KR20140062907A - 초산 생성능이 우수한 신규 균주 및 그 균주를 이용한 유기산 제조방법 - Google Patents

초산 생성능이 우수한 신규 균주 및 그 균주를 이용한 유기산 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH) 균주 및 이를 이용한 식초의 제조방법에 관한 것으로 본 발명의 아세토박터 파스테리아누스 YH 균주는 종래의 초산 생산균보다 다양한 과실주에서 초산생산능이 우수하므로 이를 이용한 식물성 원료 추출액을 포함하는 기능성 식초의 제조 방법을 널리 응용 될 수 있을 것이다.

Description

초산 생성능이 우수한 신규 균주 및 그 균주를 이용한 유기산 제조방법{Novel microorganism with high productivity of acetic acid and method for producing organic acid using the same}
본 발명은 초산을 생산하는 균주에 관한 것으로 좀 더 구체적으로 알콜 존재하에 높은 초산 발효능을 가지는 신규한 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH)균주 및 상기 균주를 이용한 유기산의 제조방법에 관한 것이다.
식초는 오랜 기간 우리 일상생활에 중요한 조미료로 사용된 발효식품 중의 하나로서, 자연적으로 술이 시어지는 현상에 의해 발견되고 이용된 것이다. 주로 음식의 맛을 내는데 이용되어 직접 식용되기도 하지만 피클 등 절임 식품, 마요네즈, 케첩, 소스류 등의 제조 원료로도 널리 사용된다. 그 외에 의약적인 효능을 갖고 있어 민간 의약품으로 사용되기도 하며 부패균 생육억제 작용을 이용하여 방부제나 보존료로 이용되기도 하였다.
또한 체내의 젖산을 분해하여 몸의 피로를 회복시키는 효과가 있으며 숙취 해소와 이뇨작용, 소화액의 분비 촉진, 당뇨병 예방, 비만 방지, 혈압상승방지, 노화방지 및 스트레스 해소에 효능이 있는 것으로 보고되어 식초의 용도가 더욱 다양화되어 가고 있다. 특히 발효식초는 최근에 기능성 식품으로도 많이 활용되며 묽게 희석하여 직접 음용하는 음료 제품이 개발되고 있다.
식초의 종류는 곡류나 알코올성 음료 또는 과일즙을 발효시켜 만들어지는 발효식초(양조 식초)와 빙초산이나 초산을 중심재료로 만들어지는 합성식초로 나뉜다. 발효식초는 과실식초, 곡물식초, 주정식초로 재료에 따라 나뉘며 과실식초는 과실술덧, 과실착즙액, 주정 및 당류 등의 원료를 혼합한 초산 발효액이고, 곡물식초는 곡물술덧, 곡물당화액, 알코올 및 당류 등의 원료를 혼합하며, 주정식초는 주정, 당류, 첨가물 등의 원료를 혼합하여 초산발효액이다. 합성식초는 발효과정을 거치지 않고 빙초산 또는 초산을 희석하여 유기산을 첨가한 것으로 무색투명하다.
발효식초는 원료의 자체의 향기성분과 발효공정 중에 생성된 향기성분을 가지며 초산 이외에 휘발성 및 비휘발성의 각종 유기산류, 당류, 아미노산류, 에스테르류 등을 함유하고 있다. 합성식초는 빙초산을 희석한 것으로 석유 원료로부터 아세트알데히드를 만든 후, 이것을 다시 화학적으로 산화시켜 초산을 만든 것이다. 그래서 초산성분 이외에 다른 영양성분이 없을 뿐만 아니라 발효식초와 달리 강산성이며 향기성분도 거의 없다.
식생활의 향상에 따른 건강용 식초의 수요가 증가하고 있으나 발효식초는 수율이 낮고 소요되는 시간이 길며 장기간 발효 과정으로 인한 이미, 이취 발생뿐만 아니라 품질관리가 어려운 문제가 있어 고품질의 천연 양조식초 제조에 어려움이 있어 현재 산업적으로 생산되는 식초는 대부분 합성된 초산을 희석하여 제조되는 실정이다. 이러한 한계를 극복하기 위해 식초의 제조 공정은 지속적으로 개량되어가고 있으나 초산 발효균주의 개량은 아직 미미한 상태이다. 이에 초산의 생산 수율이 높고 식초 제조에 용이한 균주를 발굴 및 개발하여야 할 필요성이 대두되고 있다.
관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020120072918호는 4종류의 효모로 제조한 술덧을 이용하여 정치 초산발효에 의한 천연 양조식초를 제조하는 방법에 관한 것으로 천연 양조식초 제조방법은 시판 식초로부터 고유기산을 생성하는 초산균을 분리하고, 알코올 생성 효모를 선정하여 종래의 병행복발효법의 공정을 개선한 2단계 발효법에 의해 알코올 발효와 초산 발효를 분리 실시함으로써 장기간 발효과정으로 발생할 수 있는 이미, 이취의 단점을 극복하고 초산 생성율이 현저히 높고 아울러 품질이 우수한 천연 양조식초 제조방법을 제공하여 스트레스 해소에 도움을 주는 부신피질 호르몬 생성에 작용하는 초산의 함량이 현저히 높은 천연 양조식초를 제공함으로써 공해와 스트레스에 시달리는 현대인의 건강을 보호 및 유지시킬 수 있는 효과를 발휘한다고 기재되어 있으며,
다른 관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020110097500호는 복숭아로부터 분리되고, 산 생성능을 가지며, 양파의 초산 발효능을 가지고, 양파를 발효시켜 초산, 사과산, 구연산, 숙신산, 옥살산 및 주석산을 생성할 수 있는 기탁번호 KFCC 11476P를 갖는 아세토박터 트로피칼리스 균주(Acetobacter tropicalis KFCC 11476P)에 대해서 기재되어 있다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 높은 수율로 초산을 생산하는 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 다양한 식물 원료의 식초 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 아세토박터 파스테리아누스 YH(기탁번호 KACC 91742P)을 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 식물성 원료 또는 그 식물성 원료의 알콜 발효액에 처리하여 식초를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 식물성 원료는 양파, 포도, 오디, 복숭아, 사과, 현미, 대추, 마늘, 유자, 복분자, 오미자, 아로니아(블랙초코베리), 야콘, 수수, 블루베리, 또는 식용피 등인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 식물성 원료 또는 그 식물성 원료의 알콜 발효액에 처리하여 유기산을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유기산은 초산, 젖산, 구연산, 및 사과산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기산인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 균주를 식물성 원료 또는 그 식물성 원료의 알콜 발효액에 처리하여 폴리페놀을 함유하는 유기산을 제조하는 방법을 제공한다.
또 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 식초를 제공한다.
또 본 발명은 상기 본 발명의 식초를 함유하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서 상기 식품은 음료, 기능성 식품, 조미 식품 등이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 자연 발효된 야콘 식초로부터 분리되고 높은 수율로 초산을 생산하는 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH)균주를 제공한다. 바람직하게는 전기 균주는 야콘, 포도, 양파의 6% 알콜 발효액에서 우수한 초산 발효능이 있으며 젖산, 구연산, 사과산을 생성할 수 있어 산 생성능이 우수한 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH) 균주이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
초산발효는 공기 중의 산소를 이용하는 초산균의 작용으로 알코올 발효액을 호기적으로 산화시켜 아세트알데히드를 거쳐 아세트산으로 만드는 과정이다.
본 발명자들은 6%의 알콜 함유 야콘주의 자연 발효과정에서 생성된 초산 균주를 mannitol배지에서 배양하여 순수분리하였다. 분리된 균주는 에탄올을 함유한 초산발효 배지에서 배양하고 초산 생성능을 측정하여 초산 생성능이 우수한 YH균주를 분리하였다.
상기 분리된 균주는 16S rRNA 염기서열 분석결과 공시균주인 아세토박터 파스테리아누스 bh-12(Acetobacter pasteurianus bh-12)와 99.7%의 높은 상동성을 나타내어 아세토박터 파스테리아누스로 동정되었다.
상기 균주는 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH)로 명명하였으며, 대한민국 수원 소재 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2012년 9월 13일에 Acetobacter pasterianus YH (기탁번호 KACC 91742P)로 기탁하였다.
또한 본 발명의 균주는 다양한 발효 조건에서 초산 발효능이 뛰어나 25 - 30℃의 실온에서 정치 배양, 진탕 배양(100, 50rpm)으로 초산 생성능이 우수할 뿐 아니라, 초산 생성도 용이한 균주이다.
본 발명은 농가에서 식초제조 환경과 유사한 실온과 정치 배양 조건에서 자연발효시켰을 때 초산 발효가 용이했으며 반복적 배양에서도 용이한 초산 생성능을 가진 균주이다.
상기 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH)의 최적 산 생성 조건은 초기 에탄올 농도가 6%(v/v)인 것이 최적 산 생성 조건이고 야콘주를 초산 발효시켜 초산을 생성할 뿐 아니라 사과산, 구연산, 젖산도 생성할 수 있다.
본 발명의 균주는 초산 생성능이 우수하고 다양한 유기산을 생성할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 균주를 이용하여 제조된 발효액은 폴리페놀 함량이 높은 것으로 나타났다.
따라서, 상기 균주는 야콘 식초, 포도식초, 양파식초를 포함한 다양한 식물성 원료 추출액 식초의 제조에 사용될 수 있으며 이에 포함된 식초를 이용한 다양한 가공식품 제조를 위한 종균으로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
본 발명은 높은 수율로 초산을 생산하며 식초 제조에 용이한 균주를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 야콘주의 자연 발효 식초로부터 분리한 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH)균주가 종래의 초산발효균보다 높은 수율로 초산을 생산할 뿐만 아니라, 다양한 식물성 원료 추출물의 알코올 발효액을 이용하여 식초를 제조할 수 있음을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH)균주는 야콘에서 발효능이 우수하고, 초산생성능이 뛰어나며 야콘으로부터 초산을 비룟한 다양한 유기산, 구체적으로 젖산, 구연산, 사과산을 생성할 수 있으며 폴리페놀함량이 우수한 것으로 확인되어 고기능성 식초를 제조하기 위한 종균으로 사용될 수 있을 것이며 국내에서 생산되는 농산물의 새로운 수요 창출 및 농가의 직접적인 접목을 통한 고부가가치화를 유도한다는 점에서 산업적 이용가치가 매우 크다고 할 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH)의 16S rRNA의 염기서열이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH)의 염기서열을 기초로 한 다른 세균과의 계통발생론적 관계를 나타내는 그림이다.
도 3은 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH)를 이용한 야콘주의 초산 발효액의 산도를 나타내는 그래프이다. 대조구로 아세토박터 아세티 12655 (Acetobacter aceti 12655), 아세토박터 속 6-C-2 (Acetobacter sp. 6-C-2)를 함께 배양하여 비교하였다.
도 4는 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH) 균주와 아세토박터 속 6-C-2 (Acetobacter sp. 6-C-2)의 포도, 양파주의 초산 발효의 초산 생성능을 비교한 그래프이다.
도 5는 야콘 초산 발효액의 총 폴리페놀을 분석한 그래프이다.
이하, 본 발명의 내용을 구체적으로 설명하기 위하여 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실시예 1: 초산균주의 분리 및 동정
야콘주의 25℃의 자연발효를 통해 생성된 식초에서 발효액을 취해 mannitol 아가배지에 도말하였다. 상기 도말한 아가배지는 30℃에서 2일간 배양한 다음 형성된 균주를 분리하여 분자유전학적 특성에 의한 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 결정한 후 분석하였다.
16S rRNA유전자의 PCR 증폭을 위하여 universal 박테리아 프라이머 쌍; 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 및 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용하였다. 16S rRNA 유전자 분석은 SolGent Co. Ltd.(Daejon, Korea)에 의뢰하여 실시하였다. DNA 염기서열의 분석은 InfoMax Inc.(USA)의 Vector NTI Suite 7.1 program을 사용하여 수행하였으며 DNA의 염기서열의 homology 분석은 BLASTN online program (http://www.ncbi.nih.gov/blast/)을 이용하였다.
상기 분석결과에 따른 계통분석도(Phylogenetic tree)는 treeview program을 이용하여 작성하였으며, 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이 아세토박터 파스테리아누스 bh-12 (Acetobacter pasteurianus bh-12)의 16S rRNA 유전자 염기서열고 각각 99.7%의 높은 상동성을 나타내며, 상기 균주를 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH)로 최종 동정되었다.
상기한 바와 같이, 도 2는 분리균주 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH)로 최종 동정되었다는 것을 나타내며, 그 결과 대한민국 수원 소재 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2012년 9월 13일자로 기탁하여 수탁번호 KACC 91742P를 부여받았다.
실시예 2: 아세토박터 파스츄리아누스 YH 균주를 이용한 야콘 식초의 제조 방법
아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH)는 mannitol 액체 배지에서 진탕배양기를 이용하여 200rpm에서 30℃의 조건으로 2일간 생육시켜 배양액을 제조하였다. 상기 배양액에 에탄올의 농도(v/v)가 3%가 되도록 에탄올이 첨가된 초산생성용 배지에서 30℃에서 2일간 배양하였다. 본 실시예에서 산도란 아세트산을 중화시키기 위한 적정 산도(titratable acidity, %)로 10ml의 희석된 배양액을 중화시키기 위해 사용된 0.1N NaOH(NaOH/kg 당량)의 부피로 결정된다.
본 발명은 야콘 껍질을 제거한 후 녹즙기를 이용하여 제조한 야콘즙에 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 첨가하여 7일 동안 알코올 발효시켰다. 초기 알콜 농도가 6% 되도록 희석한 야콘주를 60℃에서 20분간 살균 처리하였다. 이에 미리 배양한 상기 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH) 배양액을 10%(v/v)로 접종한 다음, 100, 50rpm의 진탕배양과 정치배양으로 25 - 30℃에서 28일간 배양하였다. 대조구로 아세토박터 아세티 12655 (Acetobacter aceti 12655), 아세토박터 속 6-C-2 (Acetobacter sp. 6-C-2)를 함께 배양하며 총산 생성능을 비교하였고, 초산 발효 28일 후 총산을 측정한 결과 도 3에 나타내었다. 6%의 야콘주를 초산 발효한 결과 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH) 균주가 모든 조건에서 약 6%의 초산을 생성하여 초산 생성이 용이한 균주이며 특히, 정치배양에서는 다른 균주에 비해 월등히 생성능이 좋은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 농가형 식초 생산 공정에 유리한 균주라 할 수 있다.
실시예 3:아세토박터 파스테리아누스 YH 균주를 이용한 포도 및 양파 식초의 제조 방법
껍질을 제거하지 않은 포도를 세척한 후 녹즙기를 이용하여 포도즙을 제조하고 효모(Saccharomyces cerevisiae)를 첨가하여 알콜 발효시켜 포도주를 제조하였으며 양파도 위와 동일한 방법으로 양파주를 제조한 후 60℃에서 20분간 살균처리하였다. 알콜 농도가 6% 되도록 희석한 포도 및 양파의 알콜 발효액에 아세토박터 속 6-C-2 (Acetobacter sp. 6-C-2), 아세토박터 파스테리아누스 YH(Acetobacter pasteurianus YH) 배양액 10%(v/v)로 접종한 다음, 진탕 배양과 정치배양으로 25 - 30℃에서 28일간 배양하였다. 아세토박터 아세티 12655 (Acetobacter aceti 12655)는 포도, 양파주에서 초산 발효가 되지 않았다. 배양 중 7일 간격으로 총산을 측정한 결과를 도 4에 나타내었다. 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH)는 양파, 포도주에서 초산 생성능이 높은 것으로 나타났으며 아세토박터 속 6-C-2 (Acetobacter sp. 6-C-2)는 양파주에서 초산 생성능이 높지 못하고 아세토박터 아세티 12655 (Acetobacter aceti 12655)는 초산 발효가 일어나지 않아 식초로 제조 되지 않았다.
실시예 4:본 발명 초산발효액의 유기산 조성 분석
아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH) 균주를 이용한 초산 발효액을 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)의 유기산 분석을 통해 유기산 생성능을 측정하였다. 초산 발효액은 30℃에서 28일 동안 100rpm으로 진탕 배양한 것으로 총산 측정 결과 5.826%로 나타났으며, 보다 구체적으로 측정하기 위해 표 1의 조건으로 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하였다. 또한 동일한 분석조건으로 구연산, 초산, 젖산, 사과산 표준품의 검량 곡선을 작성하여 각 유기산을 정량하였다. 실험결과, 초산 발효액은 구연산, 초산, 젖산, 사과산이 검출되었으며 분석결과는 표 2에 나타낸 바와 같다. 초산 발효에 함유된 유기산 중에서 초산의 함량은 92%로 주된 유기산은 초산인 것으로 나타났다. 아세토박터 파스테리아누스 YH (Acetobacter pasteurianus YH) 균주는 초산 생성능이 매우 우수한 균주로 확인되었다.
Figure pat00001
Figure pat00002
실시예 5: 초산발효액의 총 폴리페놀 함량 분석
상기 실시예 2의 초산발효액에 대한 총폴리페놀 함량 분석은 Folin-Ciocal-teu's 방법에 따라 측정하였다. 상기 아세토박터 파스테리아누스 YH(Acetobacter pasteurianus YH)균주 외에도 아세토박터 아세티 12655 (Acetobacter aceti 12655), 아세토박터 속 6-C-2 (Acetobacter sp. 6-C-2)를 이용한 초산 발효액을 함께 비교 분석하였다.
초산발효액 0.1ml에 2N Folin-Ciocalteu's 시약 0.5ml과 증류수 8.4ml을 혼합하고 여기에 20%의 Na2CO3를 1ml가하여 1시간 방치한다. 분광광도계를 이용하여 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도 값은 Gallic acid 표준품의 검량곡선을 작성하여 유도된 식에 대입하여 폴리페놀의 함량(mg%)을 계산하였다. 그 결과 아세토박터 파스테리아누스 YH(Acetobacter pasteurianus YH)균주를 이용한 초산 발효액의 총폴리페놀 함량이 높게 측정되었으며 폴리페놀은 초산 발효가 시작되고 7일까지는 증가하다가 그 이후에는 더 이상 증가하지 않는 것으로 나타났다.
실시예 5:초산발효액의 관능검사
본 발명의 방법에 의해 제조된 초산발효액의 관능검사 결과는 표 3과 같다. 표 3의 대조구(A)는 아세토박터 아세티 12655(Acetobacter aceti 12655)로 대조구 (B)는 아세토박터 속 6-C-2 (Acetobacter sp. 6-C-2)를 이용한 초산발효액으로 본 발명 아세토박터 파스테리아누스 YH(Acetobacter pasteurianus YH)의 색, 향, 신맛, 단맛, 및 전반적인 기호도를 9점 만점으로 평가한 것을 나타낸 것이다.
Figure pat00003
9점 평점평으로 평가하였으며, 색, 향, 신맛, 단맛, 전반적인 기호도는 선호도가 높을 수록 높은 점수를 주었다.
*** Significantly different at the p<0.001.
NS Not Significant.
관능검사 결과 대조구보다 본 발명의 아세토박터 파스테리아누스 YH(Acetobacter pasteurianus YH)를 이용한 초산 발효액의 기호도가 높았으며 신맛에 대한 선호도가 다른 대조구 보다 높아 전반적인 기호도가 높게 평가되었다. 상기 균주 아세토박터 파스테리아누스 YH(Acetobacter pasteurianus YH)가 초산 생성능 뿐 아니라 관능에서도 다른 균주보다 기호도가 높은 것으로 확인되었다.
농업생명공학연구원 KACC91742P 20120913

Claims (8)

  1. 아세토박터 파스테리아누스 YH(KACC 91742P)
  2. 제 1항의 균주를 식물성 원료 또는 그 식물성 원료의 알콜 발효액에 처리하여 식초를 제조하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 식물성 원료는 양파, 포도, 오디, 복숭아, 사과, 현미, 대추, 마늘, 유자, 복분자, 오미자, 아로니아, 야콘, 수수, 블루베리, 또는 식용피인 것을 특징으로 하는 식초를 제조하는 방법.
  4. 제 1항의 균주를 식물성 원료 또는 그 식물성 원료의 알콜 발효액에 처리하여 유기산을 제조하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 유기산은 초산, 젖산, 구연산, 및 사과산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기산인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항의 균주를 식물성 원료 또는 그 식물성 원료의 알콜 발효액에 처리하여 폴리페놀을 함유하는 유기산을 제조하는 방법.
  7. 제2항 또는 제3항의 제조방법에 의하여 제조된 식초.
  8. 제7항의 식초를 함유하는 식품 조성물.

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