CN109938322B - 一株米曲霉za122及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA122。本发明还公开了米曲霉ZA122在制曲中的应用，以及制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。本发明还公开了米曲霉ZA122在制备酱油和/或酱中的应用。利用本发明的米曲霉菌株发酵，所得酱油中肌苷酸含量高，此外，该米曲霉菌株生长速度快、孢子丰富，易于培养，发酵产品抢鲜突出、质量好；在酱油发酵酿造中应用本发明的米曲霉ZA122菌株，在不额外添加鲜味剂的条件下，发酵原油就能保持出色的综合口感，原油品质大幅度提高，由此，米曲霉ZA122菌株在酱及酱油酿造方面具有非常大的生产应用价值，应用前景广阔。

Description

一株米曲霉ZA122及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及米曲霉(Aspergillus oryzae)，具体涉及一株通过诱变技术获得的可提高发酵调味品中肌苷酸含量的米曲霉ZA122，还涉及所述米曲霉在提升发酵调味品风味与品质方面的应用。

背景技术

米曲霉(Aspergillus oryzae)是酱油及黄豆酱等酿造调味品的关键菌种，在制曲过程中米曲霉能够分泌各种大量的糖类水解酶、蛋白水解酶、合成酶、裂解酶、转化酶等酶系，能够将大豆及小麦等原料转换成短肽、氨基酸、单糖、寡糖、有机酸、呈味核苷酸，这些物质是提供发酵产品各种风味的源泉。

目前，我国大部分的酱油生产企业均采用米曲霉沪酿3.042作为酱油生产菌种。沪酿3.042是一株优良的生产菌株，其在制曲过程中分泌各种酶系，如蛋白水解酶系、淀粉水解酶系、纤维素酶、果胶酶、植酸酶等，为后续的发酵奠定了丰富的酶系基础。特别是其拥有丰富的中性蛋白酶，大大提高了发酵所得酱油的氨基酸态氮含量，在一定程度上提升了酱油的品质。

然而，米曲霉沪酿3.042也有不足的方面，其酿造所得的酱油鲜味不够突出，酱油风味不足。为了维持产品良好的鲜味，通常会采用额外添加鲜味剂(谷氨酸钠或呈味核苷酸或酵母抽提物)的方式来提升产品品质，生产出符合消费者口味需求的产品。但是，随着消费者对更高生活品质的追求，饮食健康问题日益受到关注，额外添加鲜味剂不仅增加了生产成本，而且，往往会给消费者留下不良的产品印象，最终影响了产品的竞争力。

目前的研究表明，酱油的鲜味与酱油中的呈鲜物质有关，呈鲜物质主要有鲜味氨基酸，如谷氨酸、天门冬氨酸；鲜味核苷酸，如鸟苷酸、肌苷酸；以及鲜味肽等。它们对酱油口感鲜味的呈现有着非常重要的作用。

鲜味核苷酸对甜味有增效作用，对腥味、焦味、苦味、酸味有消杀作用。对酸、苦味有消杀作用，其机理可能是螯合作用的原因，即由于核苷酸把金属离子从鲜味感觉部位除去，而使谷氨酸钠在味觉神经上有效地作用。而肌苷酸作为鲜味核苷酸的一种，与谷氨酸钠之间有强正相关关系，相对谷氨酸钠而言，酱油中只需含有少量的肌苷酸便可有效提高酱油的鲜味，增强酱油整体风味。

张灵芬等人在《一种高I+G型酵母抽提物酱油的生产工艺研究》中公开了一种通过提高酱油中鸟苷酸和肌苷酸含量从而提升酱油鲜味的方法，该方法将酵母细胞裂解得到含有肌苷酸的酵母抽提物，在酱油调配过程中添加进入酱油中达到提升酱油鲜味的目的。该方法虽能提高酱油中肌苷酸含量，但其主要来源于酵母，对酵母菌体的需求量大，且需要经过裂解、提取等工艺，操作复杂，成本投入高，具有一定局限性。

发明内容

鉴于以上技术的不足，本发明的目的在于提供一株米曲霉菌株，应用该菌株酿造酱油、酱等调味品，不仅能够提高酿造产品中起增鲜作用的肌苷酸含量，而且能够提升酿造调味品的自然鲜度，避免额外添加鲜味剂，降低了生产成本。

为实现本发明的目的，本发明人通过大量的实验和不懈的探索，最终获得了如下技术方案：

在第一个方面，本发明提供了一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA122，已于2018年8月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.NO：60428，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075。

本发明的米曲霉ZA122的菌落特征如下：

该菌株在豆汁培养基上，菌落为圆形，菌丝生长旺盛、孢子丰富，培养初期(2天左右)气生菌丝呈白色，其上附着的分生孢子为浅黄色；随着培养时间的延长，气生菌丝从菌落中心向四周呈辐射状生长，菌落直径变大孢子数量变多，靠近菌落中心的分生孢子由浅黄色转变成黄绿色；在30℃培养7d后菌落直径可达45-60mm，成熟孢子为黄绿色，菌落背面为浅褐色，稍有褶皱。

本发明的米曲霉ZA122，以沪酿3.042为出发菌株，通过公知诱变方法中ARTP进行诱变所获得变异菌株。具体地，本发明所述的米曲霉ZA122菌株的诱变选育方法如下：

(1)以沪酿3.042为出发菌株，通过公知诱变方法之一的ARTP对出发菌株进行诱变获得变异菌株，使用磺胺胍大豆蛋白培养基对变异菌株进行筛选，即以大豆平板上挑选出比出发菌株大、孢子丰富且菌丝生长旺盛的诱变菌株；挑选满足上述筛选条件的菌株进行进一步筛选。

(2)采用与沪酿3.042菌种相同的常规培养方法培养上述挑选出的米曲霉变异种曲，观察米曲霉生长情况，挑选生长速度快，孢子丰富的米曲霉变异菌株种曲，移种于豆汁斜面培养基上进行菌种保藏；将豆汁斜面上的孢子接种到经高压灭菌的三角瓶发酵培养基中进行曲料发酵，发酵结束后检测发酵液中其氨基氮、肌苷酸含量，选取综合能力高的菌株进行进一步的筛选。

(3)将上述筛选出的产氨基氮、肌苷酸含量高的菌株以大豆/脱脂大豆和小麦为原料采用常规方法进行曲池/圆盘制曲，并进行酱油发酵生产小试试验，筛选出一株生长速度快、成曲孢子丰富、产肌苷酸含量最高的菌株，该菌株命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA122，已于2018年8月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC.NO：60428，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075。

为了验证本发明的米曲霉ZA122菌株的稳定性，在一些实施例中，将米曲霉变异菌株在豆汁培养基上连续传代10代。将第1代、第5代、第10代豆汁斜面菌种按照上述方法制作成种曲，观察记录种曲生长情况，并检测种曲的氨基氮、肌苷酸含量。考察各代之间产氨基氮、肌苷酸能力的稳定性，若到第10代还未发生回复突变，则表明菌株遗传稳定性良好。

其中，磺胺胍大豆蛋白培养基的配方为：大豆蛋白1g，麦芽糖2g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸锌1g，氯化钠0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁0.1g，磷酸二氢钾0.1g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1L，pH 6.0～6.5，0.1Mpa、121℃灭菌15min。为避免大豆蛋白与麦芽糖高温灭菌发生美拉德反应，二者分开灭菌，磺胺胍用0.22μm无菌滤膜过滤后，待培养基冷却到50度左右加入，磺胺胍的浓度为100-800mg/L；

三角瓶发酵培养基的配方为：脱脂大豆：小麦＝1:1，润水1.2倍，拌匀后分装入三角瓶，每瓶30g，0.1Mpa、121℃灭菌20min。

为了验证本发明的米曲霉ZA122菌株的效果，在一些实施例中，将米曲霉ZA122菌株以大豆/脱脂大豆和小麦为原料进行圆盘制曲机制曲，制得成曲采用曲池进行高盐稀态发酵，盐水浓度、发酵温度及发酵周期管理按照常规方法进行；发酵结束压榨后所得的酱油中氨基氮含量达到1.09g/100mL以上，谷氨酸含量达到8.65g/L以上，肌苷酸含量达到0.11g/L以上，并且酱油感官色泽红壮，酱香浓郁，抢鲜突出、口感协调。

因此，在一方面，本发明提供所述米曲霉ZA122。

在另一方面，本发明提供所述米曲霉ZA122在食品发酵中的用途。在一个实施方案中，食品发酵为酱和/或酱油发酵。

在一方面，本发明还涉及所述的米曲霉ZA122在制曲中的用途。

在一个实施例方案中，本发明涉及米曲霉ZA122在制曲中的应用，其中制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。

在又一方面，本发明还涉及所述的米曲霉ZA122在制备酱油和/或酱中的用途。

在一方面，本发明提供制备酱和/或酱油的方法，其中将所述米曲霉ZA122用于制备成曲。

在另一方面，本发明所提供的米曲霉的培养方法，其中使用所述米曲霉ZA122作为培养菌株。

在又一方面，本发明涉及制备鲜味剂培养物的方法，其以米曲霉ZA122为发酵菌剂。

综上所述，本发明的有益效果为：

(1)采用本发明提供的米曲霉ZA122菌株发酵，所得酱油中肌苷酸含量高，此外，该菌株生长速度快、孢子丰富，易于培养，发酵产品抢鲜突出、质量好；

(2)在酱油发酵酿造中应用本发明的米曲霉ZA122菌株，在不额外添加鲜味剂(I+G、酵母抽提物等)的条件下，发酵原油就能保持出色的综合口感，原油品质大幅度提升，由此，米曲霉ZA122菌株在酱及酱油酿造方面具有非常大的生产应用价值，应用前景广阔。

附图说明

图1为米曲霉ZA122的获得及应用流程图；

图2为斜面培养所得米曲霉ZA122的照片；

图3为采用米曲霉ZA122发酵的酱油感官鉴评结果图。

具体实施方式

本发明目的之一是提供一株可提高发酵酱油或酱中肌苷酸含量的米曲霉菌株，该菌株可以直接在酱油及酱的酿造过程中产生足量的增鲜物质肌苷酸，提升酱油酿造自然鲜度，不需要额外添加鲜味剂。本发明还提供了上述米曲霉的选育方法。本发明还提供了一种应用上述米曲霉制备高肌苷酸酱油或酱的方法。通过上述技术方案，从根本上解决现有酱油或酱生产菌株发酵所得产品鲜味不足的局限性，提升发酵酱油或酱中助鲜成分的含量，改善和提升口感鲜味，从而提高酱油或酱的品质。

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1米曲霉菌株的诱变

将培养成熟的沪酿3.042菌株的孢子制成孢子悬液，并对孢子悬液进行ARTP诱变。经过ARTP诱变后的孢子悬液按照10倍梯度稀释法，用无菌生理盐水将孢子悬液稀释到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6浓度，制成孢子稀释液。

取0.2ml孢子稀释液涂布于磺胺胍大豆蛋白平板培养基上，并在30℃避光培养7d。在培养过程中观察并记录菌落的生长情况、透明圈形成的快慢、透明圈大小，测量计算圈径比。该过程共观察并记录到146个单菌落，其中菌落生长速度快，圈径比大的菌株39株。

将上述39株菌株转接到不含有磺胺胍大豆蛋白的平板培养基上，并在30℃培养箱中培养7d，在培养过程中观察并记录菌落的生长情况、透明圈形成的快慢、透明圈大小、孢子着生情况。挑选出生长速度快、圈径比大、孢子着生良好的菌株，将上述菌株移种于豆汁斜面培养基中，30℃培养箱培养至成熟后置于4℃冰箱保藏备用。

其中，磺胺胍大豆蛋白培养基的配置方法为：大豆蛋白1g，麦芽糖2g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸锌1g，氯化钠0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁0.1g，磷酸二氢钾0.1g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1L，pH 6.0～6.5，0.1Mpa、121℃灭菌15min；为避免大豆蛋白与麦芽糖高温灭菌发生美拉德反应，二者分开灭菌后再混匀。磺胺胍(sigma)用0.22uμm无菌滤膜过滤后，待培养基冷却到50℃左右计入，磺胺胍的浓度为300mg/L。

实施例2米曲霉曲料制作与发酵

将小麦、脱脂大豆、水按一定比例混合拌匀，分装三角瓶后于121℃灭菌30min，制成固体三角瓶培养基。将实施例1中的米曲霉斜面菌种挑取1环孢子接种于三角瓶培养基中，32℃培养96h至曲料成熟，制得三角瓶曲料。

往三角瓶曲料中加入2倍的盐水进行高盐稀态发酵，于45℃培养箱中分解发酵30d。发酵结束后摇匀过滤，滤液用HPLC法测定肌苷酸含量。获得3株产肌苷酸含量高的菌株，命名为CB122，CB123，CB124。其肌苷酸检测结果如表1所示。

表1三角瓶发酵滤液中肌苷酸检测结果

上述表1的结果显示，与出发菌株沪酿3.042相比，本实施例所得菌株产氨基氮、肌苷酸能力强；并优选氨基氮、肌苷酸收得率最高的米曲霉CB122菌株进行后续实验。

本实施例选育获得的CB122已经由本发明人于2018年8月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA122，保藏编号为GDMCC 60428，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。因此，在本申请中，CB122与ZA122是指同一菌株。

实施例3米曲霉ZA122菌株的遗传稳定性

将实施例2所得米曲霉ZA122菌株在豆汁斜面培养基上连续传代10代，观察并记录各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代斜面种(参见图2)按照实施例2所述的方法进行三角瓶培养与发酵。检测发酵酱油氨基氮含量及肌苷酸含量，判断米曲霉ZA122菌株的遗传稳定性，若十代测定氨基氮、肌苷酸的含量间误差在10％误差范围内，则表明菌株遗传稳定性良好。检测结果如表2所示，表明本发明的米曲霉ZA122菌株遗传稳定性良好。

表2米曲霉ZA122菌株遗传稳定性检测结果

实施例4米曲霉ZA122菌株在酱油生产中的应用

将实施例2所得米曲霉ZA122菌株制作成的种曲接入由黄豆、小麦按一定比例配置而成的曲料中，采用圆盘制曲机制曲，制曲过程为常规方法制曲，无需特别处理，即在沪酿3.042制曲生产工艺的基础上，完全正常生产，得到米曲霉ZA122菌株的圆盘成曲。

圆盘成曲中加入2倍的盐水进行高盐稀态发酵，发酵温度及发酵周期管理按照常规方法进行，共进行3批次的高盐稀态发酵。发酵结束后，将压榨所得的酱油进行氨基氮、谷氨酸、肌苷酸含量检测，检测结果见表3。

表3米曲霉ZA122菌株发酵酱油指标检测

发酵批次	氨基氮(g/100mL)	谷氨酸(g/L)	肌苷酸(g/L)
				第一批	1.09	8.68	0.11
第二批	1.11	8.65	0.12
				第三批	1.09	8.70	0.11
沪酿3.042	1.07	8.62	0.02

结果表明，酱油中氨基氮含量达到1.09g/100mL以上，谷氨酸含量达到8.65g/L以上，肌苷酸含量达到0.11g/L以上。

同时组织有丰富感官鉴评经验的鉴评员10人，对沪酿3.042以及ZA122的发酵原油进行颜色光泽、香气、酸味、咸味、鲜味、综合口感六个方面进行综合分析，鉴评结果如图3所示，与沪酿3.042相比，ZA122的发酵酱油感官色泽红壮有光泽，酱香浓郁，鲜味更突出、综合口感更好。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA122，其已于2018年8月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60428，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼。

2.权利要求1的米曲霉ZA122在食品发酵中的用途。

3.权利要求2所述的用途，其中食品发酵为酱油和/或酱发酵。

4.权利要求1的米曲霉ZA122在制曲中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其中制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。

6.权利要求1的米曲霉ZA122在制备酱油和/或酱中的用途。

7.米曲霉的培养方法，其中使用权利要求1所述的米曲霉ZA122作为培养菌株。

8.制备鲜味剂培养物的方法，其以权利要求1的米曲霉ZA122为发酵菌剂。

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