KR101526955B1

KR101526955B1 - 전통장류 유래 알코올을 고생산하는 효모 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101526955B1
Application number: KR1020150056148A
Authority: KR
Inventors: 백상호; 정도연; 송영란
Original assignee: 재단법인 발효미생물산업진흥원
Priority date: 2015-04-21
Filing date: 2015-04-21
Publication date: 2015-06-18
Also published as: KR20150051965A

Abstract

본 발명은 알코올 고생산능을 가지는, 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 균주 및 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii) JBCC 848 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 알코올 생산용 조성물 또는 저염화 장류의 보존성을 향상시키기 위한 조성물 및 코지(Koji)에 상기 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가하여 발효하는 단계를 포함하는 저염화 장류의 보존성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

Description

전통장류 유래 알코올을 고생산하는 효모 균주 및 이의 용도{Yeast strains having high productivity of alcohol from traditionally fermented soybean products, and uses thereof}

본 발명은 전통장류 유래 알코올을 고생산하는 효모 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 알코올 고생산능을 가지는, 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 균주 및 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii) JBCC 848 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 알코올 생산용 조성물 또는 저염화 장류의 보존성을 향상시키기 위한 조성물 및 코지(Koji)에 상기 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가하여 발효하는 단계를 포함하는 저염화 장류의 보존성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

된장, 간장, 청국장 등의 발효 장류는 함께 콩을 주원료로 하여 발효, 숙성시킨 우리 민족의 대표적인 대두 발효식품으로 저장성이 뛰어나고, 그 특유의 맛과 향을 지니고 있어 우리나라 식문화에서 중요한 위치를 차지해 왔을 뿐만 아니라 곡류와 채식위주의 우리 식생활에서 주요 단백질 섭취원으로서 널리 애용되어 온 전통 식품이다. 즉, 콩을 주원료로 하는 된장 및 간장과 같은 장류는 소금에서 오는 짠맛, 단백질 가수분해 산물인 아미노산에서 오는 구수한 맛, 발효에 의한 향 등이 조화를 이루어 독특한 향미와 색이 생성된 우리 고유의 전통 발효식품이다. 또한 미생물 효소에 의해 원료의 단백질과 탄수화물을 분해하여 이용하는 식품으로 단백질과 아미노산 함량이 높아 영양학적으로 중요시되는 우리나라의 대표적인 전통발효식품이며, 곡류위주의 식생활에서 부족되기 쉬운 필수 아미노산 및 지방산, 유기산, 미네랄, 비타민류 등의 영양소를 보충해 주는 중요한 기능을 가진 식품이다. 또한 최근에 된장의 항암효과, 항 돌연변이 효과, 면역기능 강화 효과, 항고혈압 효과, 혈전용해 효과, 콜레스테롤 저하 효과, 항산화 효과 등 다양한 기능성이 밝혀져 새롭게 관심을 끌고 있는 식품이다.

그러나 전통장류는 보존성을 높이기 위하여 통상적으로 높은 농도의 소금을 첨가하므로 전통고추장의 경우는 9∼10%, 전통된장의 경우 12∼15%, 간장의 경우 18∼25%의 소금을 함유한다. 따라서 전통장류는 고염 제품으로 분류되어 건강에 관심이 많은 소비자들이 기피하는 현상(고혈압 등 성인병의 원인)이 나타나고 있다. 실제로 세계보건기구(WHO)가 권장하는 하루 적정 소금 섭취량은 5 g이며, 반면 짜고 자극적인 음식을 선호하는 한국 성인의 하루 평균 소금 섭취량은 13.5 g으로 한국 성인의 소금 섭취량은 세계보건기구 권장량의 3배에 가깝다. 문제는 소금 섭취량의 대부분을 가공식품에서 얻는 서구 사람들과 달리 한국인들은 김치류와 장류 등 전통식단에서 소금을 절반 가까이 섭취한다는 것이며, 식품의약품안전처는 나트륨 섭취의 주요 급원을 김치류(25%), 장류(22%), 소금(20%) 순으로 명시하였다. 결과적으로 우리나라는 소금을 가장 많이 섭취하고 있는 나라로 조사결과에서 드러났으며, 이는 김치 및 절임, 장류 등 식생활에서 중요한 반찬이며, 대부분의 음식들의 조미료로 쓰이는 장류의 사용으로 인한 결과로 이로 인해 각종 만성 질환의 발병률이 높아지고 있다.

또한 최근 염분이 많은 장류에 대한 나트륨량 등을 표시할 수 있도록 하는 영양표시를 법제화하기로 하고 장류협회, 소비자 단체 등의 의견을 수렴해 관련 법안 개정에 나서고 있으며, 나트륨 줄이기 운동과 함께 식품업계에서도 저염화를 위한 연구에 돌입하여 나트륨 줄이기 운동에 발빠르게 참여하고 있다. 이처럼 식생활 패턴이 현대에 와서 많이 변화되어 가고 있고 국민이 가장 많이 쓰고 있는 식재료의 저염화 필요성이 가장 대두되고 있는 실정이다. 따라서 이러한 저장성을 위한 장류의 과다한 식염 사용은 과도한 짠맛과 함께 고혈압, 뇌졸중, 위암, 신장병, 간경변증, 만성신부전증 등 성인병을 유발하므로 기호성 향상과 성인병 예방을 위해 장류의 식염 함량을 낮출 필요가 있다.

장류에서 소금의 역할은 미생물에 대한 식품 부패를 예방할 뿐만 아니라 식품의 발효를 조절하고 결국 텍스쳐와 향미 등에 영향을 미친다. 장류 제조에 있어서 단순하게 소금의 함량을 줄이는 것은 부패 미생물의 증식으로 인한 보존성의 문제와 함께 소금의 농도로 인해 야기되는 발효양상의 패턴이 변화하면서 장류 고유의 맛과 향미가 감소되며, 결과적으로 식품의 품질 저하를 일으키는 문제가 있다.

따라서 저염 장류제품의 제조시 필연적으로 발생하는 보존성 문제를 해결하기 위해 에탄올 첨가, 감마선 조사와 같은 다양한 물리적, 화학적 방법들이 연구되고 있으며, 이중 산업현장에서 적용되고 있는 기술로는 물리적 방법으로 저온살균 방법(공장산 고추장에서 활용)이 있고, 화학적 방법으로 95% 주정처리 및 겨자·고추냉이 첨가 등의 방법이 현실화되어 있다. 하지만 이러한 방법들은 전통장류제품에 염도를 저하시키는데 일부 효과적이나 맛과 향미의 저하가 필연적으로 수반되어 왔다. 한편, 일본의 경우, 저염화 방법에 미생물관리와 화학적 방법, 물리적 방법을 동시에 전통장류제조공정에 포함시킴으로써 맛과 향미를 향상시키면서도 저염화시키는 기술을 보유하고 있다. 또한 일본 및 중국 등에서의 콩 발효 제품의 저염화를 위한 연구로 알코올 성분을 첨가함으로서 부패 미생물을 제어하고자 하였다. 대부분의 병원성 및 부패 미생물은 알코올에 대한 내성을 나타내지 않기 때문에 이러한 방법이 매우 효과적인 수단이 될 수 있음을 시사하고 있다. 그러나, 이러한 방법은 알코올의 첨가라는 인위적인 수단에 의존함으로써 전통식품의 이미지에 좋은 영향을 주지 않을 것으로 사료된다. 또한 높은 농도로 사용시 고유의 전통 장류 풍미도 감소할 수밖에 없다. 따라서 전통장류의 저염화를 위해서는 부패 미생물의 제어뿐만 아니라 전통식품 고유의 향미를 보완시켜 줄 새로운 방법이 모색되야 한다.

가장 적합한 방법은 우리나라의 전통장류로부터 고알콜을 생성함으로써 저염화 장류의 발효단계에서 인위적인 수단이 아닌 자연적인 수단으로 항균력을 부여하여 부패미생물를 억제하며, 동시에 이러한 저염화발효 프로세스를 수행함에 있어 감소되는 전통장류 유래의 향미성분을 보완할 향미성분을 발생하는 능력을 지닌 발효 미생물을 활용하는 것이 가장 바람직하다. 따라서 본 발명에서는 우리나라의 전통장류로부터 고 알코올을 생성함으로써 항균력을 부여할 신규의 효모를 분리하고자 한다.

장류의 주원료는 단백질과 전분질로 1차적으로 단백질 분해효소(protease)와 전분 분해효소(amylase)를 많이 분비하는 미생물들이 관여하게 되고, 2차적으로는 장의 후숙 과정에서 여러 가지 향미 성분을 생성시키는 미생물들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히 이러한 2차적 장의 후숙 과정에서 일부 효모류는 장류의 풍미 물질을 형성하는데 지대한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 콩과류 같은 식물체는 특히 염이 존재하는 고상발효(solid-state fermentation) 중 효모에 의하여 향미를 형성하게 된다. 이러한 성분에는 고급 알코올류(alcohols), 에스테르류(esters), 휘발성 페놀류(volatile phenols), 푸라논류(furanones) 같은 것들이 포함된다.

일반적으로 장류에서의 이러한 향미성분들의 생성은 발효·숙성 6개월 정도의 시간이 소요(time-consuming)되는 것으로 알려져 있으며, 또한 고농도의 염이 존재할 때 이러한 향미성분을 생성하는 효소의 활성이 줄어들며, 반면 일정 수준 이하의 염 농도에서는 향미에 관여하는 내염성 효모들의 생존 저하로 인한 향미성분 생성 저하의 결과를 초래할 수 있다고 알려져 있다.

한국등록특허 제06071570호에서는 고추장 제조방법 및 그 제조방법에 따라 제조된 고추장이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 전통장류 유래 알코올을 고생산하는 효모 균주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 전통 장류로부터 고알코올을 생성하고 전통장류와 관련된 향미성분을 생성할 수 있는 효모를 분리하였다. 상기 균주를 전통 장류 제품의 고유 풍미를 증진시키고 보존성을 향상시킨 저염화 장류를 제조하기 위한 발효 미생물로서 제공하고자 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 알코올 고생산능을 가지는, 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 균주(KACC93183P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 알코올 고생산능을 가지는, 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii) JBCC 848 균주(KACC93184P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 알코올 생산용 조성물 또는 저염화 장류의 보존성을 향상시키기 위한 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 코지(Koji)에 상기 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가하여 발효하는 단계를 포함하는 저염화 장류의 보존성을 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 우리나라의 전통장류로부터 고알콜을 생성함으로써 저염화 장류의 발효단계에서 인위적인 수단이 아닌 자연적인 수단으로 항균력을 부여하여 부패 미생물을 억제하며, 동시에 이러한 저염화발효 프로세스를 수행함에 있어 감소되는 전통장류 유래의 향미성분을 보완할 향미성분을 발생하는 능력을 지닌 발효 미생물인 알코올 고생산능을 가지는, 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주 및 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848 균주를 분리하였다. 상기 균주를 이용하여 전통 장류 제품의 고유 풍미를 증진시키고 보존성을 향상시킨 저염화 장류의 개발이 가능하므로 본 발명은 궁극적으로는 우리의 전통 발효식품의 부가가치를 넓히고 소비자 건강증진에 기여할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 선별된 효모 JBCC 623과 JBCC848의 25%(w/v) 글루코스 농도의 배지에서 에탄올 및 고급알코올(3-methyl-1-butanol) 생성량을 나타낸다. *623, 본 발명에서 분리한 JBCC 623 효모 균주; *848, 본 발명에서 분리한 JBCC 848 효모 균주; ZR 12066, 대조구인 지고사카로마이세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii) KCCM 12066 균주; ZR 50054, 대조구인 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 55054; SC 30008, 대조구인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces serevisiae) KACC 30008.
도 2는 전통 간장으로부터 분리된 효모들 중에서 알코올 고생산 효모로 분리된 JBCC 623의 계통수를 나타낸다.
도 3은 전통 간장으로부터 분리된 효모들 중에서 알코올 고생산 효모로 분리된 JBCC 848의 계통수를 나타낸다.
도 4는 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주(A) 및 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848(B)의 FE-SEM 사진을 나타낸다.
도 5는 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 에탄올 최적 조건을 나타낸다. 탄소원(A), 글루코스(B) 및 NaCl(C) 농도, 초기 pH(D), 온도(E), 및 배양 시간(F).
도 6은 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 에탄올 생산을 나타낸다. 25% 글루코스를 첨가한 5, 10, 15, 20%(w/v) 메주(A) 및 청국장(B).
도 7은 전통 장류로부터 분리한 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주에 의한 코지 발효 과정을 나타낸다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알코올 고생산능을 가지는, 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 균주(KACC93183P)를 제공한다. 본 발명에서 상기 균주는 알코올 고생산능을 가지며, 바람직하게는 에탄올 고생산능을 가지는 균주이다.

또한, 본 발명은 알코올 고생산능을 가지는, 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii) JBCC 848 균주(KACC93184P)를 제공한다. 본 발명에서 상기 균주는 알코올 고생산능을 가지며, 바람직하게는 고급알코올 고생산능을 가지며, 가장 바람직하게는 3-메틸-1-부탄올 고생산능을 가지는 균주이다.

본 발명에 따른 알코올을 고생산하는 균주는 순창군 민속마을에서 생산되는 메주를 시료로 이용하여 분리하였으며, 상기 분리된 균주들 중에서 알코올류 생산성이 높은 JBCC 623 균주 및 JBCC 848 균주를 분리하였다.

상기 분리된 JBCC 623 균주 및 JBCC 848 균주의 동정을 위하여 26s rDNA 염기서열 분석을 실시한 결과, 본 발명의 JBCC 623 균주는 도 2에 나타낸 바와 같이 토룰라스포라 델브루엑키(Accession no. JF920157) 및 토룰라스포라 델브루엑키(Accession no. KC754972)와 가장 높은 유사도를 나타내었고, JBCC 848 균주는 도 3에 나타낸 바와 같이 피키아 구일리에르몬디(Accession no. EF490689)와 가장 높은 유사도를 나타내었다. 따라서, 알코올을 고생산하는 특징을 가지고 있으므로, 상기 JBCC 623 균주 및 JBCC 848 균주를 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 균주 및 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii ) JBCC 848 균주라 각각 명명하였다.

본 발명의 균주 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii) JBCC 623 균주 및 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii ) JBCC 848 균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2013년 8월 16일자로 각각 기탁하였다 (순서대로 기탁번호는 각각 KACC93183P 및 KACC93184P).

또한, 본 발명은 상기 균주, 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 알코올 생산용 조성물 또는 저염화 장류의 보존성을 향상시키기 위한 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 전통 방식으로 제조된 장류의 발효기간별 수집

본 발명에서 사용한 장류는 전북 순창 지역에서 전통적으로 제조되는 장류를 수집하여 사용하였다. 메주부터 장을 담근 후 1일, 10일, 20일, 30일, 40일, 50일, 60일 및 70일로 10일마다 수집하여 균주 분리용 시료로 사용하였다.

실시예 2. 전통 방식으로 제조된 전통 장류로부터 효모의 분리

효모의 분리를 위하여 장류 시료는 멸균된 펩톤수(peptone water)를 사용하여 십진법으로 희석한 후 페니실린-스트렙토마이신(Sigma) 항생제가 포함된 YM 아가 배지(Difco)에 0.1 mL을 도말하여 29℃에서 3일간 배양하였다. 분리된 효모 균주는 동일한 조건에서 YM 액체 배지와 YM 아가 배지에 3번 이상 계대 배양한 후 장류 유래의 분리 균주로서 사용하였다. 결과적으로 발효기간별로 수집된 장류로부터 약 1,200점의 효모를 분리하였다.

실시예 3. 알콜 생성능 우수 균주 선발을 위한 스크리닝 방법의 확립

상기와 같이 전통 장류로부터 분리한 약 1,200점의 효모 균주를 대상으로 알콜 생성능 우수 균주를 선별하기 위한 시험을 실시하였다. 각 균주는 YM 액체배지에 24시간 동안 전 배양된 균주를 기질로 25%(w/v)의 글루코스가 함유된 YM 액체배지에 2%(v/v) 비율로 접종하여 29℃, 180 rpm에서 2일 동안 배양함으로써 균주를 성장시킨 후, 동일한 온도에서 정치배양을 2일 동안 추가적으로 수행함으로써 알콜 발효를 유도하였다. 배양액의 전처리는 원심분리(8,000 rpm, 5 min, 4℃)하여 얻어진 상등액에 내부표준물질(internal standard)로서 이소프로판올을 5%(v/v) 농도가 되도록 첨가시킨 후 증류하여 얻어진 액을 0.45 μm 맴브레인 필터로 여과하여 GC(gas chromatography, 가스 크로마토그래피) 분석을 위한 시료로 하였으며, 그 분석조건은 표 1과 같다. 각 시료의 GC 정량 분석을 위하여 표준물질로서 에탄올과 이소프로판올은 필요한 농도 구배별로 수행한 후 비교를 위하여 사용되었으며, 각각 1.707 분과 1.842 분의 지연시간(retention time)을 나타내었다.

알콜 분석을 위한 가스 크로마토그래피의 분석 조건

Items	Condition
Instrument	Gas chromatography(HP 6890 system)
Detector	Flame ionization detector(FID)
Column	DB-5 column 30 m×0.25 mm id(0.25 μm film thickness)
Mobile phase	He
Flow rate	1.3 mL/min
Split raio	50:1
Detector temp.	250℃
Oven temp.	70℃ for 2 min, 20℃/min to 150℃

즉, 전통장류로부터 분리된 약 1,200점의 효모를 대상으로 고알콜 생성능을 보유한 발효 우수 효모 균주를 분리하기 위하여 기질인 25%(w/v)의 글루코스를 함유하는 YM 액체 배지에서 배양한 후 상등액의 알콜 함량을 분석한 결과, 전통장류로부터 분리된 효모 균주들 중에서 JBCC 623 균주가 약 14.1±2.83%의 높은 알콜 생성능을 보이면서 고알콜 생성 효모로 최종 선발되었다.

그리고 선발된 균주의 알콜 생성능 확인을 위하여 표준 균주 몇 개를 분양받아 비교 분석하였다. 실험에 사용된 고알콜 생성 효모의 대조균주는 한국미생물보존센터(KCCM)로부터 분양받은 지고사카로마이세스 룩시이(Zygosaccharomyces rouxii) KCCM 12066, 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 55054와 한국농업미생물자원센터(KACC)로부터 분양받은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces serevisiae) KACC 30008를 사용하였다. 즉, 본 발명에서 고알콜 생성능을 보이며 선발된 JBCC 623 균주와 함께 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 12066, 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 55054 및 사카로마이세스 세레비지애 KACC 30008는 기질로 10, 20, 30%(w/v)의 글루코스가 함유된 YM 액체배지에 2%(v/v) 비율로 접종하여 29℃, 180 rpm에서 2일 동안 배양한 후, 동일한 온도에서 정치배양을 2일 동안 추가적으로 수행 후 배양액의 전처리는 원심분리(8,000 rpm, 5 min, 4℃)하여 상등액을 수집하고 내부표준물질(internal standard)로서 이소프로판올을 5%(v/v) 농도가 되도록 첨가시킨 후 증류하여 얻어진 액을 0.45 μm 맴브레인 필터로 여과하여 표 1의 조건으로 GC-FID 분석하였다.

그 결과, JBCC 623가 가장 높은 14.8%(v/v)의 알콜생성량을 나타내면서 본 발명에서 고알콜 생성 효모로 최종 선발되었다. 또한 JBCC 623 효모 균주는 타입 균주(type strain)인 사카로마이세스 세레비지애 KACC 30008와 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 12066, 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 55054와 비교하여도 월등하게 높은 수준을 나타냈다(도 1).

실시예 4. 휘발성 향미성분 생성능 효모 균주의 선발

알콜 생성능 우수 균주 선발을 위한 스크리닝을 수행하는 중 수집되었던 배양 상등액을 가지고 실험자의 관능적 분석을 기초로 하여 약 400점의 효모 균주를 1차적으로 스크리닝한 후 고급 알콜류로써 카라멜향을 나타내는 것으로 알려져 있는 2-메틸 부탄올 또는 3-메틸 부탄올을 향미생성 지표 물질로 하여 GC 분석을 수행하였다. 그 중 2-메틸 부탄올 또는 3-메틸 부탄올을 고생산하는 10점의 효모를 대상으로 최종적으로 GC-MS 분석을 통해 생성된 휘발성 향미성분을 분석하였다. 먼저, 상기의 알콜 발효 방법을 통한 효모 배양 상등액의 향기 성분 포집을 위하여 해드스페이스법(Hakala et al, 2002, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 1133-1142)에 따라 퍼지 앤드 트랩 분석기(purge and trap analyzer, JDT-505II)을 사용하여 전처리한 후 GC-MS 분석하였다. 즉, 전 배양된 균주를 기질로 25%(w/v)의 글루코스가 함유된 YM 액체배지에 2%(v/v) 비율로 접종하여 29℃, 180 rpm에서 2일 동안 배양함으로써 균주를 성장시킨 후, 동일한 온도에서 정치배양을 2일 동안 추가적으로 수행함으로써 발효를 유도하였다. 이때 JBCC 623 효모를 접종하지 않은 처리구를 대조군으로 동일한 조건으로 분석하였다. 발효된 배양액으로부터 향기성분은 시료 5 mL을 시료병(55 mm OD x 120 nm)에 취하여 질소로 퍼징(purging)하면서 추출하였다. 퍼지 앤드 트랩 시스템의 마운트(mount), 바톰(bottom), 밸브 및 라인 등 각 부분의 온도는 100℃로 고정하였고, 퍼징하는 동안 워터 배스의 온도는 40℃로 하였으며, 퍼징은 30 psi의 질소를 분당 100 mL 속도로 12분간 실시하여 60∼80 매쉬의 Tenax GC(polymer of 2,6-diphenyl-p-phenyl oxide)가 충전된 흡착관에 향기 성분을 흡착시켰다. 흡착관은 50℃로 예비 가열하였고, 220℃에서 4분간 가열 탈착을 실시하였으며 휘발성 성분들의 잔류 가능성을 방지하기 위하여 시료가 주입된 시료병을 완전세척 후 120℃의 건조기에서 2시간 정도 건조시켜 잔여 향기 성분을 없앤 후 사용하였다. 시료로부터 추출된 휘발성 향기 성분 분석은 표 2와 같은 조건에서 GC-MS(gas chromatography mass spectrometer, 가스 크로마토그래피)를 이용하여 분석하였으며, 향기 성분의 동정은 GC-MS에 내장된 윌리 라이브러리(Wiley library)의 매스 스펙트럼과 비교하여 확인하였다.

휘발성 향미성분 분석을 위한 GC-MS 분석 조건

Item	Condition
Instrument	GC-MS
Column	DB-5 fused silica capillary column
Oven temp.	40℃(held 3min)-220℃(held 10min), 2℃/min
Injector temp.	220℃
Detector temp.	250℃
Detector	Mass spectrometer(MS)
Carrier gas	He, 1.2 mL/min
Split ratio	1:20
Make up gas	He, 25 mL/min

그 결과, JBCC 848가 가장 높은 37.08 ppm(v/v)의 알콜생성량을 나타내면서 본 발명에서 고알콜 생성 효모로 최종 선발되었다. 또한 JBCC 848 효모 균주는 타입 균주(type strain)인 사카로마이세스 세레비지애 KACC 30008와 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 12066, 지고사카로마이세스 룩시이 KCCM 55054와 비교하여도 월등하게 높은 수준을 나타냈다(도 1).

이러한 결과는 전통장류 제조과정 중에서 분리한 효모 JBCC 623과 JBCC 848은 장류의 유효한 향미성분인 에탄올과 고급 알코올류를 생성할 수 있는 균주임을 나타내는 결과이다.

실시예 5. 선발된 효모의 26S rRNA / ITS 시퀀싱 분석을 이용한 분자생물학적 동정

선발된 효모균주 JBCC 623와 JBCC 848 효모의 26S rRNA 유전자의 D1/D2 도메인과 ITS1-5.8S rDNA-ITS2 영역 염기서열을 분석하기 위하여, YM 아가 배지에 분리균주를 접종하여 29℃에서 24시간 동안 배양한 후 사용하였다. 선발된 균주의 플레이트상의 싱글 콜로니를 사용하여 NL1 (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3' : 서열번호 1)과 NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3': 서열번호 2) 프라이머 세트 또는 ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3': 서열번호 3), ITS4 (5'-TCCTCCCGCTTATTGATATGC-3' :서열번호 4) 프라이머 세트를 가지고 Mycycler^TM Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, California, USA)을 사용하여 다음 조건에서 수행하였다(표 3 및 표 4). 먼저 NL1과 NL4 프라이머 세트를 사용한 반응 조건으로 전변성 단계 95℃에서 7분, 변성 단계 95℃에서 60초, 어닐링 단계 53℃에서 45초, 72℃에서 60초간 연장을 35회 반복하였고 마지막 연장은 72℃에서 7분간 시행하였다. 또한, ITS1-5.8S rDNA-ITS2 영역 ITS1과 ITS4 프라이머 세트를 사용한 반응 조건은 전변성 단계 95℃에서 5분, 변성 단계 95℃에서 1분, 어닐링 단계 55.5℃에서 2분, 72℃에서 1분간 연장을 35회 반복하였고 마지막 연장은 72℃에서 10분간 시행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1×TBE 버퍼 상에서 2.0%(w/v) 아가로스 겔을 100 볼트로 전기영동 후 이를 QIAEX II 아가로스 겔 추출 키트(Qiagen Valencia, CA, USA)를 사용하여 회수한 후 DNA 염기서열을 결정하였다. 얻어진 염기서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 Basic Local Alignment Search Tool과 Ribosomal Database Project II tool에 등록되어 있는 데이터 베이스를 사용하여 검색하였으며, 높은 유사성을 가지는 염기서열을 기초로하여 그룹별로 정리한 후 클러스터 W(EBI, UK)를 이용한 다중 정렬을 통해 시퀀스 데이터들을 비교하였다.

NL1과 NL4의 프라이머를 사용한 PCR 분석 조건

Reaction mixture		PCR condition
10×Taq reaction buffer	5 μL
dNTP mix(2.5 mM each)	4 μL	95℃, 7 min
Primer NL1(20 pmol)	0.25 μL	95℃, 1 min ━━━┑
Primer NL4(20 pmol)	0.25 μL	53℃, 45 sec 35 cycle
Template DNA	1 μL	72℃, 1 min ━━━┙
Taq polymerase(2.5 U/mL)	0.5 μL	72℃, 7 min
D.W.	up to 50 mL

ITS1과 ITS4의 프라이머를 사용한 PCR 분석 조건

Reaction mixture		PCR condition
10×Taq reaction buffer	5 μL
dNTP mix(2.5 mM each)	4 μL	95℃, 5 min
Primer ITS1(20 pmol)	0.25 μL	95℃, 1 min ━━━┑
Primer ITS4(20 pmol)	0.25 μL	55.5℃, 2 min 35 cycle
Template DNA	1 μL	72℃, 2 min ━━━┙
Taq polymerase(2.5 U/mL)	0.5 μL	72℃, 10 min
D.W.	up to 50 mL

또한 분리된 효모 균주의 생화학적 특성 분석을 통한 분자생물학적 동정 결과의 확인 및 탄소원 이용능을 시험하기 위하여 API 20C AUX kit(BioMerieus, France)을 이용하여 제조회사의 시험방법에 따라 시험하였다. 그 결과, 도 2에 보여지듯 JBCC 623 균주는 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii , Accession no. JF920157)와 99%의 가장 높은 상동성을 나타내었다. 이는 ITS1과 ITS4 프라이머를 사용한 분석 결과를 통해서도 일치되게 토룰라스포라 델브루엑키(Torulaspora delbrueckii , Accession no. KC754972) 균주와 가장 높은 상동성을 나타내었다. JBCC 623 균주의 당 이용성은 표 5와 같이 D-글루코스, L-아라비노스, D-자일로스, 아도니톨, 자일리톨, D-갈락토스, 이노시톨, 메틸-α-D-글루코피라노시드, N-아세틸-글루코사민, D-셀리오비오스, D-락토스(bovine origin), D-말토스, D-멜레지토스를 탄소원으로 이용할 수 있었으며, 반면 글리세롤, 칼슘 2-케토-글루코네이트, D-솔비톨, D-사카로스, D-트레할로스 및 D-라피노스를 이용하지 못하는 것을 확인할 수 있었으나 API 키트로 동정될 수 있는 균종에 속해 있지 않다. 따라서, 최종적으로 선발된 JBCC 623 균주는 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 (KACC93183P)으로 명명되었다. 또한 JBCC 848 균주는 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii, Accession no. EF490689)와 99%의 가장 높은 상동성을 나타내었으며, 전형적인 특징으로 이노시톨과 D-락토스 (bovine origin)를 이용하지 못하는 것으로 나타나면서 26S rRNA 시퀀스 분석 결과와 일치하여 캔디다 구일리에르몬디(Candida guilliermondii)(84.3%)로 동정되었다. 따라서 JBCC 848 균주는 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848(KACC93184P)로 최종 명명되었다. (출처-Wikipedia: 피키아 구일리에르몬디의 동의어는 캔디다 구일리에르몬디. 또한, API 키트로 나타날 수 있는 동정 결과에 캔디다 구일리에르몬디라고 기재됨)

본 발명에서 분리한 효모 JBCC 623 및 JBCC 848의 API 키트를 이용한 생화학적 분석 결과

No.	Tests	Active ingredients	JBCC 623	JBCC 848
1	GLU	D-Glucose	+	+
2	GLY	Glycerol	-	+
3	2KG	Calcium 2-keto-gluconate	-	+
4	ARA	L-Arabinose	+	+
5	XYL	D-Xylose	+	+
6	ADO	Adonitol	+	+
7	XLT	Xylitol	+	+
8	GAL	D-Galactose	+	+
9	INO	Inositol	+	-
10	SOR	D-Sorbitol	-	+
11	MDG	Methyl-α-D-glucopyranoside	+	+
12	NAG	N-Acetyl-glucosamine	+	+
13	CEL	D-celiobiose	+	+
14	LAC	D-Lactose(bovine origin)	+	-
15	MAL	D-maltose	+	+
16	SAC	D-saccharose(sucrose)	-	+
17	TRE	D-trehalose	-	+
18	MLZ	D-melezitose	+	+
19	RAF	D-raffinose	-	+

실시예 6. 전자현미경( FE - SEM )을 이용한 효모의 형태학적 특성 분석

선발된 효모 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623와 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848의 형태학적 특성을 분석하기 위하여 그 세포 형태를 전자현미경(SEM, scanning electron microscopy) 분석을 통해 살펴보았다. SEM 관찰용 균체 시료의 전처리는 각각의 효모를 0.25%의 페니실린-스트렙토마이신 용액을 첨가한 YM 액체 배지에 24-48시간 동안 배양시킨 균체액을 가지고 다음과 같이 실시하였다. 즉, 균주 배양액을 4℃에서 원심분리 하여 균체를 회수한 다음 2.5% 글루타르알데히드(sigma)를 사용하여 30분 동안 1차 고정시킨 후, 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 균체를 회수하고 0.9%(w/v) NaCl 용액으로 3-5회 반복하여 세척하였다. 1%(w/v) 오스뮴 테트라옥시드(sigma)를 사용하여 20분간 2차 고정 후, 0.9%(w/v) NaCl을 사용하여 3-5회 반복 세척하였다. 2차 고정이 끝난 후 회수된 균체는 2% 우라실 아세테이트(EMS, w/v)를 첨가하여 30분 동안 염색 후, 회수된 균체는 25, 50, 70, 90, 100% 에탄올(v/v)을 순서대로 첨가하여 탈수시켰으며 탈수가 끝난 혼합액을 슬라이드 글라스에 분주하여 건조하였다. 슬라이드 글라스 위에 건조된 시료는 이온 스퍼터를 이용하여 20분 동안 골드 코팅한 후, FE-SEM(SUPRA 40VP)을 통해 상을 관찰하였다.

그 결과, 도 4에 보이는 것처럼 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623의 세포형태는 평균 3.2 ㎛의 구형이었으며 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848은 평균 2.7 ㎛의 타원형으로 두 균주 모두 다극 출아에 의해 생육하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 선발된 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 및 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848 균주의 생육 특성

토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 및 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848 균주의 생육 가능 pH와 온도 범위를 살펴보았다. 먼저, 글루코스 10 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 말트 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L의 YM 액체 배지에 16시간 전배양한 균주를 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지를 0.1N NaOH 또는 0.1N HCl 용액을 사용하여 pH를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12로 각각 조정하여 확인하였다. 즉, 다른 pH를 가지는 각각의 YM 액체배지에 1%(v/v) 비율로 접종하여 29℃, 180 rpm에서 2일 동안 배양하면서, 각각 12, 24, 48시간에 균주의 성장 정도를 Beckman Coulter DU-800 UV-VIS 스펙트로미터를 사용하여 OD₆₀₀ 값으로써 측정하였다. 효모의 생육에 있어서 배양온도의 영향을 살펴보기 위하여 상기와 동일한 배양 조건에서 배양 온도만을 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45℃로 설정한 후 살펴보았다. 내당성 분석은 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지 조성에서 탄소원인 글루코스의 농도를 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50%(w/v)의 비율로 각각 조제한 배양액에 상기와 동일한 조건으로 배양 한 후 살펴보았다. 내염성 분석은 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지 조성에 0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0, 17.5, 20.0%(w/v)의 비율로 NaCl을 첨가한 각각의 배지를 조제하여 염 농도에 따른 균체 성장에 미치는 영향을 확인하였다. 아황산 내성 분석을 위하여 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지 조성에 0, 100, 200, 300, 400, 500 ppm(w/v)의 비율로 아황산염(potassium disulfite, K2S2O5)을 첨가하여 각각의 배지를 조제하여 아황산염 농도에 따라 균체 성장에 미치는 영향을 살펴보았다. 내알코올성 분석을 위하여 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지 조성에 0, 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0, 17.5, 20.0%(v/v)의 비율로 에탄올(ethanol)을 첨가하여 각각의 배지를 조제하여 알코올 농도에 따라 균체 성장에 미치는 영향을 살펴보았으며 그 결과는 표 6과 같다.

선발된 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 및 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848 균주의 생육 특성

Test	Range	T. delbrueckii JBCC623	P. guilliermondii JBCC848
pH tolerance	pH 2	-	++
	pH 3-pH 10	+++	+++
	pH 11	+++	+++
	pH 12	++	+++
Temperature tolerance	10℃	++	++
	15-30℃	+++	+++
	35℃	+	+++
	40℃	-	++
	45℃	-	-
Glucose tolerance	0% glucose	+	+
	1-30% glucose	+++	+++
	40% glucose	+++	+
	50% glucose	++	-
NaCl tolerance	0-10% NaCl	+++	+++
	12.5% NaCl	+++	+++
	15% NaCl	++	+
	17.5% NaCl	+	-
	20% NaCl	-	-
K₂S₂O₅ tolerance	0-500 ppm K₂S₂O₅	+++	+++
	600 ppm K₂S₂O₅	+++	+++
	700 ppm K₂S₂O₅	++	+++
	800 ppm K₂S₂O₅	+	+++
	900 ppm K₂S₂O₅	-	-
Alcohol tolerance	0-5% ethanol	+++	+++
	7.5% ethanol	+++	+
	10% ethanol	+++	+
	12.5% ethanol	+	-
	15% ethanol	+	-

토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주는 pH 3에서 pH 12까지 다양한 pH 범위에서 생육 가능했으며, 35℃의 온도까지 생육 가능하였다. 또한 50% 이상의 글루코스 농도, 17.5% NaCl, 800 ppm의 포타슘 디설페이트, 15%의 알콜 농도에서 생육할 수 있는 내당성, 내염성, 내아황산염, 내알콜성 효모이다. 피키아 구일리에르몬디 JBCC 848 효모의 경우 pH 2에서 pH 12까지 다양한 pH 범위에서 생육할 수 있으며, 40℃의 온도까지 생육할 수 있는 내열성 효모이다. 또한 40%의 글루코스 농도, 15% NaCl, 800 ppm의 포타슘 디설페이트, 10%의 알콜 농도에서 생육할 수 있는 내당성, 내염성, 내아황산염, 내알콜성 효모이다.

실시예 8. 선발된 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623의 알콜발효 최적조건 분석

토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 알콜 생성능에 있어서 탄소원, 탄소원의 농도, 염농도, 초기 pH, 배양온도 및 배양시간의 영향을 살펴보았다. 먼저, 알콜 생성에 있어서 탄소원의 영향을 살펴보기 위하여 글루코스 10 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 말트 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L의 YM 액체 배지에 16시간 전배양한 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주를 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지 조성에서 글루코스 대신에 탄소원으로 프락토스, 갈락토스, 글루코스, 만노스, 리보스 및 자일로스를 25%(w/v)의 비율로 각각 조제하여 확인하였다. 즉, 균주를 기질로 25%(w/v)의 각각의 탄소원이 함유된 YM 액체배지에 2%(v/v) 비율로 접종하여 29℃, 180 rpm에서 2일 동안 배양함으로써 균주를 성장시킨 후, 동일한 온도에서 정치배양을 2일 동안 추가적으로 수행함으로써 알콜 발효를 유도하였다. 생성된 알콜 분석을 위한 배양액의 전처리는 원심분리(8,000 rpm, 5 min, 4℃)하여 상등액을 수집하고 얻어진 상등액에 내부표준물질로서 이소프로파놀을 5%(v/v) 농도가 되도록 첨가시킨 후 증류하여 얻어진 액을 0.45 μm 맴브레인 필터로 여과하여 GC-FID로 분석하였다(표 1). 또한 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 알콜 생성능에 있어서 탄소원 농도의 영향을 살펴보았다. 상기에 기술된 YM 기본 액체 배지 조성에서 탄소원인 글루코스의 농도를 0, 10, 20, 30, 40, 50%(w/v)의 비율로 각각 조제하여 확인하였다. 알콜 생성능에 있어서 NaCl(sodium chloride)의 영향은 YM 기본 액체 배지 조성에서 탄소원인 글루코스의 농도를 25%(w/v)의 비율로 고정한 후 0, 2.5, 5.0, 10, 15, 20, 25, 30%(w/v)의 비율로 NaCl을 첨가하여 확인하였다. 초기 pH의 영향은 글루코스의 농도를 25%(w/v)의 비율로 고정한 YM 배양액의 pH를 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10로 각각 조정한 후 확인하였으며, 배양 온도의 영향은 글루코스의 농도를 25%(w/v)의 비율로 고정한 YM 액체배지에 2%(v/v) 비율로 접종한 후 각각 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37℃의 다른 온도에서 180 rpm으로 2일 동안 배양함으로써 균주를 성장시킨 후, 동일한 온도에서 정치배양을 2일 동안 추가적으로 수행함으로써 측정하였다. 또한, 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 알콜 생성능에 있어서 배양 시간의 영향을 살펴보기 위해 글루코스의 농도를 25%(w/v)의 비율로 고정한 YM 액체배지에 2%(v/v) 비율로 접종한 후 29℃의 온도에서 180 rpm으로 2일 동안 배양함으로써 균주를 성장시킨 후, 동일한 온도에서 정치배양을 0, 12, 24, 48, 72, 76, 120, 144시간 동안 각각의 다른 시간으로 추가적으로 수행함으로써 알콜 발효 후 생성된 알콜 농도를 GC-FID로 분석하였다.

그 결과, 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 균체 성장 정도는 도 5A와 같이 글루코스를 탄소원으로 하였을 때 알콜 생성량은 8.30%(v/v)로 가장 높았으며 만노스에서도 8.23%(v/v)로 유사한 수준을 나타냈다. 탄소원을 글루코스로 고정한 후 그 농도에 대한 알콜 생성량을 살펴본 결과, 30%(w/v)의 글루코스 농도에서 9.91%(v/v)의 알콜 생성량을 보이면서 가장 높았으며 25%와 20%의 글루코스 농도에서도 8.03%으로 유사한 수준을 나타냈다(도 5B). 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 알콜 생성에 있어서 염의 농도에 대한 저해를 받는지의 유/무를 살펴보기 위하여 다양한 농도의 염을 첨가하여 살펴본 결과, 도 5C와 같이 비록 염 농도가 증가함에 따라 알콜 생성량도 감소하였으나, 염을 첨가하지 않은 조건에서 알콜 생성량은 11.9%(v/v) 수준이 10%(w/v)의 NaCl 농도 하에서도 9.21%, 20%의 NaCl에서는 6.27%, 30% NaCl에서는 2.31%의 수준을 나타냈다. 도 5D와 같이 초기 pH에 대한 알콜 생성 정도는 pH 5.0에서 9.56%(v/v)으로 가장 높은 수준을 보였고, pH 6.0-8.0 구간에서는 8.39-8.23%의 생성량을 유지하였다. 또한 pH 9.0에서 7.54%, pH 10.0에서는 6.88%의 알콜 생성량을 나타냈으며, pH 4.0에서도 6.42% 수준을 나타냈다. 반면 pH 3.0에서는 2.92%의 수준을 나타냈다. 발효 온도에 따른 알콜 생성량은 도 5E와 같이 25℃의 온도하에서 12.24%(v/v)으로 가장 높은 수준을 보였고 29℃에서 11.91%로 유사한 수준을 나타냈다. 반면 그 이상으로 온도가 높아졌을 경우 33℃에서 4.00%, 37℃에서 1.62%의 수준으로 알콜 생성량은 매우 감소되었으며, 21℃하에서 7.77%, 13℃하에서 2.31% 수준을 보이면서 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 알콜 발효는 20-30℃ 사이의 온도에서 적합한 것으로 나타났다. 또한 발효 시간에 따른 알콜 수준은 도 5F와 같이 시간에 따른 알콜 생성량이 증가되는 경향을 보였으며, 후 발효 72-96시간에 11.05%에서 11.50% 수준으로 가장 높았으며 이 이후의 알콜 수준은 다시 감소되는 경향을 나타냈다.

실시예 9. 메주 및 청국장 배지에서 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623의 알콜 생성

전통장류로부터 분리된 효모 균주 중 가장 뛰어난 알콜 생성능을 보이면서 최종 선발된 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 장류 적용 적합성을 시험하기 위해 메주 및 청국장 배지에서 알콜 생성능을 조사하였다. 곱게 분쇄된 메주 및 청국장 분말 시료는 (재)순창군발효미생물 관리센터로부터 제공받아 사용하였으며, 이를 사용한 배양액의 조성은 메주 분말 또는 청국장 분말을 5, 10, 15, 20%(w/v)의 농도를 함유하도록 조절하였다. 또한 알콜 발효를 위한 기질로써 25%(w/v)의 글루코스를 첨가하여 사용하였다. 전배양된 균주를 2%(v/v) 비율로 접종하여 29℃, 180 rpm에서 2일 동안 배양함으로써 균주를 성장시킨 후, 동일한 온도에서 정치배양을 2일 동안 추가적으로 수행함으로써 알콜 발효를 유도하였다. 배양액의 전처리는 원심분리(8,000 rpm, 5 min, 4℃)하여 상등액을 수집하고 얻어진 상등액의 알콜 농도를 GC-FID로 분석하였다(표 1). 그 결과, 도 6과 같이 25%로 당농도를 고정시킨 상태에서 JBCC 623 효모의 알콜생성 수준은 메주 또는 청국장 분말의 첨가율이 증가됨에 따라 증가되는 양상을 보였다. 특히 20%의 메주 분말을 함유한 배양액에서 JBCC 623 효모의 알콜 생성은 6.62% 수준이었고, 20%의 청국장 분말을 함유한 배양액에서는 7.61%의 수준의 생성량을 보였다.

실시예 10. 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623을 이용한 콩, 찹쌀 및 멥쌀 코지 발효

선발된 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 장류 적용 적합성을 시험하기 위해 코지 분말을 콩, 찹쌀 및 멥쌀로 제조하여 각각 랩-스케일(lab-scale)의 장류 발효에 적용하였다. 콩, 찹쌀, 멥쌀을 사용하여 각각 제조된 코지 분말은 (재)순창군발효미생물 관리센터로부터 제공받아 사용하였으며 이를 사용한 발효액의 조성은 도 7과 같이 조절하였다. 먼저, 각각 코지 분말의 당함량을 DNS법을 사용하여 조사한 결과 콩 코지는 약 1.6%의 당 농도를, 찹쌀 코지와 멥쌀코지는 약 7.1%의 당 농도를 함유하고 있었다. 본연의 코지를 사용한 시험구와 글루코스를 첨가함으로써 당 농도를 25%(w/v)가 되도록 조절한 처리구를 준비하였다. 당을 첨가하거나 무첨가한 코지 분말은 14%(w/v)의 염 함량을 조절하여 무균 조작된 염수를 1:4(w:v)의 비율로 혼합된 후 OD값 1.0의 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주를 접종하지 않은 구와 2%(v/v) 또는 5%(v/v)의 농도로 접종하여 30℃에서 7일 동안 정치 배양함으로써 코지발효하였다. 코지 발효된 각각의 시료를 가지고 하기에 서술된 바와 같이 효모 생균수, 최종 pH, 총산도, 환원당 함량 및 생성된 알콜 함량을 측정하였다.

발효된 장류 시료의 효모의 생균수는 평판배양법으로 측정하였다. 세균의 배양을 억제하기 위한 페니실린-스트렙토마이신 용액을 포함하는 YM 아가(Difco, USA) 배지를 사용하였고, 1%(w/v) 펩톤 용액을 사용하여 십진법으로 희석한 샘플을 100 μL 도말한 후 29℃에서 48시간 배양 한 후 30-300개의 집락(colony)을 형성한 플레이트의 콜로니 수를 측정하였다. 생균수는 로그 cfu/mL으로 표현하였다. pH는 제조된 장류를 10,000 rpm에서 20분 동안 원심분리한 상등액을 Orion model 710 pH meter(Thermo, Beverly, MA, USA)로 측정하였으며, 산도 측정은 상등액 10 mL에 혼합지시약(bromothymol blue 0.2 g, neutral red 0.1 g, absolute ethanol 300 mL) 2-3 방울을 가한 뒤 0.1N NaOH로 담록색이 나타날 때까지 적정 시키는데 소요되는 mL 수를 산도로 표시하여 계산하였다. 환원당 함량은 시료 상등액을 가지고 DNS(dinitrosalicylic acid)법으로 측정하였다. 생성된 알콜 함량 측정은 시료 상등액 5 mL와 GC 분석을 위한 내부표준물질로 10%(v/v) 이소프로필 알코올 5 mL를 첨가하여 혼합한 후 그 액을 증류하여 GC-FID로 분석하였다(표 1).

알콜 생성 우수 효모로 분리된 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주의 장류 적용 적합성을 시험하기 위하여 도 7과 같이 콩, 찹쌀, 멥쌀로 각각 제조된 코지를 사용하여 코지 발효를 수행한 후 효모의 생균수, 최종 pH, 총산도, 환원당량 및 알콜 생성량을 측정한 결과(표 7), 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623 균주를 접종하지 않은 모든 처리구에서는 YM 고체 배지상에서 효모 균주가 검출되지 않았다. 반면 JBCC 623 균주를 2%(v/v) 또는 5% 접종한 처리구에서는 모두 효모가 검출되었으나 균주의 2%와 5%의 접종 비율은 효모의 생균수에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 특히 어느정도 당이 존재하던 멥쌀과 찹쌀 코지 발효에 있어서는 당의 첨가가 효모의 생육에 유의적이지는 않았으나 당 함량이 상대적으로 낮았던 콩 코지 발효에 있어서는 당을 첨가했을 때 효모의 생균수가 증가되었다. 그러나 환원당량을 제외하고는 최종 pH, 총산도 및 알콜 생성량은 당 첨가에 큰 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623의 알콜 생성량은 찹쌀 코지에 당을 첨가하지 않고 2% 또는 5% 접종한 처리구에서 4.9±1.7%와 4.6±1.0% 수준으로 가장 높은 결과를 나타냈으나, 찹쌀과 멥쌀의 경우 관능적으로 막걸리 발효취의 냄새가 났다(데이터 미제시). 반면 콩 코지 발효에 있어서 JBCC 623 균주를 접종하지 않은 처리구와 비교하여 처리한 군에서 알콜 생성량이 최대 3.2배 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

토룰라스포라 델브루엑키 JBCC 623을 이용한 콩, 찹쌀 및 멥쌀 코지 발효 결과

	Yeast log cfu/mL	Final pH	Total activity (%)	Produced alcohol (%)	Reduced sugar (%)
(A)　Koji with soybean
Soy-N-0	ND	6.0±0.1	3.0±0.1	0.6±0.2	1.3±0.0
Soy-N-2	2.7±0.3	5.3±0.0	3.2±0.5	1.5±0.5	2.9±0.0
Soy-N-5	4.0±0.0	5.5±0.0	4.0±0.6	1.6±0.2	2.8±0.0
Soy-G-0	ND	5.7±0.0	2.8±0.0	0.5±0.0	13.0±0.0
Soy-G-2	5.5±0.1	5.3±0.1	4.2±0.2	1.4±0.3	13.2±0.0
Soy-G-5	6.6±0.8	5.4±0.1	4.2±0.4	1.4±0.4	12.9±0.0
(B) Koji with glutinous rice
Glu-N-0	ND	4.7±0.0	1.2±0.0	1.5±0.5	9.0±0.0
Glu-N-2	6.2±0.5	4.3±0.1	1.2±0.3	4.9±1.7	5.1±0.0
Glu-N-5	6.1±0.3	4.0±0.1	1.4±0.2	4.6±1.0	5.1±0.0
Glu-G-0	ND	4.6±0.2	1.1±0.0	1.3±0.4	7.1±0.0
Glu-G-2	5.5±0.5	4.2±0.1	1.2±0.1	2.6±0.4	12.0±0.0
Glu-G-5	5.3±0.7	4.2±0.0	1.1±0.0	2.4±0.7	11.7±0.0
(C) Koji with nonglutinous rice
Nong-N-0	ND	4.5±0.3	1.1±0.1	1.9±0.2	9.2±0.0
Nong-N-2	5.3±0.1	4.4±0.0	1.0±0.0	2.6±1.0	5.0±0.0
Nong-N-5	5.8±0.2	4.4±0.0	1.1±0.0	3.9±0.7	5.0±0.0
Nong-G-0	ND	4.1±0.0	1.1±0.0	1.6±0.3	7.5±0.0
Nong-G-2	5.2±0.3	4.2±0.1	1.0±0.0	1.5±0.6	12.4±0.0
Nong-G-5	5.5±0.2	4.2±0.1	1.0±0.1	1.9±0.7	11.8±0.0

농업생명공학연구원

KACC93183P

20130816

농업생명공학연구원

KACC93184P

20130816

<110> Sunchang Research Center for Fermentation Microbes(SRCM) <120> Yeast strains having high productivity of alcohol from traditionally fermented soybean products, and uses thereof <130> PN15120 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gcatatcaat aagcggagga aaag 24 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggtccgtgtt tcaagacgg 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcctcccgct tattgatatg c 21

Claims

알코올 고생산능을 가지는, 피키아 구일리에르몬디(Pichia guilliermondii) JBCC 848 균주(KACC93184P).
제1항의 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 알코올 생산용 조성물.
제1항의 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 유효성분으로 함유하는 저염화 장류의 보존성을 향상시키기 위한 조성물.
코지(Koji)에 제1항의 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가하여 발효하는 단계를 포함하는 저염화 장류의 보존성을 향상시키는 방법.