CN109355212B - 一株米曲霉za132及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA132。本发明还公开了米曲霉ZA132在制曲中的应用，以及制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。本发明还公开了米曲霉ZA132在制备酱油和/或酱中的应用。采用本发明提供的米曲霉ZA132菌株进行发酵，所得酱油中鸟苷酸含量较高，此外，该菌株生长速度快、孢子丰富，易于培养，发酵产品鲜味突出、质量好；米曲霉ZA132菌株在酱及酱油酿造方面具有非常大的生产应用价值，应用前景广阔。

Description

一株米曲霉ZA132及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及米曲霉(Aspergillus oryzae)，具体涉及一株通过诱变技术获得的可提高发酵调味品中鸟苷酸含量的米曲霉ZA132，还涉及所述米曲霉在提升发酵调味品风味与品质方面的应用。

背景技术

米曲霉(Aspergillus oryzae)是酱油酿造的关键菌种，米曲霉在制曲过程中所分泌的各种酶的种类及含量在很大程度上决定了发酵所得酱油的色泽、香气、口感等各个方面的品质。

目前我国大部分的酱油生产企业均采用米曲霉沪酿3.042作为酱油生产菌种。沪酿3.042是一株优良的生产菌株，其在制曲过程中分泌各种酶系，如蛋白水解酶系、淀粉水解酶系、纤维素酶、果胶酶、植酸酶等，为后续的发酵奠定了丰富的酶系基础。特别是其拥有丰富的中性蛋白酶，大大提高了发酵所得酱油的氨基酸态氮含量，在一定程度上提升了酱油的品质。

然而，米曲霉沪酿3.042也有不足的方面，其酿造所得的酱油鲜味不够突出，酱油风味不足。为了维持产品良好的鲜味，通常会采用额外添加谷氨酸钠或呈味核苷酸的方式来提升产品品质，生产出符合消费者口味需求的产品。但是随着消费者对更高生活品质的追求，饮食健康问题日益受到关注，额外添加味精等添加剂不仅增加了生产成本而且往往会给消费者留下不良的产品印象，最终影响了产品的竞争力。

目前的研究表明，酱油的鲜味与酱油中的呈鲜物质有关，呈鲜物质主要有鲜味氨基酸，如谷氨酸、天门冬氨酸；鲜味核苷酸，如鸟苷酸、肌苷酸；以及鲜味肽等。它们对酱油口感鲜味的呈现有着非常重要的作用。

其中鸟苷酸作为一种鲜味核苷酸，更有着“强力味精”之称，少量的鸟苷酸与谷氨酸钠发挥协同作用能使酱油鲜味大大提升。因此，相对谷氨酸钠而言，酱油中只需含有少量的鸟苷酸便可有效提高酱油的鲜味，增强酱油整体风味。

专利201210005222.3、200980111752.2、200610043444.9以及张灵芬等人的研究论文《一种高I+G型酵母抽提物酱油的生产工艺研究》中均公开了一种通过提高酱油中鸟苷酸或肌苷酸含量从而提升酱油鲜味的方法，这些方法均是以酵母为原料，将酵母细胞裂解得到含有鸟苷酸的酵母抽提物，在酱油发酵或酱油调配过程中添加进入酱油中达到提升酱油鲜味的目的。这些方法虽能提高酱油中鸟苷酸含量，但其主要来源于酵母，对酵母菌体的需求量大，且需要经过裂解、提取等工艺，操作复杂，成本投入高，具有一定局限性。

发明内容

鉴于以上技术的不足，本发明的目的在于提供一株米曲霉菌株，应用该菌株酿造酱油、酱等调味品，不仅能够提高酿造产品中的鸟苷酸含量，提升酿造调味品的自然鲜度，而且能够避免额外添加鲜味剂，降低生产成本，经济效益显著。

为实现本发明的目的，本发明人通过大量的实验和不懈的探索，最终获得了如下技术方案：

在第一个方面，本发明提供了一株米曲霉ZA132，已于2018年8月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.NO：60427，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075。

本发明的米曲霉ZA132菌落特征如下：

将该菌株接种在豆汁培养基上进行培养，菌落为圆形，菌丝生长旺盛，培养初期气生菌丝呈白色，蓬松丝绒状，其上附着的分生孢子为黄白色；随着培养时间的延长，气生菌丝从菌落中心向四周呈辐射状生长，菌落直径变大；气生菌丝生长高度从菌落中心向菌落边缘递减，分生孢子由黄白色转变成黄绿色；在28℃培养5d后菌落直径可达40-65mm，成熟孢子为黄绿色，菌落背面为黄褐色，有褶皱。

本发明的米曲霉ZA132，以沪酿3.042为出发菌株，通过公知诱变方法中紫外线进行诱变所获得变异菌株。具体地，本发明所述的米曲霉ZA132菌株的诱变选育方法如下：

(1)以米曲霉沪酿3.042为出发菌株，使用其中一种公知诱变方法，优选紫外线方法对出发菌株进行诱变，并涂布于大豆蛋白平板上进行筛选获得变异菌株；

(2)采用沪酿3.042菌种的常规培养方法培养经步骤(1)挑选出的米曲霉变异菌株，观察并记录米曲霉变异菌株的生长情况；挑选生长速度快，孢子丰富的米曲霉变异菌株，移种于豆汁斜面培养基上进行菌种保藏并进行三角瓶发酵。发酵结束后用滤纸过滤收集发酵液，采用HPLC法检测发酵液中鸟苷酸含量；并挑选出产鸟苷酸含量高的菌株，备用；

(3)将经步骤(2)筛选出的米曲霉菌株接种于发酵原料中，发酵原料优选大豆/脱脂大豆和小麦，并采用常规方法进行曲池制曲、酱油发酵生产小试试验；筛选出一株生长速度快，发酵所得酱油中鸟苷酸含量高的菌株，该菌株命名为米曲霉ZA132，已于2018年8月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.NO：60427，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼；

为了验证本发明的米曲霉ZA132的稳定性，在一些实施例中，将米曲霉变异菌株在豆汁培养基上连续传代10代；将第1代、第5代、第10代豆汁斜面菌种按照上述步骤(3)的方法酿造成酱油，观察记录每代斜面米曲霉的生长情况及制曲情况，并检测发酵所得酱油的鸟苷酸含量；考察各代菌株小试发酵所得酱油的鸟苷酸含量稳定性，若到第10代还未发生回复突变，则表明菌株遗传稳定性良好。

在一些实施例中，上述步骤(1)中的大豆蛋白培养基的配方为：大豆蛋白1g，麦芽糖2g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸锌1g，氯化钠0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁0.1g，磷酸二氢钾0.1g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1L，pH6.0～6.5，0.1Mpa、121℃灭菌15min；为避免大豆蛋白与麦芽糖高温灭菌发生美拉德反应，二者分开灭菌。

在一些实施例中，所述步骤(2)中的三角瓶发酵培养基配方为：脱脂大豆：小麦＝1:1；脱脂大豆润水1.2倍，0.1Mpa、121℃灭菌20min；与小麦拌匀后分装入三角瓶，每瓶30g。

为了验证本发明的米曲霉ZA132菌株的效果，在一些实施例中，将米曲霉ZA132菌株以大豆/脱脂大豆和小麦为原料进行圆盘制曲机制曲，制得成曲采用发酵罐进行高盐稀态发酵，盐水浓度、发酵温度及发酵周期管理按照常规方法进行，终止发酵时，酱油中氨基氮含量达到1.11g/100mL以上，谷氨酸含量达到8.5g/L以上，鸟苷酸含量达到0.20g/L以上；酱油色泽红亮，体态澄清，酱香浓郁，鲜味突出，口感醇厚绵长。

因此，在一方面，本发明提供所述米曲霉ZA132。

在另一方面，本发明提供所述米曲霉ZA132在食品发酵中的用途。在一个实施方案中，食品发酵为酱和/或酱油发酵。

在一方面，本发明还涉及所述的米曲霉ZA132在制曲中的用途。在一个实施方案中，本发明涉及米曲霉ZA132在制曲中的应用，其中制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。

在又一方面，本发明还涉及所述的米曲霉ZA132在制备酱油和/或酱中的用途。

在一方面，本发明提供制备酱和/或酱油的方法，其中将所述米曲霉ZA132用于制备成曲。

在另一方面，本发明所提供的米曲霉的培养方法，其中使用所述米曲霉ZA132作为培养菌株。

在又一方面，本发明涉及制备鲜味剂培养物的方法，其以米曲霉ZA132为发酵菌剂。

综上所述，本发明的有益效果为：

采用本发明提供的米曲霉ZA132菌株进行发酵，所得酱油中鸟苷酸含量高，此外，该菌株生长速度快、孢子丰富，易于培养，发酵产品鲜味突出、质量好；米曲霉ZA132菌株在酱及酱油酿造方面具有非常大的生产应用价值，应用前景广阔。

附图说明

图1为米曲霉ZA132的获得及应用流程图；

图2为采用米曲霉ZA132发酵所得酱油的感官鉴评结果图；

图3为平板培养所得米曲霉ZA132的照片。

具体实施方式

本发明的目的之一是提供一株可提高发酵酱油或酱中鸟苷酸含量的米曲霉菌株；本发明还提供了上述米曲霉的培养方法；本发明的第三个目的是提供一种应用上述米曲霉ZA132制备高鸟苷酸含量的酱油或酱的方法。通过上述技术方案，从根本上解决现有酱油或酱生产菌株发酵所得产品鲜味不足的局限性，提升发酵酱油或酱中助鲜成分的含量，改善和提升口感鲜味，从而提高酱油或酱的品质。

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1米曲霉菌株的诱变

将培养成熟的沪酿3.042菌株的孢子制成孢子悬液，并对孢子悬液进行紫外诱变。经过紫外诱变后的孢子悬液按照10倍梯度稀释法，用无菌生理盐水将孢子悬液稀释到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6浓度，制成孢子稀释液。

取0.2mL孢子稀释液涂布于大豆蛋白平板培养基上，30℃避光培养4d。在培养过程中观察并记录菌落生长快慢情况、孢子着生情况。挑选出生长速度快、孢子着生良好的菌株，移种于豆汁斜面培养基中，30℃培养箱培养至成熟后置于4℃冰箱保藏备用。

实施例2米曲霉菌株三角瓶培养与发酵

将脱脂大豆、水按一定比例混合拌匀，于121℃灭菌20min，将小麦拌入脱脂大豆，分装三角瓶后制成固体三角瓶培养基。将实施例1中的米曲霉斜面菌种移种三角瓶培养基中，32℃培养96h至曲料成熟，制得三角瓶曲料。

往三角瓶曲料中加入2倍的盐水进行高盐稀态发酵，于45℃培养箱中分解发酵30d。发酵结束后摇匀过滤，滤液用HPLC法测定鸟苷酸含量。获得3株产鸟苷酸含量高的菌株，命名为ZA132，AT121，UY155。滤液检测结果如表1所示。

表1三角瓶发酵所得滤液检测结果

上述表1的结果显示，与出发菌株沪酿3.042相比，本实施例所得菌株产氨基氮、鸟苷酸能力强；并优选氨基氮、鸟苷酸收得率最高的米曲霉菌株ZA132进行后续实验。

本实施例选育获得的米曲霉ZA132已经由本发明人于于2018年8月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60427，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

实施例3米曲霉ZA132菌株在酱油生产中的应用

采用实施例2中所得的米曲霉ZA132按常规方法制作成的种曲添加至由黄豆、小麦按一定比例配置而成的曲料中，并采用圆盘制曲机制曲，制曲过程为常规方法制曲，无需特别处理，即在沪酿3.042制曲生产工艺的基础上，完全正常生产，得到米曲霉ZA132菌株的圆盘成曲。

将上述圆盘成曲中加入2倍的盐水进行高盐稀态发酵，发酵温度及发酵周期管理按照常规方法进行，共进行3批次的高盐稀态发酵。发酵结束后，将压榨所得的酱油进行氨基氮、谷氨酸、鸟苷酸含量检测，检测结果见表2。结果表明，酱油中氨基氮含量达到1.11g/100mL以上，谷氨酸含量达到8.5g/L以上，鸟苷酸含量达到0.2g/L以上。

本实施例还召集10名有丰富经验的鉴评人员进行酱油感官鉴评。感官鉴评的评价指标包括鲜味、甜味、酸味、咸味、苦涩味和浓厚感，分值为0～4分，分数越高，该项指标越好。感官鉴评结果总结于表3和图2中。感官鉴评结果表明，ZA132菌株发酵所得酱油色泽红壮有光泽，酱香浓郁，鲜味突出、口感醇厚绵长。

表2米曲霉ZA132菌株发酵酱油指标检测

表3米曲霉ZA132菌株发酵酱油感官鉴评结果

菌株	鲜味	甜味	咸味	酸味	苦涩味	浓厚感
							ZA132	3.6	3.0	3.0	3.0	3.0	3.5
沪酿3.042	2.7	3.0	3.0	3.0	3.0	3.0

实施例4米曲霉ZA132菌株的遗传稳定性

将米曲霉ZA132菌株在豆汁斜面培养基上连续传代10代，观察并记录各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代斜面种按照实施例2所述的方法进行三角瓶培养与发酵。检测发酵酱油氨基氮含量及鸟苷酸含量，判断米曲霉ZA132菌株的遗传稳定性，检测结果如表4所示，第1代、第5代和第10代米曲霉ZA132菌株发酵所得酱油中鸟苷酸含量依次为0.19、0.19和0.18g/L，鸟苷酸的含量几乎相同，由此表明，本发明的米曲霉ZA132菌株遗传稳定性良好。

表4米曲霉菌株ZA132遗传稳定性检测结果

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA132，其已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO:60427，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

2.权利要求1的米曲霉ZA132在食品发酵中的用途。

3.权利要求2所述的用途，其中食品发酵为酱油和/或酱发酵。

4.权利要求1的米曲霉ZA132在制曲中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其中制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。

6.权利要求1的米曲霉ZA132在制备酱油和/或酱中的应用。

7.米曲霉的培养方法，其中使用权利要求1所述的米曲霉ZA132作为培养菌株。

8.制备鲜味剂培养物的方法，其以权利要求1的米曲霉ZA132为发酵菌剂。