CN117157385A

CN117157385A - 一株米曲霉za205及其应用

Info

Publication number: CN117157385A
Application number: CN202180096180.6A
Authority: CN
Inventors: 周斌; 周其洋; 童星; 王静
Original assignee: Foshan Haitian Flavoring and Food Co Ltd; Foshan Haitian Gaoming Flavoring and Food Co Ltd; Guangdong Haitian Innovation Technology Co Ltd
Current assignee: Foshan Haitian Flavoring and Food Co Ltd; Foshan Haitian Gaoming Flavoring and Food Co Ltd; Guangdong Haitian Innovation Technology Co Ltd
Priority date: 2021-07-16
Filing date: 2021-07-16
Publication date: 2023-12-01
Also published as: WO2023283937A1

Abstract

本发明涉及一株米曲霉ZA205及其应用。该米曲霉ZA205同时具有：(1)显著提高的谷氨酰胺酶活力；(2)显著提高的谷氨酰胺酶耐盐性；(3)曲料pH更接近中性；(4)较高的中性蛋白酶活力。

Description

一株米曲霉ZA205及其应用

技术领域

本发明涉及食品加工及微生物发酵技术领域。具体而言，本发明涉及一株米曲霉，以及其在酱油及酱酿造中的应用。

背景技术

米曲霉是传统酿造食品行业核心菌种。米曲霉在发酵过程中能够分泌蛋白水解酶和糖类水解酶，这些酶将大豆和小麦等原料降解成短肽、氨基酸、寡糖、单糖等小分子物质，这些小分子物质是构成产品风味的源泉。

对于酱油及酱类产品来说，鲜味是其关键的味道组成。鲜味主要来源于大豆、小麦蛋白经酶解之后形成的氨基酸、多肽类物质。谷氨酸是呈现鲜味的主要氨基酸。大豆蛋白中含有约16％谷氨酸，约46％的谷氨酸是以谷氨酰胺的形式存在。谷氨酰胺本身不具有鲜味，只有当其被谷氨酰胺酶酶解转化为谷氨酸后，才能充分发挥鲜味功能。

在调味品行业使用最为广泛的是米曲霉沪酿3.042(也称米曲霉As3.951)，该菌株特性主要是生长速度快、抗杂性好、产孢丰富、且制曲分泌的主要酶系-中性蛋白酶活力高，但制曲pH较低，同时谷氨酰胺酶活力不高。对于谷氨酰胺酶的不足，主要体现在两点：一是分泌量不够，二是耐盐性不强。

相关技术记载了一些改进的米曲霉，比如提高了米曲霉的谷氨酰胺酶酶活力，但是在谷氨酰胺酶酶活获得提升的同时，菌株的其他性能没有获得显著提升，甚至明显下降。

发明内容

发明人认识到，耐盐性却是谷氨酰胺酶能否在高盐发酵食品中充分发挥作用的关键影响因素。因此提高米曲霉谷氨酰胺酶的耐盐性，对提升酱油及发酵酱中谷氨酸含量有巨大帮助。

发明人还认识到，谷氨酰胺酶能将原料中的谷氨酰胺分解为谷氨酸和氨；氨越多，制曲pH就越高。同时制曲pH越高，也能进一步促进谷氨酰胺酶分泌，因此谷氨酰胺酶与制曲pH有极强关联性。

发明人还认识到酱油的酸味是以风味柔和的有机酸为主，酱油乳酸菌在酱醪增殖后，将糖类转换成有机酸，同时将原料中的有机酸转化成其他有机酸，其中乳酸是风味柔和有机酸的代表，其不仅是酱油中的呈味成分，使得酱油强烈盐味变得柔和，也关乎到酱油的香气。然而过量的柠檬酸含量是导致酱油刺激口感的重要来源，乳酸菌将柠檬酸转化的最适pH值环境为7左右，因此发酵曲料pH越是偏向于中性，越有助于乳酸菌将酸爽刺激的柠檬酸转化成风味柔和的乳酸等有机酸，进一步提高酱油风味。

为了实现上述目的，本发明提供米曲霉ZA205，其同时具有如下多项有益性能：

(1)显著提高的谷氨酰胺酶耐盐性；

(2)显著提高的谷氨酰胺酶活力；

(3)曲料pH更接近中性；

(4)较高的中性蛋白酶活力。

由于本发明米曲霉同时具有上述多项有益性能，这些有益性能协同作用，是基于该米曲霉获得的发酵食品具有显著改善的理化指标和显著提高的感官评价。

米曲霉ZA205是以米曲霉As3.951(沪酿3.042)为出发菌株，经诱变选育获得。为了筛选获得高制曲pH、高产、耐盐谷氨酰胺酶的菌株，在筛选培养基中加入L-谷氨酰胺作为谷氨酰胺酶的分解底物、酚红作为酸碱指示剂，加入4％的NaCl作为耐盐特性筛选筛子。谷氨酰胺酶分解底物L-谷氨酰胺产生碱性氨，可提高培养基的pH，或米曲霉自身的特性发生改变，碱性物质增多，培养基的pH得到提升；酚红感受pH变化，pH越碱，酚红颜色越深。同步分泌的谷氨酰胺酶耐盐性越好，酚红颜色变化越快。通过酚红的颜色变化快慢及深浅，就能从中筛选出高产及耐盐谷氨酰胺酶的菌株。

在一些方面，本公开提供米曲霉ZA205(Aspergillus oryzae ZA205)，该菌株于2021年05月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：61669，保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼。

在一些方面，本公开提供米曲霉ZA205在制曲中的用途。

在一些实施方案中，对于上述用途，其中制曲获得的曲料用于制备酱油。

在一些方面，本公开提供米曲霉ZA205在制备发酵食品中的用途；

在一些实施方案中，所述发酵食品是对含豆和/或谷的原料发酵获得的发酵食品。

在一些实施方案中，所述发酵食品是酱或酱油。

在一些方面，本公开提供一种曲料，其由上述的米曲霉ZA205制备获得；

在一些实施方案中，所述曲料是将蛋白质原料和/或淀粉质原料与米曲霉ZA205混合制曲获得。

在一些实施方案中，蛋白质原料是包括：黄豆、黑豆、蚕豆等一种或多种。在一个实施方案中，黄豆是大豆，学名：Glycine max(Linn.)Merr.)。在一个实施方案中，大豆是脱脂大豆、豆粕等一种或多种。在一些实施方案中，淀粉质原料包括小麦、小麦粉、麦麸等一种或多种。

在一些方面，本公开提供一种发酵食品，其由上述任一项的曲料制备获得。

在一些实施方案中，所述发酵食品是酱或酱油。

在一些方面，本公开提供一种制备曲料的方法，其包括将上述的米曲霉ZA205接种到含豆和/或谷的原料中并进行培养。

在一些方面，本公开提供一种制备酱油或酱的方法，其包括制曲和发酵的步骤，其中，所述制曲包括将上述的米曲霉ZA205接种到含豆和/或谷的原料中并进行培养。

在一些实施方案中，使用高盐稀态发酵法进行所述发酵。

在一些方面，本公开提供一种用于筛选菌株的培养基，含有：

L-谷氨酰胺；

酸碱指示剂(例如酚红)；和

NaCl；

可选地，所述培养基还含有菌株生长所需营养成分。

在一些实施方案中，菌株生长所需营养成分例如选自：氮源、碳源、磷源、菌株生长所需微量元素、或其组合。

在一些实施方案中，L-谷氨酰胺的百分含量为0.5％-2％。

在一些实施方案中，酸碱指示剂的百分含量为0.01‰-0.5‰。

在一些实施方案中，NaCl的百分含量为2％-5％。

在一些方面，本公开提供一种筛选米曲霉的方法，包括

-将多个米曲菌接种于权利要求10所述的培养基；

-比较所述多个米曲菌附近培养基的颜色变化程度和/或速度；

-根据比较结果筛选米曲霉。

术语说明：

曲料(koji)是指混有米曲霉的含豆或谷类原料培养若干天后的产物。含豆原料的表面覆盖着米曲霉，它含有各种酶，大大促进了稀态醪糟发酵和成熟过程。

“高盐稀态法”(high-Salt and diluted state fermentaion)例如可以参照“高盐稀态发酵酱油酿造工艺规程SB/T 10312-1999”

“酱油”(soy sauce)例如可以参照“GB 2717-2018食品安全国家标准酱油”或“GB/T 18186-2000酿造酱油”。

“酱”可以是豆酱(soybean paste)或面酱(wheat paste)，例如可以参照“GB/T 24399-2009黄豆酱”或SB/T 10296-2009甜面酱。

“干基”:曲料在105℃烘箱条件下，进行水分烘干，直至水分保持恒定不变的物料。

除非特别说明，％是指重量％。

在任一实施方案中，“包含”“包括”“含有”可以是指含量大于零，例如1％以上，例如10％以上，例如20％以上，例如30％以上，例如40％以上，例如50％以上，例如60％以上，例如70％以上，例如80％以上，例如90％以上，例如100％。当含量为100％时，“包含”“包括”“含有”的含义相当于“由…构成”。

有益效果

本公开一项或多项技术方案具有以下一项或多项有益效果：

(1)显著提高的谷氨酰胺酶耐盐性；

(2)显著提高的谷氨酰胺酶活力；

(3)曲料pH更接近中性；

(4)较高的中性蛋白酶活力。

附图说明

图1示出米曲霉ZA205在豆汁培养基培养96h后的菌落特征。

图2示出米曲霉ZA205、As3.951和GM195在5％NaCl溶液中谷氨酰胺酶活力相对保持率随时间变化曲线；

图3示出米曲霉ZA205、As3.951和GM195在10％NaCl溶液中谷氨酰胺酶活力相对保持率随时间变化曲线；

图4示出米曲霉ZA205、As3.951和GM195在17％NaCl溶液中谷氨酰胺酶活力相对保持率随时间变化曲线。

关于生物材料保藏的说明

本发明涉及下列已在广东省微生物菌种保藏中心进行保藏的生物材料：

米曲霉ZA205(Aspergillus oryzae ZA205)，该菌株于2021年05月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：61669，保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用药品或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例使用的沪酿3.042(也称米曲霉As3.951)海天公司保藏。

以下实施例使用的L-谷氨酰胺:纯度>99％，美国西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)生产；谷氨酸检测试剂盒:德国拜发公司(R-Biopharm)生产；其他试剂:均为分析纯，采用去离子水配制。

以下实施例中，蛋白酶活力的测定根据SB/T 10317-1999中的方法进行测定。

以下实施例中，谷氨酰胺酶活测定方法如下：采用在40℃，pH值为7.2的条件下，每1g酱油曲中的谷氨酰胺酶每1min催化L-谷氨酰胺分解生成1μmol L-谷氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g表示。L-谷氨酸采用德国拜发公司(R-Biopharm)的谷氨酸检测试剂盒进行检测。

以下实施例中，全氮测定参照GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定；氨基酸态氮(简称氨基氮或AAN)和总酸采用GB/T 5009.39-2003酱油卫生标准的分析方法中的电位滴定仪方法测定。

图1示出本发明米曲霉ZA205在豆汁培养基培养96h后的菌落照片。其菌落特征如下：菌落直径达58mm，菌丝丰富，孢子丰富、色泽黄绿色。

本发明的米曲霉ZA205菌株的诱变选育方法如下：

1.1初筛和复筛

以米曲霉As3.951为出发菌株，采用常压室温等离子体(ARTP)进行诱变，诱变条件如下：诱变功率120W，气流量为10L/min，诱变时间为120s。将诱变后的孢子均匀涂布到高盐酚红显色培养基(L-谷氨酰胺10g，酵母浸膏5g，K ₂HPO ₄ 1g，KH ₂PO ₄ 0.1g，MgSO ₄ 0.5g，酚红0.015g，NaCl 40g，琼脂20g，加入去离子水溶解后，定容到1000mL，于115℃灭菌20min)，培养2-3天后，挑选生长快、颜色变化快、色泽深的菌落作为初筛菌株。将初筛菌株接种到酚红显色平板培养基进行复筛，获得6株复筛菌株，GM191，GM192，GM193，GM194，GM195，ZA205。将获得复筛菌株转接到豆汁斜面培养基(KH ₂PO ₄ 1g，MgSO ₄ 0.5g，(NH ₄) ₂SO ₄ 0.5g，可溶性淀粉20g，琼脂20g，豆汁1000mL，于115℃灭菌20min)，培养成熟后进行常规保藏。

1.2三角瓶曲料-酶活力分析

提供非转基因大豆和小麦的混合物(质量比，大豆:小麦＝1:1)，润水1.2倍，混合拌匀，分装至三角瓶，121℃灭菌30min，制成三角瓶发酵培养基。从1.1中的米曲霉菌种挑取1环孢子，接种于三角瓶发酵培养基中，32℃培养96h，制得三角瓶曲料。

对三角瓶曲料进行pH、谷氨酰胺酶、中性蛋白酶进行检测，结果如下表所示。

表1、三角瓶曲料的理化指标

如上所示，GM195和ZA205的三角瓶曲料在pH值、谷氨酰胺酶活具有明显优势，其pH值更接近7，谷氨酰胺酶活更高。ZA205的三角瓶曲料还具有较高的中性蛋白酶活。

1.3三角瓶曲料-耐盐能力分析

提供非转基因大豆和小麦的混合物(质量比，大豆:小麦＝1:1)，润水1.2倍，混合拌匀，分装至三角瓶，121℃灭菌30min，制成三角瓶发酵培养基。从GM195、ZA205、As3.951米曲霉斜面菌种挑取1环孢子，接种于三角瓶发酵培养基中，32℃培养96h，制得三角瓶曲料。

对曲料进行谷氨酰胺酶耐盐稳定性测试，具体测试方法如下：取适量曲料加入两倍的pH7.2的磷酸盐缓冲液，在4℃冰箱中浸泡过夜，获得浸提酶液。使用NaCl将浸提酶液调节到0％、5％、10％、17％浓度后，并在4℃的环境中放置0、1、3、5、8h，检测谷氨酰胺酶相对残留酶活，结果如表2所示。图2、图3和图4分别示出了，ZA205、As3.951和GM195菌株的谷氨酰胺酶活在不同浓度NaCl溶液中的耐盐稳定性。

表2、不同菌株的谷氨酰胺酶在NaCl溶液中的相对残留酶活

结果显示，在不同的NaCl浓度下，ZA205的谷氨酰胺酶相对残留酶活均显著高于As3.951和GM195，同时菌株的保留时间也显著长于As3.951和GM195。ZA205的谷氨酰胺酶耐盐稳定性改善到达了预料不到的程度。

1.4制曲小试和发酵小试

将米曲霉ZA205、GM195与As3.951依次转接斜面活化后，进行三角瓶扩大培养，然后继续进行制曲和发酵小试(制曲培养基采用大豆、小麦等原料制备，原料比例、润水、蒸煮、发酵参数均参考《酱油科学与酿造技术》进行)。

发酵小试制备了曲料0.4吨，检测制曲曲料水分、pH值、中性蛋白酶、谷氨酰胺酶，检测结果见表3。

发酵小试制备了发酵原油(酱油)0.6吨，检测发酵原油总酸、氨基氮、谷氨酸、葡萄糖等指标，检测结果见表4。

表3、小试制曲的理化指标

*标准化是指以As3.951指标为1.00

表4、发酵原油的理化指标

如上所示，如上所示，ZA205的小试制曲理化指标显著优于As3.951，特别是pH值更接近中性。ZA205的发酵原油理化指标显著优于As3.951和GM195。

1.5黄曲霉素检测

将筛选获得新菌株ZA205进行黄曲霉毒素检测，结果显示黄曲霉毒素未检出。

1.6传代实验

同步对ZA205进行10代传代试验，并将传代菌株进行酱油制曲小试验证，结果显示发酵氨基氮及谷氨酸指标稳定，表明ZA205遗传性能稳定。

表5、ZA205传代稳定性验证

代数	氨基氮(g/100mL)	谷氨酸(g/L)
原代	1.12	14.0
2代	1.11	13.9
6代	1.13	14.6
10代	1.12	14.2

1.7规模化生产

将新菌株ZA205与出发菌株As3.951同步展开规模化酱油、生产使用。规模化生产中，制曲规模为20吨，制备原油规模为30吨。

制曲结束后抽样检测规模化生产制曲理化指标，结果如表6。发酵结束后检测规模化生产原油的理化指标，结果如表7。对规模化生产的酱油原油进行加热灭菌等后处理后，进行感官评测，结果如表8。

表6、规模化生产的曲料的理化指标

表7、规模化生产的酱油原油的理化指标

表8、规模化生产的酱油原油的感官分析

菌株	色泽	香气	体态	鲜味	咸味	酸味	综合口感
ZA205	4.5	4.5	3.5	4.5	3.5	2.5	4.5
As3.951	3.5	3.5	3.5	3	4.5	3	3

由表6～表8所示，米曲霉ZA205用于规模化生产，曲料的理化指标，酱油的理化指标，酱油的感官分析，均优于米曲霉As3.951。

如表6所示，米曲霉ZA205制备的曲料具有显著提高的谷氨酰胺酶活，更接近于7的pH，中性蛋白酶活也较高。

如表7所示，米曲霉ZA205制备的酱油具有显著提高的氨基酸态氮含量、谷氨酸含量、葡萄糖含量；另外其乳酸的含量更高，柠檬酸的含量更低。

如表8所示，米曲霉ZA205制备的酱油具有提高的色泽、香气和鲜味，表现出显著改善的综合口感。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

米曲霉ZA205(Aspergillus oryzae ZA205)，该菌株于2021年05月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：61669，保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼。
权利要求1所述的米曲霉ZA205在制曲中的用途。
权利要求2所述的用途，其中制曲获得的曲料用于制备酱油。
权利要求1所述的米曲霉ZA205在制备发酵食品中的用途；

优选地，所述发酵食品是对含豆和/或谷的原料发酵获得的发酵食品；

优选地，所述发酵食品是酱或酱油。
一种曲料，其由权利要求1所述的米曲霉ZA205制备获得；

优选地，所述曲料是将含豆和/或谷的原料与米曲霉ZA205混合制曲获得。
一种发酵食品，其由权利要求5所述的曲料制备获得；

优选地，所述发酵食品是对蛋白质原料和/或淀粉质原料发酵获得的发酵食品；

优选地，所述发酵食品是酱或酱油。
一种制备曲料的方法，其包括将权利要求1所述的米曲霉ZA205接种到蛋白质原料和/或淀粉质原料中并进行培养。
一种制备酱油或酱的方法，其包括制曲和发酵的步骤，其中，所述制曲包括将权利要求1所述的米曲霉ZA205接种到蛋白质原料和/或淀粉质原料中并进行培养。
权利要求8所述的方法，其中，使用高盐稀态发酵法进行所述发酵。
一种用于筛选菌株的培养基，含有：

L-谷氨酰胺；

酸碱指示剂(例如酚红)；和

NaCl；

可选地，所述培养基还含有菌株生长所需营养成分。
根据权利要求10所述的培养基，其特征在于以下一项或多项

L-谷氨酰胺的百分含量为0.5％-2％

酸碱指示剂的百分含量为0.01‰-0.5‰；

NaCl的百分含量为2％-5％。
一种筛选米曲霉的方法，包括

-将多个米曲菌接种于权利要求10所述的培养基；

-比较所述多个米曲菌附近培养基的颜色变化程度和/或速度；

-根据比较结果筛选米曲霉。