CN107723250B - 一株高活力米曲霉za189及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株米曲霉ZA189，其能够明显降低制曲阶段的原料消耗率、能够高产谷氨酰胺酶和淀粉酶活力，并且该菌株同时保有米曲霉原有的高蛋白酶活力；应用该菌株酿造酱油或酱，能够进一步提高原料利用率，生产出滋味更加鲜甜适口的调味品。

Description

一株高活力米曲霉ZA189及其应用

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，尤其涉及一株适用于酱油、酱等调味品生产用的米曲霉(Aspergillus oryzae)，本发明还涉及所述米曲霉在酱油、酱等调味品生产中的应用。

背景技术

国内酱油/酱生产用米曲霉菌种公开的主要有As3.863、As3.951(沪酿3.042)、UE328、UE336、渝3.811和一些日本引进的酱油曲霉等菌株。这些菌株都有独立的特征特性，在生长速度快慢、产孢多少及主要酶系(蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、谷氨酰胺酶等)的分布等方面都有较为显著的差异。但因受制于酱油生产过程各环节的需求，目前在调味品企业使用最广泛的主要还是As3.951系列菌株。该系列菌株的特性主要是生长速度较快、抗杂性能良好、产孢较丰富，且制曲分泌的主要酶系-蛋白酶活力较高。

随着酱油企业规模化和效益最大化的需求，针对As3.951菌株，也有进行过以提高蛋白酶系为目的的菌株改造。虽然筛选出的新菌株的蛋白酶活越来越高，但同时也打破了该菌株原来的酶系分布。而酱油酿造过程是一个多酶系共同作用的过程，因此造成利用纯曲霉菌株发酵出的酱油质量下降，突出表现为：因制曲过程原料消耗大及制曲淀粉酶活力较低造成发酵原油还原糖偏低；因菌株制曲分泌的谷氨酰胺酶活力不高造成发酵原油的谷氨酸低等问题。

可以通过以下途径来解决上述问题、提高发酵原油的品质：第一，多菌种混合发酵；第二，发酵过程加酶处理；第三，菌种改良。多菌种混合发酵能一定程度上解决上述某些问题，但在制曲、发酵等环节，存在因多菌株的竞争性生长而带来的新问题及生产成本的增加。发酵过程加酶处理同样也因添加了外源物质造成成本的增加和食品安全隐患。总之，前两种途径都不能从根本上彻底解决问题。在酱油生产时，只有通过菌种改良，选育出综合酶活力高、制曲过程原料消耗少的菌株，才能从根本上提高发酵原油的品质。

专利：一种米曲霉及其应用-ZL201310553081.3发明提供了一株酱油或酱生产用米曲霉菌，该菌在制曲阶段产中性蛋白酶活力高且产孢子量少，发酵阶段曲料与盐水混合均匀且充分故而原料利用率得到提高。该专利菌株的特点是产中性蛋白酶活高和产孢少，而其产谷氨酰胺酶、淀粉酶和制曲原料消耗方面没有提及。专利：一种提高谷氨酸含量的发酵工艺-ZL201410368087.8发明公开了一种提高谷氨酸含量的发酵工艺，是在制曲阶段额外添加一种高产谷氨酸酰胺酶的微生物进行混合制曲，高产谷氨酰胺酶的微生物是浅白隐球酵母、隐球酵母属、产阮假丝酵母、鼠李糖乳杆菌、藤黄微球菌、嗜麦芽寡养单孢菌、枯草芽孢杆菌中的任意一种或两种以上混合物。专利申请：用米曲霉发酵花生粕制备呈味肽和呈味氨基酸的方法及其应用-CN104651438A中，也是通过筛选获得一株蛋白酶活力提高的突变株来生产呈味肽和呈味氨基酸。专利申请：一株高产真菌淀粉酶的米曲霉菌株-CN106434383A公开了一种高产真菌淀粉酶的米曲霉突变菌株，应用于酶制剂技术领域且适用于液体发酵。

现有米曲霉菌株存在的缺点最突出表现在蛋白酶活力高而其它酶活力普遍偏低，且制曲阶段原料消耗率相对较高。

发明内容

本发明提供一株米曲霉新菌种，其能够明显降低制曲阶段的原料消耗率、能够高产谷氨酰胺酶和淀粉酶活力，并且该菌株同时保有米曲霉原有的高蛋白酶活力；应用该菌株酿造酱油或酱，能够进一步提高原料利用率，生产出滋味更加鲜甜适口的调味品。

本发明提供一株米曲霉ZA189，该菌株于2017年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏号为GDMCC No：60184。

本发明的米曲霉ZA189的菌落特征如下：豆汁平板培养基培养72h，菌落直径达29mm，菌落单薄、菌丝生长一般，孢子细密、适量、色泽黄绿色。大豆蛋白平板培养60h，成熟菌落形态单薄，直径达38mm色泽青黄绿色，菌丝生长短，透明圈清晰，孢子着生适量。酪蛋白平板培养96h，菌落直径达19.8mm，近似圆形、边缘不整齐，菌落浅黄绿色，孢子细小。

本发明的米曲霉ZA189菌株是以米曲霉As3.951为出发菌株，经诱变选育获得。具体地，本发明所述的米曲霉ZA189菌株的诱变选育方法如下。

以米曲霉As3.951为出发菌株，采用公知诱变方法对出发菌株进行诱变，获得突变菌落，使用双平板培养基对突变菌落进行筛选。即在酪蛋白平板上挑选与出发菌种As3.951相比具有菌丝生长正常、透明圈大、产孢时间延迟特点的菌落；在大豆蛋白平板上面挑选与出发菌种As3.951相比具有菌落直径大、菌丝生长正常的菌落。挑选同时满足双平板筛选条件的突变菌株转接PDA斜面或者豆汁斜面，培养成熟后进行常规保藏及进一步筛选。

上述双平板的培养基分别是酪蛋白培养基和大豆蛋白培养基。

酪蛋白培养基的配方为：称取6g干酪素，0.36g磷酸二氢钾，0.58g磷酸氢二钠，0.244g硫酸镁，20g琼脂粉，溶于1000mL蒸馏水中，调节pH6.0，分装，0.1Mpa、121℃灭菌20min。

大豆蛋白培养基的配方为：称取10g大豆分离蛋白，30g木糖，0.5g七水硫酸镁，1g磷酸二氢钾，15g琼脂粉，溶于1000mL蒸馏水中，调节pH6.4，分装，0.1Mpa、115℃灭菌15min。

初筛方法为将保藏菌种由豆汁斜面活化后转接三角瓶培养，观察米曲霉生长情况。挑选菌丝生长和孢子着生正常的突变菌株，采用常规方法检测成曲孢子数、中性蛋白酶和淀粉酶酶活，优选综合酶活力高的菌株进行复筛。

复筛方法为按照常规酱油生产方法进行小规模的制曲，检测制曲成曲孢子数、原料消耗率、中性蛋白酶、谷氨酰胺酶和淀粉酶酶活，优选综合酶活力高的菌株进行生产试用。

生产试用为按照常规酱油生产方法进行酱油生产，检测制曲成曲指标和发酵酱油质量。

本发明提供一株保藏号为GDMCC No：60184的米曲霉ZA189及其筛选方法和在酱油等调味品中的应用。

本发明所述米曲霉ZA189具有制曲产孢略少、原料消耗率低、中性蛋白酶活力高、谷氨酰胺酶活力高和淀粉酶活力高的特征。

本发明所述米曲霉ZA189具有发酵酱油高产谷氨酸和还原糖，且全氮收得率高的特征。

本发明所述米曲霉ZA189具有发酵酱油口感鲜甜突出的特征。

因此，在一方面，本发明提供米曲霉ZA189。

在另一方面，本发明提供所述米曲霉ZA189在食品发酵中的用途。在一个实施方案中，所述食品发酵为酱油和/或酱发酵。

在又一个方面，本发明提供所述米曲霉ZA189在制曲中的用途。在一个实施方案中，所述制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。

在另一个方面，本发明提供所述米曲霉ZA189在制备酱油和/或酱中的用途。

本发明具有以下技术优势和积极效果：

本发明ZA189菌株的筛选方法具有普适性，可以广泛应用于丝状真菌的改造。

本发明提供的米曲霉ZA189，具有原料消耗率低和综合酶活力高等优点，应用于酱油生产可以做到发酵过程不用再额外添加各种用途的酶制剂，就可以获得发酵原油风味鲜甜突出、滋味醇厚、酱香浓郁、留口持久的原油，可以轻松实现工业化生产零添加纯酿酱油，也无需通过后期调配其他添加剂来制造成品，节约了生产成本。

酱油企业利用本发明提供的方法来改良现用菌株，可以有效筛选到一株具备上述特性的优良米曲霉菌种；应用该菌株进行酱油生产，制曲和发酵环节不用再额外投入其它菌株、工艺和物料等，节约了人力、物力等方面的投入，企业效益会显著得到提高。

附图说明

本发明采用以下附图来举例说明本发明的有益效果。应当理解的是，这些仅用于说明本发明的具体实施方案，并不意图限制本发明的范围。

图1为米曲霉ZA189的获取流程示意图。

图2为米曲霉ZA189的菌落形态照片。

图3为采用米曲霉ZA189生产的原油鉴评分析结果。

生物保藏信息

一株米曲霉ZA189，于2017年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏号为GDMCC No：60184。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

米曲霉ZA189的筛选获得

1、菌种诱变

取As3.951菌株的成熟斜面孢子制成孢子悬液，并对孢子悬液进行ARTP诱变。用0.85％的无菌生理盐水将诱变后的孢子悬液逐级稀释到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6浓度，制成孢子稀释液。

取0.2mL孢子稀释液涂布于酪蛋白平板培养基上，31℃避光培养96h。培养过程中观察并记录菌落的菌丝生长和产孢情况、透明圈形成的快慢及透明圈大小等。挑选与出发菌种As3.951相比具有菌丝生长正常、透明圈大、产孢时间延迟特点的菌落。

将上述酪蛋白平板上挑选出的目标菌落继续涂布于大豆蛋白平板培养基上，31℃培养60h。培养过程中观察并记录菌落的菌丝生长和产孢情况、透明圈形成的快慢及透明圈大小等。挑选与出发菌种As3.951相比具有菌落直径大、菌丝生长正常的菌落。

选取在双层平板培养基上面菌落生长好、菌丝生长正常、孢子生长延迟、透明圈直径大的菌落为目标菌落，转接斜面培养，成熟后进行菌种保藏，编号依次为ZA189、ZA190、ZA191、ZA192、ZA193、ZA194。

2、诱变菌株筛选

(1)、诱变菌株的初筛

将上述诱变获得的6株目标菌种活化转接于试管斜面培养基上，培养四天。取成熟斜面分别接种于三角瓶培养基中进行扩培。(三角瓶培养基和工艺控制等采用常规方法。其中，培养基是由麸皮、豆粉、面粉、水制备而成)。挑选菌丝生长和孢子着生正常的菌株ZA189、ZA191、ZA192、ZA193、ZA194检测成曲指标(采用常规检测方法)，检测结果见表1。

表1菌株筛选三角瓶成曲质量分析结果

备注：以对照菌株As3.951各项指标为1.00，其它诱变菌株换算成相应比值。

优选生长正常和综合酶活力高的菌株ZA189、ZA191、ZA192、ZA194进行复筛。

(2)、诱变菌株的复筛

将上述初筛选出的4株菌ZA189、ZA191、ZA192、ZA194依次转接斜面活化后，进行三角瓶扩大培养，然后继续进行制曲和发酵小试。(制曲培养基采用大豆、小麦等原料制备)。检测制曲成曲孢子数、原料消耗率、中性蛋白酶、谷氨酰胺酶和淀粉酶酶活，检测结果见表2；检测发酵原油氨基氮、全氮、还原糖、谷氨酸等指标，检测结果见表3。

表2菌株筛选制曲质量分析结果

备注：以对照菌株As3.951各项指标为1.00，其它诱变菌株换算成相应比值。

表3菌株筛选发酵原油质量分析结果

备注：以对照菌株As3.951各项指标为1.00，其它诱变菌株换算成相应比值。

从上表2和3的结果可以看出，综合制曲酶活指标和发酵原油指标，优选全氮收得率、谷氨酸和还原糖指标最高的米曲霉菌株ZA189进行后续试验。

实施例2

米曲霉ZA189菌株遗传稳定性检测

将米曲霉菌株ZA189经豆汁斜面培养基连续传代10代，观察各代菌株的生长情况，并将第1代、第5代和第10代斜面种按照实施例1所述方法逐级扩大制备成三角瓶曲和制曲，判断其遗传稳定性，具体数据见表4。

表4米曲霉菌株ZA189传代稳定性的制曲检测结果

备注：以对照菌株As3.951各项指标为1.00，其它诱变菌株换算成相应比值。

如表4的结果所示，从制曲成曲孢子数、原料消耗率、中性蛋白酶、谷氨酰胺酶和淀粉酶酶活检测结果来看，米曲霉菌株ZA189的遗传稳定性好。

实施例3

米曲霉ZA189在酱油发酵中的效果

将诱变筛选获得的米曲霉菌株ZA189与出发菌株As3.951同步展开酱油生产使用，制曲结束后抽样检测酶活，发酵结束后检测原油指标，结果如表5和表6。

本实施例还召集10名有丰富经验的鉴评人员进行感官鉴评。感官鉴评的评价指标包括体态、色泽、香气、鲜味、甜味、苦涩味、咸味、酸味和综合口感，感官鉴评结果总结于表7和图3中。

表5米曲霉菌株ZA189制曲质量分析

表6米曲霉菌株ZA189发酵原油质量分析

表7米曲霉菌株ZA189发酵酱油感官鉴评结果

备注：表中数据为10名鉴评人员鉴评结果的平均值。各单项指标评分分值为1～5分，分数越高，该项指标越好。

从表5和6的结果可以看到，将本发明的米曲霉ZA189应用于酱油生产，其原料消耗率进一步降低，经制曲发酵压榨后可以得到全氮1.94g/100ml、还原糖11.0g/100ml、谷氨酸13.69g/kg的原油。

如表7和图3的结果所示，经专业鉴评人员评定，所得原油具备酱香浓郁、鲜甜突出、滋味醇厚持久的特征。

实施例4

米曲霉ZA189在酱发酵中的效果

将诱变筛选获得的米曲霉菌株ZA189与出发菌株As3.951同步展开黄豆酱生产使用，制曲结束后抽样检测酶活，发酵结束后检测发酵豆醅指标，结果如表8和表9。本实施例还对发酵豆醅组织进行感官鉴评，结果如表10。

表8米曲霉菌株ZA189黄豆酱制曲质量分析

表9米曲霉菌株ZA189黄豆酱发酵豆醅质量分析

表10米曲霉菌株ZA189黄豆酱发酵豆醅感官鉴评结果

备注：表中数据为10名鉴评人员鉴评结果的平均值。各单项指标评分分值为1～5分，分数越高，该项指标越好。

如表8和表9的检测结果所示的，将本发明的米曲霉ZA189应用于黄豆酱生产，经制曲发酵后可以得到氨基氮0.84g/100ml、还原糖7.8g/100ml、谷氨酸9.8g/kg的发酵豆醅。经鉴评(如表10的鉴评结果所示)，采用本发明的米曲霉菌株ZA189发酵豆醅具备酱香浓郁、鲜甜突出、滋味醇厚持久的特征。

本文提供的任何和所有实施例或示例性语言的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于实施本发明是必要的。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

Claims (6)

1.米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA189，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏号为GDMCC No：60184。

2.权利要求1的米曲霉ZA189在食品发酵中的用途。

3.权利要求2所述的用途，其中食品发酵为酱油和/或酱发酵。

4.权利要求1的米曲霉ZA189在制曲中的用途。

5.权利要求4所述的用途，其中制曲获得的成曲用于制备酱油和/或酱。

6.权利要求1的米曲霉ZA189在制备酱油和/或酱中的用途。