CN115340956B - 一株米曲霉za179及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体公开了一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179及其应用。本发明的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179具有高酒石酸代谢能力以及高产谷氨酸等特性，在菌种酿造应用中，由于原料中酒石酸被米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179消耗，使得酱油原油中酒石酸含量得到有效调控，酱油原油的酸涩味得到明显改善。同时在整体氨基酸收得率略有提升的情况下，谷氨酸含量增加，鲜味突出，口感更加协调且丰富持久。

Description

一株米曲霉ZA179及其应用
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其是涉及一株米曲霉ZA179及其应用。
背景技术
酒石酸存在多种高等植物中，如葡萄、罗望子中，是植物的重要有机酸之一。在工业应用上因其酸性强、较为爽口，酸味约为柠檬酸的1.3倍，酸味阈值为292μmol/L(约为0.044g/L)，被常用作食品酸度调节剂。同时由于酒石酸具有苦涩味，在葡萄酒等酿造行业中会降低其含量从而改善苦涩口感。酒石酸属于发酵酱油中的一种酸性较强的不挥发性有机酸，其主要来源于酿造酱油的原料。酒石酸在脱脂后豆粕中的萃取液中可占总有机酸的5％，少部分是由曲霉等微生物分泌。而酱油的酿造原料为大豆和炒小麦，其原油的酒石酸含量能达到2g/L(相对于阈值2/0.044＝45.5倍)，远高于苹果酸、柠檬酸等有机酸，显著增强了酱油的酸涩感。
目前中国酱油业主要采用沪酿3.042米曲霉制曲，该米曲霉菌株对酒石酸的代谢转化效率并不高，不能充分的将酒石酸转化为琥珀酸进行多种物质的代谢，使得发酵酱油具有明显地苦涩口感。因此基于现有发酵工艺体系下有针对性的改造米曲霉菌株特性对于酱油品质及风味的提升具有重要作用。
因此，亟需选育出一株具有高酒石酸代谢能力的米曲霉菌株，使得该菌株发酵原油在整体氨基酸收得率略有提升的情况下，苦涩感降低，口感更协调且丰富持久。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179及其应用。本发明筛选获得的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179具有消耗发酵原料中酒石酸含量的优点，降低酱油原油中酒石酸的残留量，有助于改善酱油原油的苦涩口感。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一目的，本发明提供了一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179，其于2021年5月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：61668，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明围绕酿造酱油降涩提味，选育出一株具有高酒石酸代谢能力以及高产谷氨酸的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179，在菌种选育及应用中，由于原料中酒石酸被米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179消耗，使得酱油原油中酒石酸得到有效调控，酱油原油的酸涩味得到明显改善。同时酒石酸含量的降低，进一步使得整体米曲霉菌株的发酵体系的有机酸含量降低，发酵酱油原油的pH提升了0.1-0.2，使得米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179的酶解效果得到有效加强，氨基氮及谷氨酸也得到了提升，氨基氮提升了2％，谷氨酸提升了10％，因此，本发明筛选出的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179既达到降低原油酸涩味的目标，又达到了提升酱油原油鲜味及氨氮收得率等效果，使得发酵的产品风味特殊、鲜味突出，口感更加协调且丰富持久。
优选地，所述米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179以沪酿3.042为出发菌株，对出发菌株进行诱变，并涂布于大豆蛋白平板培养基上筛选获得。
优选地，对出发菌株采用ARTP(常压室温等离子体)诱变，诱变的方式不仅限于此，本发明所提到的诱变方式包含了公知的诱变方式。
本发明基于现有发酵工艺体系下有针对性的改造米曲霉菌株特性，对于酱油品质及风味的提升具有重要作用。经过诱变选育，获得一株具有高酒石酸代谢能力以及高产谷氨酸的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179，将该米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179应用于调味品发酵中，使得可以达到降低酱油原油酸涩味的效果，风味较佳，丰富持久。
作为本发明所述米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179的优选实施方式，所述大豆蛋白平板培养基包括以下组分：
大豆蛋白、麦芽糖、磷酸氢二钾、七水硫酸锌、氯化钠、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、磷酸二氢钾、琼脂粉和蒸馏水，所述大豆蛋白平板培养基的pH为6.0～6.5。
优选地，所述大豆蛋白平板培养基包括以下重量的组分：
大豆蛋白1g、麦芽糖2g、磷酸氢二钾1g、七水硫酸锌1g、氯化钠0.5g、七水硫酸镁0.5g、七水硫酸亚铁0.1g、磷酸二氢钾0.1g、琼脂粉15g～20g和蒸馏水1L，pH6.0～6.5。将米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179接种于大豆蛋白平板培养基，有利于米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179的生长。
更优选地，米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179的筛选方法，包括以下步骤：
1)以米曲霉沪酿3.042为出发菌株，对出发菌株进行诱变，并涂布于大豆蛋白平板培养基上获得米曲霉变异菌株；
2)采用与沪酿3.042菌种相同的常规培养方法培养上述挑选出的米曲霉变异菌株种曲，观察米曲霉生长情况，挑选生长速度快，孢子丰富的米曲霉变异菌株种曲，移种于豆汁斜面培养基上进行菌种保藏；将豆汁斜面上的孢子接种到经高压灭菌的三角瓶发酵培养基中进行曲料发酵，发酵结束后检测发酵液中其酒石酸、谷氨酸和氨基氮含量，选取综合能力高的菌株进行进一步的筛选；
3)将上述筛选出的高氨基氮、高谷氨酸及酒石酸含量低的菌株以大豆/脱脂大豆和小麦为原料采用常规方法进行曲池/圆盘制曲，并进行酱油发酵生产小试试验，筛选出一株生长速度快、成曲孢子丰富、产酒石酸含量最低的菌株，获得米曲霉(Aspergillusoryzae)ZA179。
优选地，三角瓶发酵培养基的配方为：脱脂大豆：小麦＝6:4，总原料润水1.2倍，拌匀后分装入三角瓶，每瓶30g，0.1Mpa、121℃灭菌20min。
为了验证本发明的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179的稳定性，在一些实施例中，将米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179在豆汁培养基上连续传代10代。将第1代、第5代、第10代豆汁斜面菌种按照上述方法制作成种曲，观察记录种曲生长情况，并检测种曲的酒石酸、谷氨酸含量。考察各代之间酒石酸代谢能力及谷氨酸能力的稳定性，若到第10代还未发生回复突变，则表明菌株遗传稳定性良好。
第二目的，本发明提供了上述米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179在调味品发酵中的应用。
将本发明筛选得到的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179应用于调味品发酵过程中，不仅降低了发酵原油中酒石酸的含量，使得酱油的苦涩感降低，同时在整体氨基酸收得率略有提升的情况下，谷氨酸含量增加，鲜味突出，口感更加协调且丰富持久。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述调味品为酱油或酱。
第三目的，本发明提供了上述米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179在酱油或酱固态发酵过程中增加酒石酸代谢消耗的用途。
本发明的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179具有消耗发酵原料中酒石酸含量等特点，使得所得的酱油原油中具有低含量的酒石酸，且氨基氮和谷氨酸含量均有所提升，可显著地降低酱油原油的苦涩口感，酱油原油的风味特殊、鲜味突出，口感更加协调且丰富持久。此外该菌株生长速度快，易于培养，在整体氨基酸收得率略有提升的情况下，谷氨酸含量增加，发酵产品风味特殊、鲜味突出，口感更加协调且丰富持久。每一代低产酒石酸的酱油酿造菌株在发酵生成的原油中酒石酸及氨基氮含量波动范围不超过5％，表现出较高的发酵稳定性。
第四目的，本发明提供了上述米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179在制曲中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述制曲获得的成曲用于制备酱油或酱。
第五目的，本发明提供了一种酱油的制备方法，包括以下步骤：
i)往制曲原料中接种如权利要求1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179；
ii)对ⅰ)中所得酱醪继续发酵至60天；
iii)对ⅱ)中所得发酵酱醪压榨、过滤、灭菌获得酱油原油。
作为本发明所述酱油的制备方法的优选实施方式，所述步骤ii)中，发酵的方式为高盐稀态发酵。
第六目的，本发明提供了一种采用上述酱油的制备方法获得的酱油。
采用本发明筛选出来的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179发酵的酱油中具有低含量的酒石酸，氨基氮和谷氨酸含量高，并且酱油感官色泽红壮，酱香浓郁，鲜味突出、口感协调且丰富持久。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明筛选出一株具有高酒石酸代谢能力以及高产谷氨酸的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179，在菌种酿造应用中，由于原料中酒石酸被米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179消耗，使得酱油原油中酒石酸含量得到有效调控，酱油原油的酸涩味得到明显改善。同时酒石酸含量的降低，进一步使得整体米曲霉菌株的发酵体系的有机酸含量降低，发酵酱油原油的pH提升了0.1-0.2，使得米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179的酶解效果得到有效加强，氨基氮及谷氨酸也得到了提升，因此，本发明筛选出的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179既达到降低酱油原油酸涩味的目标，同时在整体氨基酸收得率略有提升的情况下，谷氨酸含量增加，鲜味突出，口感更加协调且丰富持久。
附图说明
图1为本实施例米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179的筛选步骤流程图；
图2为本实施例米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179的生长形态图；
图3为采用本实施例米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179发酵的酱油感官鉴评结果图。
具体实施方式
为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。
除非特别说明，否则本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，否则本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。除非特别说明，否则本发明实施例所用试剂均为市购。下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179的诱变筛选
(1)将培养成熟的沪酿3.042菌株的孢子制成孢子悬液，并对孢子悬液进行ARTP诱变。吸取20μl孢子悬液，均匀涂抹在无菌载物铁片上，将铁片置于常压室温等离子体(ARTP)诱变仪载物台上，用高纯氦气等离子体诱变处理40s。诱变参数为：电源功率100W，氦气流量10L/min，照射距离2mm。ARTP诱变处理后，将铁片转移至装有1mL生理盐水的EP管中，震荡洗脱孢子。
(2)经过ARTP诱变后的孢子悬液按照10倍梯度稀释法，用无菌生理盐水将孢子悬液稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6浓度，制成孢子稀释液。
(3)将所述孢子稀释液涂布到大豆蛋白培养基(该培养基的配置方法为：大豆蛋白1g，麦芽糖2g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸锌1g，氯化钠0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁0.1g，磷酸二氢钾0.1g，琼脂粉15g-20g，蒸馏水1L，pH6.0～6.5，0.1Mpa、121℃灭菌15min，为避免大豆蛋白与麦芽糖高温灭菌发生美拉德反应，二者分开灭菌后再混匀)，30℃避光培养。
(4)挑选出生长速度快、孢子着生良好的菌株，移种于豆汁斜面培养基(培养基配方：KH2PO4 1g，MgSO4 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂粉20g，豆汁1000mL，自然pH)中，30℃培养箱培养至成熟后置于4℃冰箱保藏备用。
实施例2、米曲霉曲料制作与发酵
将小麦、脱脂大豆、水按体积比为4:6:12混合拌匀，分装三角瓶后于121℃灭菌30min，制成固体三角瓶培养基。将实施例1步骤(4)中的米曲霉斜面菌种挑取1环孢子接种于三角瓶培养基中，32℃培养96h至成熟，制得三角瓶曲料。
往三角瓶曲料中加入2倍的盐水进行高盐稀态发酵，于30℃培养箱中分解发酵60d。发酵结束后摇匀过滤，滤液用HPLC法测定酒石酸、谷氨酸含量，氨基酸态氮使用滴定法。获得3株发酵原油酒石酸含量低的菌株，命名为TQ0001、TQ0002、TQ0003。其酒石酸、谷氨酸、氨基酸态氮结果如表1所示。
表1三角瓶发酵滤液中酒石酸含量检测
菌株 酒石酸 谷氨酸 氨基酸态氮
沪酿3.042 1.00 1.00 1.00
TQ0001 0.65 1.07 1.01
TQ0002 0.63 1.09 1.01
TQ0003 0.58 1.12 1.02
备注：①以出发菌株沪酿3.042各项指标为1.00，其他诱变菌株换算成相应比值；
②表中菌株TQ0003即本发明人进行保藏的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179。
米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179的保藏信息为：
米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179于2021年5月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：61668，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
如表1的结果所示，选育获得的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179发酵指标检测结果显示，其具有高氨基酸态氮含量，其谷氨酸含量相比于沪酿3.042提高了12％，酒石酸含量比沪酿3.042降低了42％。上述发酵指标表明米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179不仅能够降低发酵原油的苦涩口感，同时对鲜味具有显著提升效果，因此，本发明选育获得的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179较沪酿3.042在降低发酵原油的苦涩口感和提升鲜味方面具有明显优势。米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179的生长速度快，易于培养，在整体氨基酸收得率略有提升的情况下，谷氨酸含量增加，发酵产品风味特殊、鲜味突出，口感更加协调且丰富持久。
本实施例米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179的筛选步骤流程如图1所示。
本实施例选育获得的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179在大豆蛋白平板培养基(配方如实施例1所示)上的生长形态如图2所示。
实施例3、米曲霉(Aspergillus oryzae) ZA179菌株的遗传稳定性实验
将实施例2选育获得的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179在豆汁斜面培养基上连续传代10代，观察并记录各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代斜面菌种按照实施例2所述的方法进行三角瓶培养与发酵。检测发酵酱油酒石酸及谷氨酸含量，判断米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179菌株的遗传稳定性，若十代测定酒石酸及谷氨酸的含量间误差在10％误差范围内，则表明菌株遗传稳定性良好。检测结果如表2所示，表明本发明的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179菌株遗传稳定性良好。
表2米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179菌株遗传稳定性检测结果
传代数 酒石酸 谷氨酸
沪酿3.042 1.00 1.00
ZA179第1代 0.58 1.12
ZA179第5代 0.61 1.09
ZA179第10代 0.58 1.12
备注：以出发菌株沪酿3.042各项指标为1.00，诱变的米曲霉(Aspergillusoryzae)ZA179换算成相应比值。
如表2所示，通过10代传代实验分析了米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179菌株在谷氨酸和酒石酸方面表现出了良好的稳定性，符合生产使用需求。
实施例4、米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179菌株在酱油生产中的应用
将实施例2所得米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179菌株制作成的种曲接入由黄豆、小麦按质量比为7:3配置而成的曲料中，采用圆盘制曲机制曲，制曲过程为常规方法制曲，无需特别处理，即在沪酿3.042制曲生产工艺的基础上，完全正常生产，得到3批次米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179菌株的圆盘成曲。
圆盘成曲中加入2倍的盐水进行高盐稀态发酵，发酵温度及发酵周期管理按照常规方法进行，共进行3批次的高盐稀态发酵。发酵结束后，将压榨所得的酱油进行酒石酸、谷氨酸、氨基氮含量检测，检测结果见表3。
表3米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179菌株制曲成曲及发酵酱油指标检测
菌株 酒石酸 谷氨酸 氨基酸态氮
沪酿3.042 1.00 1.00 1.00
第一批 0.61 1.13 1.02
第二批 0.66 1.11 1.01
第三批 0.60 1.15 1.03
备注：以出发菌株沪酿3.042各项指标为1.00，诱变的米曲霉(Aspergillusoryzae)ZA179换算成相应比值。
从表3的结果可知，米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179发酵酱油的酒石酸含量较低，相比于沪酿3.042，下降了40％以上，而氨基氮和谷氨酸含量得到了提升，氨基氮提升了1％以上，谷氨酸提升了10％以上。将米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179添加至酱油发酵中，可以显著地降低酱油原油的苦涩口感，同时在整体氨基酸收得率略有提升的情况下，谷氨酸含量大大提升，发酵的酱油风味特殊、鲜味突出，口感更加协调且丰富持久。
本实施例还召集10名有丰富经验的鉴评人员进行综合感官鉴评(每项评价指标取平均值)。感官鉴评的评价指标包括鲜味、甜味、酸味、咸味、苦涩味和浓厚感，分值为0～4分，分数越高，该项指标越好。感官鉴评结果总结于表4中和图3中。
表4米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179菌株发酵酱油感官鉴评结果
Figure BDA0003847669530000091
注：感官评分0～4分，分值越高表示不同味感的感官越强烈。对于鲜味、甜味、浓厚味，分值越高表示感官越好；对于酸味、咸味、苦涩味，分值越低感官越好。酱油是一个多味型协调的调味品，因此每个味道基本都在2分以上。
从表4的结果可知，与沪酿3.042相比，米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179的发酵酱油感官色泽红壮有光泽，酱香浓郁，苦涩味较淡，鲜味更突出、综合口感更好。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一株米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179，其于2021年5月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：61668，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.如权利要求1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179在调味品发酵中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述调味品为酱油或酱。
4.如权利要求1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179在酱油或酱固态发酵过程中增加酒石酸代谢消耗的用途。
5.如权利要求1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179在制曲中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述制曲获得的成曲用于制备酱油或酱。
7.一种酱油的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
i)往制曲原料中接种如权利要求1所述的米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA179；
ii)对ⅰ)中所得酱醪继续发酵至60天；
iii)对ⅱ)中所得发酵酱醪压榨、过滤、灭菌，获得酱油原油。
8.如权利要求7所述的酱油的制备方法，其特征在于，所述步骤ii)中，发酵的方式为高盐稀态发酵。
9.一种酱油，其特征在于，所述酱油采用如权利要求7或8所述的制备方法制备。
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