CN115044486B - 一种米曲霉m01及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株米曲霉M01，其特征是，所述米曲霉保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期2022年3月28日，保藏编号为GDMCC No.62332，其分类学名称为Aspergillus oryzae。本发明还公开米曲霉M01的应用。本发明通过使用米曲霉M01，利用其发酵过程中产生的高活力的谷氨酰胺酶及中性蛋白酶、酸性蛋白酶，达到提高谷氨酸和氨基酸态氮的目的，整体提高酱油的风味；并且米曲霉M01能够最大限度的发挥米曲霉的优良发酵特性，使发酵过程与增鲜过程一体化，显著降低了企业成本。

Description

一种米曲霉M01及其应用

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一种米曲霉M01及其应用。

背景技术

酱油是一种以大豆、小麦、麸皮等为主要原料，经过微生物发酵形成的富含营养价值的调味品。现有的酿造酱油工艺，包括原料蒸煮、制曲、发酵、淋油等步骤；而且酱油的酿造是利用米曲霉菌株分泌的不同水解酶类，将原料中的大分子物质(蛋白质、淀粉质等)分解成呈味的多肽、氨基酸、糖类、磷脂、维生素、有机酸等小分子物质，形成酱油的营养成分，使酱油具有高的营养价值，并赋予酱油具有独特的风味，即咸、酸、鲜、甜、苦五味调和。因此，酿造用的米曲霉菌种对酱油的酿造尤为重要，是酱油酿造的基础，其性能对酱油质量和产能影响甚大。

有研究表明，米曲霉在酱油生产的制曲阶段分泌的酶系种类和活力状况对酱醪发酵成熟的快慢、原料利用率的高低、成品色泽的浓淡以及味道的鲜美与否都有着直接的关系。而在米曲霉生长过程中分泌的众多酶系中，谷氨酰胺酶活性的高低将直接影响到天然酿造原油中谷氨酸的含量，以及影响成品的口感鲜味，进而影响酱油产品的品质。

目前，我国的酱油酿造已广泛使用纯粹培养的米曲霉，常用的米曲霉菌株主要为As3.042和As3.951。上述两种菌株是国内酱油生产厂家普遍使用的优良菌株，其能够产出丰富的蛋白酶水解酶，其中主要以中性和碱性蛋白酶为主；但是这两种菌株产出的其他酶系不足，使得原料中各种成分(如蛋白质原料)不能完全被分解，因而导致酿造酱油风味不足，尤其是产出的谷氨酰胺酶不足导致鲜味不佳。因此，厂家为了保证酱油产品的良好的鲜味，往往会通过额外添加谷氨酸钠等鲜味剂来提高产品品质，生产出符合消费者口味的产品。

此外，所述的米曲霉还有以下缺陷：即产孢子能力强，产孢量较大，会对酱油生产过程产生相当大的影响，一是制曲过程中，在松曲和出曲时，容易出现孢子满天飞的情况，影响生产环境和工作环境；二是由于米曲霉孢子不溶于水，所以产孢量大的大曲吸水时间变长，即与盐水的混合时间会延长，而由于成熟的大曲会产热，因而随着大曲与盐水混合时间的延长，增加了杂菌滋生的隐患。

由于人们随着生活水平的提高，日益关注健康饮食，额外添加这些鲜味剂会给消费者留下不好的印象，另一方面也使得生产成本增加，最终影响了产品的竞争力。所以，通过酿造酱油过程天然获取的鲜味日益受到重视。故设法提高米曲霉在制曲阶段的谷氨酰胺酶活力是高端酱油提高天然鲜味的重要途径。

目前，酱油的优劣通过酱油中氨基酸态氮含量来判断；氨基酸态氮含量是指以氨基酸态氮形式存在的氮元素的含量，它代表了酱油中氨基酸含量的高低。因此，当酱油的氨基酸态氮含量越高，则被认为其质量越好，风味越好。这也使得国内的酱油生产厂家大多致力于追求高氨基酸态氮含量即高氨基酸生成率的酱油，致力于提高酱油的原料利用率，而对酱油鲜味、甜味等风味指标的提高研究的较少。

但实际上氨基酸态氮含量表示的是酱油中各种氨基酸的总含量，并不能表示某一种氨基酸的含量(如谷氨酰胺酶含量)，因此氨基酸态氮含量高不代表酱油的鲜味、甜味等个别风味指标优秀。

本发明主要研究的如何通过改变菌种种类来提高酱油曲中的谷氨酰胺酶活力，进而提高酱油中的谷氨酸含量，达到在原料利用率不变的基础上提高酱油的风味。

发明内容

本发明的目的是提供一种经过诱变选育得到一株能够高产谷氨酰胺酶活力的米曲霉M01，其在保持米曲霉原有高蛋白酶活力的基础上，能够高产谷氨酰胺酶活力；应用该菌株酿造酱油等调味品时，能够进一步提高酱油鲜味和甜味，有效解决酱油的天然鲜味不足的问题。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明提供一株米曲霉M01(Aspergillus oryzae M01)，其分类学名称为Aspergillus oryzae，该菌株于2022年3月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.62332，保藏地址：广东省先烈中路100号大院59号5楼，邮政编码：510075。

应用米曲霉M01发酵的原油风味更佳鲜美，综合口感柔和适口，鲜味突出，风味协调性好，适合用于调味品企业生产零添加高档酱油等产品。

具体地，发明所述的米曲霉M01菌株的诱变选育方法如下：

在现有的菌种中筛选了产孢量少且酸性蛋白酶活力、中性蛋白酶活力高的米曲霉As3.951为出发菌株，采用现有的诱变方法对出发菌株进行诱变获得突变菌落；然后交叉使用酪素平板培养基和豆汁平板培养基对突变菌落进行双平板筛选。即，在酪素平板上挑取与出发菌株As3.951相比具有菌丝粗壮、透明圈大、产孢量少等特点的菌落；在豆汁平板上挑选与出发菌株As3.951相比具有菌丝生长旺盛且周期长、菌丝含量多、菌落产孢略少的菌落；挑选同时满足双平板筛选条件的突变菌株转接豆汁斜面，培养成熟后进行常规菌种保藏，并进一步进行初筛和复筛。

上述双平板的培养基分别是酪素培养基和豆汁培养基。

酪素培养基的配方：干酪素6g、磷酸二氢钾1g、硫酸铵0.5g、硫酸镁0.5g、琼脂粉20g，溶于1L蒸馏水中，调节pH5.0-5.5，121℃灭菌30min；

豆汁培养基的配方：可溶性淀粉20g、磷酸二氢钾1g、磷酸氢二钠0.58g、硫酸镁0.244g、琼脂粉20g，溶于1L蒸馏水中，调节pH5.0-5.5，121℃灭菌30min；

所述初筛的方法为将保藏的菌种由豆汁斜面活化后转接三角瓶培养，观察米曲霉生长情况；挑选菌丝生长旺盛和孢子着生正常的突变菌株，采用常规方法检测其成曲的发芽率和孢子数，优选发芽率高的菌株进行复筛。

所述复筛的方法为按照常规将由生产方法进行小规模的制曲，检测制曲成曲的孢子数、原料利用率、中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力和谷氨酰胺酶活力，优选综合酶活力高的菌株进行生产试用；

生产试用按照常规生产方法进行酱油生产，检测制曲成曲的微检、中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力和谷氨酰胺酶活力，以及发酵酱油的质量，选出综合质量最好的菌株。

所述米曲霉M01菌落特征如下：豆汁平板培养基培养72h，菌落直径在60mm左右，菌落菌丝稠密、略长，稍有孢子，继续培养至96h，少量微黄孢子、稀疏分散，菌落圆型。

本发明人为在保持米曲霉原有高蛋白酶活力的基础上，能够高产谷氨酰胺酶活力，以便解决酱油的天然鲜味不足的问题，采用EMS化学诱变技术和ARTP技术相结合的方法对米曲霉菌株As3.951进行诱变选育，但是，这个诱变选育的过程并不顺利，因为本发明人进行了大量的诱变选育试验后发现，突变的菌株极少能表现出高产谷氨酰胺酶活力的。发明人不得不坚持长期进行所述的诱变选育工作。在历经了长达一年的诱变选育工作后，才成功筛选得到一株符合发明人设计要求的新的米曲霉菌株M01，该菌株具有生长能力强，菌丝生长旺盛的特点，产孢能力较出发菌株稍降低，中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力和谷氨酰胺酶活力都较高，实际效果超出发明人的发明目标，不仅是在保持米曲霉原有的高蛋白酶活力的基础上，能够高产谷氨酰胺酶活力；而且，还能进一步提高蛋白酶活力。由该菌株连续传代10次，并将第1代、第4代、第7代和第10代酪蛋白斜面菌种按照常规方法制作种曲，所得种曲孢子数、中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力、谷氨酰胺酶活力在各代之间稳定性好，直至第10代未显示出回复突变，表明遗传稳定性好。同时，发明人在诱变选育时特意选择菌落产孢略少的菌落进行初筛和复筛，并且在复筛时最终选择产孢量最少的菌株，由此而得的米曲霉M01在制曲时能够有效地减少孢子产量，从而避免在松曲和出曲时孢子满天飞的问题。

本发明提供所述米曲霉M01在制备酱油中的应用。

本发明还提供所述米曲霉M01在酱油发酵中的应用。

本发明还提供所述米曲霉M01在制曲中的应用，所述制曲获得的成曲用于制备酱油。

本发明还提供所述米曲霉M01在酱油增鲜方面的应用。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明以米曲霉As3.951为出发菌株，采用公知诱变方法对出发菌株进行诱变获得突变菌落，交叉使用酪素平板培养基和豆汁平板培养基对突变菌落进行筛选，培养成熟后进行常规保藏及进一步初筛和复筛，其中，复筛按照常规生产方法进行小规模的制曲，通过检测制曲成曲的发芽率、原料消耗率、中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力和谷氨酰胺酶活力，优选综合酶活力高的菌株进行酱油生产试用，检测制曲成曲的微检、中性酶活力、酸性酶活力和谷氨酰胺酶活力，发酵酱油的质量，最终筛选出不仅具有高产谷氨酰胺酶活力，而且还能进一步提高蛋白酶活力且产孢量较小的米曲霉M01菌株。

(2)本发明采用米曲霉M01为主力菌种酿造的原油的谷氨酸含量、氨基酸态氮含量均有显著提高，发酵得到的原油鲜味、甜味突出，无需后期添加鲜味剂来增加酱油鲜味，具有重要的经济意义；而且米曲霉M01还提高了原料利用率，提高了酱油的氨基酸含量。

(3)本发明通过接种米曲霉M01进行酱油酿造，利用其发酵过程中产生的高活力的谷氨酰胺酶及中性蛋白酶、酸性蛋白酶，达到提高谷氨酸和氨基酸态氮的目的，整体提高酱油的风味；并且米曲霉M01能够最大限度的发挥米曲霉的优良发酵特性，使发酵过程与增鲜过程一体化，显著降低了企业人力、物力成本。

具体实施方式

以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。

下文的实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂盒生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。

实施例1：菌株诱变筛选

通过常规的EMS化学诱变技术和ARTP技术对出发菌株米曲霉As3.951进行二次诱变；然后，在酪素平板上挑取与出发菌株As3.951相比具有菌丝粗壮、透明圈大、产孢量少特点的菌落；在豆汁平板培养基上挑选与出发菌株As3.951相比具有菌丝生长旺盛且周期长、菌丝含量多、菌落产孢略少的菌落；获得同时满足双平板筛选条件的突变菌株转接豆汁斜面，培养成熟后进行初筛和复筛。

初筛方法为：将突变菌株由豆汁斜面活化后转接三角瓶培养，观察生长情况，挑选其中菌丝生长旺盛和孢子着生正常的突变菌株，并采用常规方法检测成曲的发芽率和孢子数。

复筛方法为：对初筛获得的10株形状优良的米曲霉菌株，以出发菌株为对照菌株，进行小试制曲和生产发酵筛选。

由于经过实验发现诱变筛选出谷氨酰胺酶活力高的菌株的概率很低，所以发明人在长时间重复性的诱变、初筛和复筛小规模制曲过程中，先抽选出并保藏发芽率、中性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力、谷氨酰胺酶活力较高的菌株，即编号为SY01、SY02、SY03、SY04、SY05、SY06、SY07、SY08、SY09、SY10的菌株，其综合分析结果见下表1；然后将上述的菌株用于进行酱油生产，进行筛选，各项发酵指标分析结果见下表2。

表1菌株复筛制曲质量分析结果

表2菌株复筛发酵质量分析结果

备注：①表1和表2的结果均以对照菌株值为1，其他菌株换算成相应比值。

根据表1和表2的结果，相对于对照菌株及其他突变菌株，菌株SY07用于制曲和发酵有更好的表现；将菌株SY07命名为米曲霉M01，并进行保藏。

如表1的结果所示，选育获得的米曲霉M01菌株具有以下特点：①生长速度与对照菌株相当，孢子量大大减少；②中性蛋白酶活和谷氨酰胺酶活力显著提高，特别是谷氨酰胺酶活力提高57％左右，预期可显著提高发酵原油的理化指标水平。

如表2的结果所示，选育获得的米曲霉M01菌株发酵指标检测结果显示，其具有高产氨基酸、全氮和谷氨酸的优势，其中，谷氨酸比对照菌株高出49％；上述发酵指标有利于改善发酵原油的鲜味，使口感更加丰富，因此选育获得的米曲霉M01菌株相对于对照菌株具有明显优势。

实施例2：米曲霉M01菌株遗传稳定性检测

诱变获得选育菌株高产谷氨酰胺酶活的传代稳定性是关系菌种质量的重要考察指标。现将选育获得的诱变菌株米曲霉M01进行传代，在高、中、低三个温度进行了培养温度与水解圈相关试验，结果见表3。对第0～10代的菌种按照常规方法进行三角瓶培养、制曲和发酵，并分析孢子数、酶活力、氨基酸态氮等指标，结果见表4。

表3米曲霉M01在不同温度条件下在酪蛋白培养基上传代稳定性分析

表4米曲霉M01传代稳定性的三角瓶种、成曲和发酵天然油质量分析

如表3和表4所示，通过10代传代试验分析了米曲霉M01菌株在28℃、32℃、36℃三个温度下的稳定性，菌落直径和K值的结果显示，该米曲霉M01菌株在菌落形态和蛋白酶分泌方面表现出了良好的稳定性，符合生产使用需求。在该菌株传代试验中，每代菌种制作三角瓶种、制得的大曲及发酵天然油的质量分析结果可知，该菌株酿造酱油的发酵能力稳定，合适生产需要。

实施例3：米曲霉M01菌株在酱油酿造中的应用

以单个65m3发酵罐为单位进行高产率游离谷氨酸米曲霉效果的验证试验，将选育到的米曲霉M01菌株和对照菌株分别制曲，成熟大曲按照一定比例进行制醪，然后发酵天然油，送检天然油的游离谷氨酸含量，并对过程中的三角瓶种、成曲和发酵天然油进行质量分析，结果见表5和表6。

表5选育菌株酿造大曲谷氨酰胺酶活力及水黄游离谷氨酸

表6米曲霉M01和对照菌株的三角瓶种、成曲和发酵天然油质量分析

如表5和表6的结果所示，米曲霉M01的产孢能力和孢子发芽能力与对照菌株相当，而产中性蛋白酶和酸性蛋白酶能力则有所提高，谷氨酰胺酶活力显著高于对照菌株，谷氨酰胺酶活力相对提升约60％；采用该菌株酿造的天然油，氨基酸态氮及原料利用率均有所提高，分别提高约22％和14％，谷氨酸含量也显著提高，提高约80％，因此，选育获得的米曲霉M01菌株发酵生产的原油鲜味更好。

实施例4：对米曲霉M01菌株酿造的酱油的感官鉴评

针对实施例3发酵得到的酱油，本实施例召集10名有丰富经验的鉴评人员进行感官鉴评，感官鉴评的评价指标包括体态、色泽、香气、鲜味、甜味、苦涩味、咸味、酸味和综合口感，分值为0-4分，分数越高，该项指标越好，感官鉴评结果如表7所示

表7菌株米曲霉M01发酵酱油感官鉴评结果

菌株	体态	色泽	香气	鲜味	甜味	苦涩味	咸味	酸味	综合口感
										M01	3.17	3.14	3.08	3.35	3.15	2.95	3.03	3.06	3.21
对照菌株	3.16	3.09	3.03	3.08	3.10	3.01	3.04	3.05	3.02

表7感官鉴评结果显示，米曲霉M01菌株发酵的酱油的鲜味、甜味尤为突出，明显优于生产对照菌株，亦因此突出的鲜、甜味对咸味、苦涩味具有一定的掩盖作用，所以米曲霉M01菌株发酵的酱油的咸、酸、鲜、甜、苦五味更为调和，综合口感也更具有优势。

实施例5：米曲霉M01菌株的产谷氨酸能力检测

将米曲霉M01菌株，与从商业途径获得的酿造酱油用的米曲霉菌株相比较，对比不同菌株用于制备酱油时的产氨基酸、全氮和谷氨酸的能力，结果见表8。

表8不同菌株的三角瓶种、成曲和发酵天然油质量分析

由表8可知，上述米曲霉As 3.042、CICC160、CICC188，与本发明选育得到的米曲霉M01相比较，米曲霉M01制得大曲的谷氨酰胺酶活力远高于其他大曲，天然油的谷氨酸含量显而易见地是最高的；由该结果可知，米曲霉M01菌株的产谷氨酰胺酶的能力远远高于其它菌株，产谷氨酸和氨基酸态氮能力也高于其它菌株。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一株米曲霉(Aspergillus oryzae)M01，其特征是，所述米曲霉M01保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期2022年3月28日，保藏编号为GDMCC No.62332。

2.权利要求1所述的米曲霉M01在制备酱油中的应用。

3.权利要求1所述的米曲霉M01在酱油发酵中的应用。

4.权利要求1所述的米曲霉M01在制曲中的应用，所述制曲获得的成曲用于制备酱油。

5.权利要求1所述的米曲霉M01在酱油增鲜方面的应用。