CN107586729B - 一株米曲霉za138及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA138，在制曲阶段应用米曲霉ZA138能够显著减少结块现象，促进供氧和米曲霉生长，能够显著提升成曲的蛋白酶活力；利用米曲霉ZA138制曲发酵的酱油和酱，氨基酸态氮含量得到显著提升，显著改善产品风味。本发明还涉及米曲霉ZA138在制曲中的应用。本发明还涉及米曲霉ZA138在制曲中的应用，其中米曲霉ZA138制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。本发明还涉及所述的米曲霉ZA138在制备酱油和/或酱中的应用。

Description

一株米曲霉ZA138及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及曲霉菌，具体涉及一株能够减少制曲结块和提高收得率的米曲霉(Aspergillus oryzae)，还涉及所述曲霉菌在降低酱油或黄豆酱制曲结块和提高收得率方面的应用。

背景技术

在制曲过程中，控制恰当的温度、湿度和通风条件，对米曲霉的生长及蛋白酶的形成十分重要。优良的成曲能使曲菌充分繁殖，这不仅直接影响曲料的质量，而且影响酱醪的成熟速度和成品的质量。当曲料布满菌丝收缩和结成块状时，空气不易穿透，引起曲温不均匀，曲料表层和内部温差加大。米曲霉生长的最适温度是32～35℃，温度过低或过高都会影响米曲霉发芽和生长速度，影响下一代孢子生长的情况。同时，曲料结块不利于排除曲池内的潮湿空气(排潮)，引起杂菌生长。收得率是指每公斤原料蛋白的投入能够生产出标准酱油或黄豆酱的量。从经济角度考虑，收得率高意味着投入相同量的原料成本能够生产出更多的产品，从技术角度考虑，收得率高也就是原料被更多地转化成主要目标产物——氨基酸，同时也提高了原料利用率。因此，对如何减少制曲阶段曲料结块和提高收得率的研究是非常必要的。

包启安在《酱油科学与酿造技术》中提到，可以通过散布轻质CaCO₃粉末于豆粒表面防止豆粒相互黏结，进而提高蛋白酶活性。目前大部分米曲霉和提高酱油或黄豆酱收得率的专利集中于研究菌种所分泌蛋白酶活力的强弱和制曲工艺的调整。在中国专利201310553081.3中，通过诱变育种筛选出蛋白酶活力比原菌高的UE336-2新菌种，其侧重的是菌种本身所分泌蛋白酶活力的强弱，而不是通过减少曲料结块促进米曲霉生长和分泌蛋白酶。在中国专利201010578844.6、中国专利申请201410796125.X、中国专利201410206105.2、中国专利201410143505.3中，通过连续蒸煮工艺或多菌种混合发酵工艺提高原料转化率和利用率，但需要投入相应的连续蒸煮设备和添加酵母、乳酸菌、黑曲霉等其它发酵剂。在中国专利申请201610371277.4中，筛选得到一株米曲霉菌株，该菌株除产蛋白酶外，还高产内切葡聚糖酶，用于酱油酿造可提高原料利用率。上述专利或文献虽然都涉及各种减少曲料结块和提高原料利用率的措施，但均未论述菌丝短的米曲霉在这些方面的应用。

上述文献资料和专利/专利申请，报道了通过诱变筛选得到高蛋白酶活力新菌株来提高收得率，报道了多菌种混合发酵对收得率的提升作用，报道了调整制曲工艺如添加CaCO₃粉末和加强通风促进米曲霉生长，但既缺乏能够有效减少曲料结块的米曲霉菌种，也缺乏利用短菌丝米曲霉减少曲料结块的应用工艺。

发明内容

鉴于以上技术的不足，本发明目的在于选育获得一株能够减少曲料结块的米曲霉，该菌种制曲时曲料不结块，能够提高制曲蛋白酶活力，且不会对后续发酵带来负面影响。利用该菌种在有效减少曲料结块的同时，能够确保多菌种的协调生长，特别是促进米曲霉菌株的生长，提升米曲霉的蛋白酶活力，改善发酵指标和风味口感质量，显著提高收得率。

为了实现本发明的目的，本发明人通过大量的实验和不懈的探索，最终获得了如下实验方案：

本发明提供的米曲霉菌株ZA138，已于2017年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏编号为GDMCC No：60181。

本发明的米曲霉菌株ZA138，是发明人从佛山市海天(高明)调味食品有限公司发酵酱醪中，经过多次诱变、筛选和分离纯化培养获得。

本发明的米曲霉ZA138，即为以沪酿3.042为出发菌株，通过公知诱变方法中的任一种进行诱变所获得变异菌株。该菌株在酪蛋白平板上，成熟菌落直径较大，菌丝体细、绒、分散密度较不均匀，孢子头较不明显、色泽嫩黄，成熟菌落周围透明圈都较清晰，菌落直径平均在25.8mm左右，透明圈直径平均在32.5mm左右。该菌株在豆汁平板上呈黄色(或呈轮状黄色与浅黄色相间)，菌丝稀薄，孢子细，反面培养基皱褶明显。

本发明还涉及所述的米曲霉ZA138在制曲中的应用。

在一个实施方案中，本发明涉及米曲霉ZA138在制曲中的应用，其中制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。

本发明还涉及所述的米曲霉ZA138在制备酱油和/或酱中的应用。

本发明还涉及所述的米曲霉ZA138在酱油和发酵酱制曲中的应用。

采用培养沪酿3.042菌种的常规方法培养本发明米曲霉菌株ZA138种曲，培养时间为64～96h，得到种曲孢子数多、发芽率高和蛋白酶活性高的种曲。

采用制曲曲池或者圆盘制曲机制曲，使用原料为大豆/脱脂大豆和小麦/小麦粉，按照常规方法接入米曲霉菌株ZA138，并按常规方法制曲，制曲时间为24～48h，得到曲温均匀、米曲霉生长情况良好的制曲成曲，而且经曲池和圆盘制曲成曲中性蛋白酶活力分别提高11％和25％以上，出曲时曲料松散无结块现象。

将上述制曲得到的成曲采用晒池或发酵罐进行发酵，盐分管理、温度管理和发酵周期管理按照常规方法进行，发酵结束时，氨基酸态氮提高10％以上，酱醪风味改善。

本发明提供的米曲霉菌株ZA138易于培养，在制曲阶段应用能够显著减少结块现象，能够显著提升成曲的蛋白酶活力；利用该菌种制曲发酵的酱油和酱，氨基酸态氮含量得到显著提升，显著改善产品风味。

本发明的有益效果：

添加本发明的米曲霉ZA138进行酱油和酱的制曲，能够显著降低成曲结块现象，促进供氧和米曲霉生长；能够显著提升成曲中的蛋白酶活力，提升发酵酱醪中的氨基酸态氮含量，显著改善产品风味；不会带来制曲时米曲霉生长情况差等负面影响。

附图说明

本发明采用以下附图来举例说明本发明的米曲霉的有益效果。应当理解的是，这些仅用于说明本发明的具体实施方案，并不意图限制本发明的范围。

图1为米曲霉ZA138的获得及应用流程图。

图2为米曲霉ZA138的制曲成曲的照片。

图3为使用米曲霉ZA138发酵豆醅感官鉴评结果。

生物保藏信息

一株米曲霉ZA138，已于2017年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏编号为GDMCCNo：60181。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的培养基均可根据本领域相应培养基的常规配方进行配制获得。

下述实施例中，所述百分比含量如无特别说明，均为质量百分比含量。

在本发明中，以米曲霉沪酿3.042为出发菌株，该菌株对于本技术领域的专业人员来说是容易获得的菌株，为中国工业微生物研究所和中国普通微生物研究所等保藏机构保藏。本发明的菌株可以通过公知的任意诱变方法来构建，例如紫外线诱变或者硫酸二乙酯诱变、重离子束诱变等。本发明以米曲霉沪酿3.042为出发菌株，经诱变、筛选菌落、豆汁斜面培养后常规保藏。

实施例1

米曲霉的诱变

将沪酿3.042的孢子进行紫外诱变，然后将分生孢子涂布在酪蛋白平板上，根据菌丝旺盛程度和透明圈大小进行筛选。将显示出透明圈比对照菌株大、菌丝生长旺盛但菌丝短于对照菌株的菌株挑选出来，分别编号为ZA135、ZA136、ZA137、ZA138。将上述菌株转接豆汁培养基斜面上培养，成熟后置于4℃冰箱备用。

实施例2

种曲的制备

将脱脂大豆粉、小麦麸、水按一定比例配制，制备三角瓶扩培培养基，控制该培养基的初始水分为65％。将该培养基分装到150mL三角瓶，每瓶15g，并在121℃的条件下灭菌30min。将实施例1中的米曲霉斜面菌种ZA135、ZA136、ZA137、ZA138分别挑取1环孢子接种于150mL三角瓶中，在30℃下培养96h，获得三角瓶成曲。

将脱脂大豆粉、小麦麸、水按一定比例配制成种曲培养基，控制种曲培养基的初始水分为65％，分装到种曲机的曲盘中，并用121℃条件灭菌30min。称取0.4％三角瓶成曲接种于种曲培养基上，30℃培养时间为72h，获得种曲。

采用本领域常规方法测量所获得的种曲的孢子数、发芽率以及酶活性。

本实施例中的种曲孢子数、发芽率及酶活性检测结果及与采用沪酿3.042按同样方法制得的种曲的相应检测结果对比见表1。

表1 种曲检测结果

检测项目	ZA135	ZA136	ZA137	ZA138	沪酿3.042
						孢子数(亿/g)	136	144	152	159	145
差异	-6.21％	-0.69％	4.83％	9.66％	0.00％
						发芽率(％)	96.4	98.3	98.4	99.3	98
差异	-1.63％	0.31％	0.41％	1.33％	0.00％
						蛋白酶活力(U/g)	11128	10169	10397	10080	9050
差异	22.96％	12.36％	14.88％	11.38％	0.00％

上述表1的结果显示，与出发菌株沪酿3.042相比，本实施例得到了孢子数多、发芽率高和蛋白酶活性高的种曲。

选取孢子数、发芽率和蛋白酶活性均得到提高的米曲霉ZA138进行如以下实施例中的各项测试。

实施例3

米曲霉ZA138的传代稳定性测试

将实施例1中的米曲霉菌ZA138在豆汁培养基上连续传代10代，将第1代、第5代、第10代豆汁斜面菌种按照实施例2制作三角瓶成曲和种曲，测量所获得的种曲的孢子数、发芽率以及酶活性并进行比较，以判断其遗传稳定性，具体数据见表2。

表2 传代稳定性测试的种曲检测结果

从上述表2所示的各代菌种制得种曲的孢子数、发芽率及酶活性检测结果来看，第1代、第5代、第10代豆汁斜面菌种所制得的种曲的各项指标均依然优于出发菌株沪酿3.042，并且保持稳定。这表明米曲霉菌株ZA138的遗传稳定性好，非常适合用于工业化生产。

实施例4

普通制曲曲池制曲

按照常规方法接入米曲霉菌株ZA138，并按常规方法采用普通制曲曲池制曲，在常规制曲生产过程中无需特别处理，即在沪酿3.042制曲生产工艺的基础上，完全正常生产，得到不结块、中性蛋白酶活力高的米曲霉菌株ZA138制曲成曲。出曲的曲料照片见图2。制曲成曲的孢子数和蛋白酶活力检查结果见表3。

表3 曲池制曲检测结果

检测项目	ZA138	沪酿3.042
			孢子数(亿/g)	2.8	2.9
蛋白酶活力(U/g)	2769	2491

上述表3的结果表明，米曲霉菌株ZA138制曲成曲中性蛋白酶活力比沪酿3.042提高11％。

从成曲曲料的照片可以看出，采用米曲霉ZA138制曲成曲的曲料较为松散，无结块现象(参见图2)。

实施例5

圆盘制曲机制曲

按照常规方法接入米曲霉菌株ZA138，并按常规方法采用圆盘制曲机制曲，按照常规制曲生产过程进行处理，无需另外特别处理。制曲成曲的孢子数和蛋白酶活力检查结果见表4。

表4 圆盘制曲机制曲检测结果

检测项目	ZA138	沪酿3.042
			孢子数(亿/g)	3.4	3.3
蛋白酶活力(U/g)	3537	2834

上述表4的结果显示，米曲霉ZA138制曲成曲中性蛋白酶活力比沪酿3.042提高25％。

因此，在沪酿3.042制曲生产工艺的基础上，米曲霉ZA138完全可以正常生产，并且得到不结块、中性蛋白酶活力高的米曲霉ZA138制曲成曲。

实施例6

发酵豆醅理化指标检测和风味鉴评

采用大豆和小麦粉为原料，按常规方法进行黄豆酱制曲，成曲分别加入1.8倍重量浓度为19％(m/m)的盐水，混匀后进行发酵，发酵结束后对豆醅检测总酸、氨基酸态氮、还原糖和谷氨酸，结果见表5。

表5 发酵豆醅理化指标检测结果

如表5的结果所示，与沪酿3.042相比，米曲霉ZA138发酵得到的豆醅中的总酸、还原糖基本无明显差异，氨基酸态氮含量提升10％以上，谷氨酸含量提高7％以上。

本实施例还召集10名有丰富经验的鉴评人员进行感官鉴评。感官鉴评的评价指标包括鲜味、甜味、酸味、咸味、苦涩味和浓厚感，分值为0～4分，分数越高，该项指标越好。感官鉴评结果总结于表6和图3中。

表6 发酵豆醅感官鉴评结果

菌株	鲜味	甜味	酸味	苦涩味	咸味	浓厚感
							ZA138	3.5	3	3	3	3	4
沪酿3.042	3	3	3	3	3	3

如表6和图3的结果所示，与沪酿3.042相比，米曲霉ZA138发酵得到的豆醅鲜味和浓厚感均有显著改善，对酸味和其他呈味无明显影响，米曲霉ZA138表现出了对发酵豆醅风味改善的有益效果。

实施例7

发酵酱醪理化指标检测和风味鉴评

采用大罐高盐稀态发酵，将本发明米曲霉菌株ZA138的制曲成曲和盐水按一定比例(如1：2)添加混合进行酱油发酵。

检测结果表明，终止发酵时氨基酸态氮达到1.06g/100mL,全氮达到1.78g/100mL，酒精度达到2.0g/100mL，乳酸达到7g/kg，菌落总数为＜1000CFU/mL。

将发酵产物加热配兑成成品酱油并对成品酱油进行感官鉴评。

鉴评结果显示，本实施例中采用米曲霉菌株ZA138所制得的成品酱油在色泽方面红壮、有光泽；在香气方面，酱香和豉香味浓郁；在口感方面，口感丰富、鲜咸协调、醇厚绵长，各项指标明显优于沪酿3.042。

实施例8

制备黄豆酱的收得率比较

采用大豆和小麦粉为原料，按常规方法进行黄豆酱制曲，成曲分别加入1.8倍重量浓度为19％(m/m)的盐水，混匀后进行发酵，发酵结束后计算收得率(应用于产品的豆醅(包括整、碎豆醅)质量/投入的黄豆原料质量)。

在本实施例中，米曲霉菌株ZA138的收得率为2.35，高于沪酿3.042的收得率(2.2)。

实施例9

制备酱油的全氮收得率比较

采用大罐高盐稀态发酵，将本发明米曲霉菌株ZA138的制曲成曲和盐水按一定比例(如1：2)添加混合进行酱油发酵。发酵结束后对原油检测全氮含量，计算全氮收得率(原油全氮含量/投入原料全氮含量)。

在本实施例中，米曲霉菌株ZA138的收得率为80.56％，高于沪酿3.042的收得率(78.02％)。

本文提供的任何和所有实施例或示例性语言的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于实施本发明是必要的。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

Claims (4)

1.一种米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA138，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60181。

2.权利要求1的米曲霉ZA138在制曲中的应用。

3.权利要求2的应用，其中制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。

4.权利要求1的米曲霉ZA138在制备酱油和/或酱中的应用。