酵母是从酿酒企业的废酒液中分离筛选得到的产酯产香较为突出，非常适合发酵苹果汁酿造增香型无醇苹果饮料的专用酵母。本酿造无醇苹果饮料的方法采用以浓缩苹果汁为原料，以产香酵母为发酵酵母的酿造工艺，解决了产香突出和酒精度低于0.5％的问题。本发明对拓宽我国的无醇饮料市场、对苹果的深加工以及苹果附加值的开发具有重要意义。

Description

一种高产β-葡萄糖苷酶产香酵母及在无醇苹果饮料的应用

技术领域

本发明涉及一种产香酵母及其筛选方法，命名为Brettanomyces sp.已于2010年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.4343，属于微生物技术领域，还涉及到采用该酵母发酵酿制增香型无醇苹果饮料的方法，属于发酵饮料领域。

背景技术

随着社会的不断进步和人们物质上的不断充裕，人们的消费理念有了新的变化，更加注重自身的健康，对饮料的品质有了更高的要求，既要天然有营养，又要爽口，有杀口力和刺激感，色、香、味俱佳。目前无醇及低醇饮料(Low-and non-alcohol beverage)越来越受到人们的关注，此类饮料是一种低浓度酒精饮料。而采用发酵技术将微生物发酵苹果汁酿制而成的饮料称为无醇及低醇苹果饮料，目前我国的苹果产量居于世界第一，仅仅食用或生产苹果汁其产值不高，因此采用发酵技术来酿制的增香型苹果饮料无疑将会大大提升产业的附加值。目前很多关于苹果酒的报道都是利用酿酒酵母直接发酵成苹果酒，含有的乙醇含量比较高，不利于健康的需要。也有的苹果饮料是添加各种增酸剂，香精等勾兑而成，不是真正的苹果发酵低醇饮料。本研究的产香酵母只进行微量的产香发酵，即产生很多乙酸乙酯，乙酸异戊酯等香气物质，很少进行酒精发酵，因此它保留了苹果汁原有营养的同时，运用微生物发酵生成特殊的发酵风味，并将乙醇含量控制在较低水平，它既赋予了饮品特有的发酵风味，又充分利用了水果的营养和药理价值，经常饮用有益于人体健康。

发明内容

本发明的内容是提出一种产香酵母及利用该酵母发酵酿制增香型无醇苹果饮料的方法。产香酵母是从酿酒企业的废酒液经自然存放后分离筛选得到的，产酯产香较为突出，酒精产量低于0.5％的标准，且非常适合发酵苹果汁酿造增香型无醇苹果饮料。用该酵母酿造无醇苹果饮料的方法采用以浓缩苹果汁为原料，以产香酵母为发酵酵母的酿造工艺，工艺中运用低温长时酿造、膜过滤处理及抗氧化褐变等技术。

本发明内容包括：

1、一株高产β-葡萄糖苷酶的产香酵母，本酵母是从酿酒企业的废酒液中经培养、筛选分离纯化后成为纯培养物，可产生高活性的β-葡萄糖苷酶，主要用于发酵无醇苹果汁并增加无醇苹果饮料的香气。

产香酵母的特征：细胞多为椭圆形，直径5-10微米，长宽比为1-1.5，芽殖；在产酶培养基中产β-葡萄糖苷酶的活性达到11.46U/ml；在发酵培养基中发酵4天后酒精度低于0.5％，具有稳定的发酵性能，发酵苹果汁的香气更浓郁。相对于酿酒酵母，其产酒精能力很低，产香非常突出，且发酵性能稳定，是酿制无醇饮料的优质酵母。

产香酵母从酿酒企业中的废酒液中培养、经过筛选分离成为纯培养物的方法是：A、筛选酵母时所使用的培养基为：

(1)初筛培养基：用于筛选高产β-葡萄糖苷酶的酵母，葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％，青霉素0.01％，七叶苷0.3％，氯化铁0.05％，琼脂2％，蒸馏水1000mL，121℃下灭菌20min；

(2)产酶培养基：用于复筛产酶以测定酶活，葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％，蒸馏水1000mL，121℃下灭菌20min；

(3)麦汁培养基：麦芽汁10Bx，琼脂2％，pH6.4，121℃下灭菌20min；

将存放长时间的废酒液以无菌水稀释成10^-1至10^-6不同的梯度，涂布在初筛培养基上，于28℃下培养3天，挑取平板上周围呈黑色的菌落为产β-葡萄糖苷酶的菌株，分别将每株菌划线分离纯化得到纯菌落。将纯菌落接一环到麦芽汁斜面培养基上28℃培养3天后4℃保存。将初筛所得菌株在产酶培养基中28℃下摇床培养2-3天，通过p-NPG比色法测β-葡萄糖苷酶酶活得到酶活最高的菌株。

2、一种发酵增香型低醇或无醇苹果饮料的制备方法，其特征为以浓缩苹果汁为原料，以产香酵母为发酵增香的酿造工艺，工艺流程为浓缩果汁的稀释、产香酵母发酵、饮料的过滤及澄清、成品无醇苹果饮料。其方法有如下特点：

A、浓缩苹果汁经稀释8至10倍后添加抗坏血酸0.8％、亚硫酸氢钠0.6％进行护色，以防止在发酵过程中褐变。

B、发酵温度控制在16-18℃下纯种低温发酵，发酵16-20天，无菌状态接种。

C、将发酵后的饮料添加壳聚糖进行澄清及过滤、最后经孔径为0.45μm的膜过滤掉绝大部分微生物。

3、经产香酵母低温发酵20天后酒精度低于0.5％，香气浓郁，经气相色谱分析醇酯含量达到38.37mg/L，大大的高于苹果汁香气的醇酯含量。

本发明有以下优点和显著进步：

1、所提供的产香酵母是从废酒液中筛选得到的酵母，产酒精能力低，产香好，是发酵酿制无醇苹果饮料的专用酵母。

2、所提供的无醇苹果饮料的酿制方法是对于发酵过程中如何实现低于0.5％的酒精含量、以及浓郁的酯香气这两个技术难点入手，进行菌株的筛选以实现低产酒精、高产酯香，在发酵工程中系统的研究了苹果汁的抗氧化褐变机理、低温长时酿造技术、发酵酿造特征、饮料的非生物稳定性研究及膜过滤技术等内容，形成了一系列完整的工艺，可实现连续稳定的发酵增香型无醇苹果饮料的加工生产。

本发明的提出对于深加工苹果、苹果资源的深化利用、苹果的附加值产业链的开发以及对于农业经济的发展具有重要意义。

具体实施方式

实施例1：

筛选获得产香酵母

取酿酒企业的废酒液5ml于45ml的蒸馏水中，充分振荡后按梯度分别稀释10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6等五个梯度，分别吸取0.2ml至筛选培养基中，用玻璃棒涂平，在28℃下培养2天后进行挑选，取平板背面周围颜色为黑色的菌落为初筛菌株，并挑至YPD培养基中划线分离后转入麦芽汁斜面培养基中4℃保存。

将初筛菌落接入产酶培养基中，温度为25℃，转速100转/分下培养2-3天，然后测β-葡萄糖苷酶酶活。

酶活检测使用p-NPG比色法：从产酶培养基中取10ml发酵液，在条件为4℃，3000×g，10min的离心下得到清液，取1.5ml的清液加入1.5ml的p-NPG溶液(1.5762g p-NPG溶于1L的Mcilvaine缓冲液中，pH为5)于45℃下保温90分钟，然后加入6ml的pH为10.2的碳酸盐缓冲液，接着同上条件下离心后于400nm处测吸光度。定义每ml样液中1小时内释放出来1nmol的p-NPh量所需的酶量为一个酶活单位(IU)。

酶活检测结果：产香酵母能产生的β-葡萄糖苷酶酶活为11.46U/ml。证实筛选获得的产香酵母为产β-葡萄糖苷酶酶活较高的菌株。

上述用于筛选高产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选培养基配方为(以质量计)：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％，青霉素0.01％，七叶苷0.3％，氯化铁0.05％，琼脂2％，蒸馏水1000mL，121℃下灭菌20min；

上述所述的用于复筛产酶以测定酶活的产酶培养基配方为(以质量计)：葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％，蒸馏水1000mL，121℃下灭菌20min；

实施例2：

苹果浓缩汁经稀释至8倍，加入抗坏血酸、亚硫酸氢钠等护色剂进行护色。将产香酵母经扩大培养后接入发酵装置中进行18℃低温发酵，期间每隔两天测一次发酵参数(如总糖、总酸、酒精度等)，一般发酵周期为18-25天，后酵阶段(自然储存5-8℃)为1-2个月，然后进行壳聚糖澄清并过滤，然后再进行一次膜过滤滤去绝大部分微生物，最后包装成品。最终得到的低醇苹果饮料酒精含量为0.3％，总酯含量在40mg/L

实施例3：加汽苹果饮料工艺

如实施例1相同的操作，在膜过滤后进行充二氧化碳气体，加汽后饮料在4℃下灌装成品，形成一种低醇起泡型苹果饮料。

Claims

1.一株高产β-葡萄糖苷酶的产香酵母，保藏号为CGMCC NO.4343。能产生高活性的β-葡萄糖苷酶，主要用于发酵低醇苹果汁并增加无醇苹果饮料的香气。

产香酵母的特征：

(1)细胞为椭圆形，直径5-10微米，长宽比为1-1.5，芽殖；

(2)产β-葡萄糖苷酶的活性达到11.46U/ml；

(3)在发酵培养基中发酵4天后酒精度低于0.5％，具有稳定的发酵性能；

(4)发酵苹果汁后的香气更浓郁。

2.如权利要求1所述的产香酵母，其特征为产香酵母从酿酒企业中的废酒液中分离、经过筛选分离成为纯培养物的方法是：

(1)将废酒液以无菌水稀释成10^-1至10^-6不同的梯度，涂布在初筛培养基上，于28℃下培养3天，挑取平板上周围呈黑色的菌落为产β-葡萄糖苷酶的菌株，分别将每株菌划线分离纯化得到纯菌落。

(2)将初筛所得菌株在产酶培养基中28℃下摇床培养2-3天，通过p-NPG比色法测β-葡萄糖苷酶酶活得到酶活最高的菌株。

(3)将得到的酶活力最高的菌株接种到麦汁琼脂培养基上保藏。

3.如权利要求2所述的筛选方法(1)所使用的初筛培养基所含组分为：

葡萄糖1～5％，酵母膏0.5～3％，蛋白胨1～3％，青霉素0.01～0.05％，七叶苷0.2～0.5％，氯化铁0.02～0.08％，琼脂1.5～2％。

4.如权利要求2所述的筛选方法(1)所使用的初筛培养基所含组分优选为：

葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％，青霉素0.01％，七叶苷0.3％，氯化铁0.05％，琼脂2％。

5.如权利要求2所述的筛选方法(2)所使用的产酶培养基所含组分为：

葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨2％。

6.一种发酵增香型低醇或无醇苹果饮料的制备方法，其特征为：

以浓缩苹果汁为原料，以产香酵母为发酵增香的酿造工艺，工艺流程为浓缩果汁的稀释、产香酵母发酵、饮料的过滤及澄清、成品无醇苹果饮料。主要包括以下工艺步骤：

A、浓缩苹果汁经稀释8至10倍后进行发酵。

B、发酵温度控制在16-18℃下纯种低温发酵，无菌状态接种。

C、将发酵后的饮料加入壳聚糖进行澄清及过滤、最后经孔径为0.45μm的膜过滤掉微生物后成品。

7.如权利要求5所述的发酵增香型无醇或低醇苹果饮料，在使用浓缩苹果汁稀释8倍后，经过该产香酵母在18℃下纯种低温发酵后，酒精度低于0.5％，总酯含量大于38.37mg/L。香气浓郁。

8.如权利要求5所述的发酵增香型无醇或低醇苹果饮料生产方法，可用于生产加气型或起泡型苹果饮料用途。