CN112574891B - 米曲霉及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种米曲霉及其应用。其中,该米曲霉命名为米曲霉SH153,保藏编号为CGMCC No.19917。本发明所述的米曲霉SH153,具有生产能力强、产耐盐蛋白酶能力强、产耐盐淀粉酶能力强的特点,能够充分利用原料中的淀粉和蛋白质,成品中氨基酸含量高,还原糖含量高;采用该菌株进行酱和酱油生产,原料能够被充分分解,全氮利用率高、发酵成品氨基酸态氮高、还原糖高、提升产品口味,在酱/酱油发酵工业中具有广阔的应用价值和前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域,具体而言,涉及一种米曲霉及其应用。
背景技术
米曲霉是酱和酱油等发酵调味品生产过程中最关键的生产菌株,米曲霉的相关性能对产品质量有重要影响。目前大多酱及酱油的生产企业均采用米曲霉沪酿3.042作为酿造菌种,能够分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等丰富的酶系,能充分利用发酵原料,产生独特风味,提升酱油品质。
酱和酱油的发酵体系具有高盐、pH偏酸的特点,沪酿3.042菌株的蛋白酶系以中性蛋白酶和碱性蛋白酶为主,酸性蛋白酶的活力相对较低,其相关酶系又受到酱醪高盐环境抑制,影响到原料的利用率、发酵生产效率和产品质量,因此各生产企业和科研机构一直持续研究菌种的改良工作。
中国专利201711163812.8申请公开了一株淀粉酶、糖化酶、蛋白酶活力高的米曲霉,用于酱油发酵调味品的制作,201810134200.4申请公开了一株高产蛋白酶活的米曲霉,能够用于豆瓣酱的工业化生产。但这两篇专利文献中均未涉及到米曲霉的耐盐的酶系指标,考虑到酱和高盐稀态酱油的发酵环境,本发明主要涉及到一株能够耐盐蛋白酶、耐盐淀粉酶的米曲霉。
发明内容
本发明旨在提供一种米曲霉及其应用,以提高米曲霉的耐盐蛋白酶和耐盐淀粉酶的性质。
为了实现上述目的,根据本发明的一个方面,提供了一种米曲霉。该米曲霉命名为米曲霉SH153,保藏编号为CGMCC No.19917。
根据本发明的另一个方面,提供一种上述米曲霉在酱油或酿造酱制曲、酿造中的应用。
进一步地,酱油制曲包括:将预处理后的脱脂大豆和炒麦按照1:1~1:1.5混合,按照原料干重,接种0.1~0.5%的米曲霉,自然pH值下,在28~42℃下进行制曲36~48h,得到酱油成曲。
进一步地,脱脂大豆的预处理包括:将脱脂大豆清洗后,温度控制在115~120℃,压力控制在0.05~0.15MPa下,蒸煮8~10分钟;炒麦的预处理包括:温度控制在300~400℃,压力控制在0.01~0.05MPa下,对小麦进行焙炒,且焙炒后得到的炒麦的水分控制在0.5~1wt%,最后进行粉碎,粉碎后的炒麦的颗粒大小为20~100目
进一步地,酿造酱制曲包括:将预处理后的大豆和/或小麦粉按照1:1~1:1.5混合,按照原料干重,接种0.1~0.5%的米曲霉,自然pH值下,在28~42℃下进行制曲36~48h,得到酿造酱成曲。
进一步地,大豆的预处理包括:大豆清洗后,温度控制98~120℃,蒸煮8~10分钟;小麦粉的预处理包括:在温度为98~120℃,蒸煮20~30s,水分控制在22%~24%。
进一步地,酱油酿造包括:将酱油成曲投入发酵罐内,按照1:1~1:2的重量比向发酵罐内加入15~23°B’e食盐水,混匀后,温度控制在10~35℃,pH控制在4.5~6,密闭发酵6个月,得到酱醪,压榨后,获得酱油原汁。
进一步地,酿造酱酿造包括:将酿造酱成曲投入发酵罐内,按照1:1~1:1.5的重量比向罐内加入15~20°B’e食盐水,混匀后,温度控制在10~35℃,pH控制在4~6,发酵3~4个月,得到酿造酱。
根据本发明的另一方面,提供了一种酱油。该酱油由上述任一种米曲霉在酱油制曲、酿造中的应用制备得到。
根据本发明的再一方面,提供了一种酿造酱。该酿造酱由上述任一种米曲霉在酿造酱制曲、酿造中的应用制备得到。
本发明所述的米曲霉SH153,具有生产能力强、产耐盐蛋白酶能力强、产耐盐淀粉酶能力强的特点,能够充分利用原料中的淀粉和蛋白质,成品中氨基酸含量高,还原糖含量高;采用该菌株进行酱和酱油生产,原料能够被充分分解,全氮利用率高、发酵成品氨基酸态氮高、还原糖高、提升产品口味,在酱/酱油发酵工业中具有广阔的应用价值和前景。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1示出了实施例2中不同菌株孢子数;
图2示出了实施例2中不同菌株制曲的耐盐中性蛋白酶活(酶活性);
图3示出了实施例2中不同菌株制曲的耐盐淀粉酶活(酶活性);
图4示出了实施例2中不同菌株发酵的全氮利用率;
图5示出了实施例2中不同菌株产原油的氨氮含量;以及
图6示出了实施例2中不同菌株产原油的还原糖含量。
菌种保藏信息
本发明所用的菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,邮政编码:100101;电话:010-64807355。
具体菌种的保藏信息如下:参椐的生物材料(株)SH153,米曲霉Aspergillusoryzae于2020年6月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC No.19917。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
本发明提供一种米曲霉SH153,能够高产耐盐蛋白酶和耐盐淀粉酶。该菌种应用到酱及酱油生产过程中,能够显著提高原料利用率,加快发酵速度,提高产品中氨基酸态氮含量和还原糖含量,从而提升产品品质。
根据本发明一种典型的实施方式,提供一种米曲霉。该米曲霉命名为米曲霉SH153,保藏编号为CGMCC No.19917。该米曲霉的耐盐蛋白酶和耐盐淀粉酶在盐浓度为10%的时候,仍能保持较高活力。
根据本发明一种典型的实施方式,提供一种米曲霉在酱油或酿造酱制曲、酿造中的应用。
在本发明一实施方式中,酱油制曲包括:将预处理后的脱脂大豆和炒麦按照1:1~1:1.5混合,按照原料干重,接种0.1~0.5%的米曲霉,自然pH值下,在28~42℃下进行制曲36~48h,得到酱油成曲。采用本发明米曲霉制得的酱油成曲比起出发菌株,耐盐蛋白酶活力提升25%、耐盐淀粉酶活力提升15%。
优选地,脱脂大豆的预处理包括:将脱脂大豆清洗后,温度控制115~120℃,压力控制0.05~0.15MPa,蒸煮8~10分钟;炒麦的预处理包括:温度控制300~400℃,压力控制0.01~0.05MPa,炒麦后水分控制在0.5~1%,最后进行粉碎,粉碎后颗粒大小为80目左右。经过预处理后,米曲霉能够充分与原料接触,从而提高原料的利用能力。在本发明一实施方式中,酿造酱制曲包括:将预处理后的大豆和/或小麦粉按照1:1~1:1.5混合,按照原料干重,接种0.1~0.5%的米曲霉,自然pH值下,在28~42℃下进行制曲36~48h,得到酿造酱成曲。采用本发明米曲霉制得的酿造酱成曲比起出发菌株,耐盐蛋白酶活力提升20%、耐盐淀粉酶活力提升12%。
优选地,大豆的预处理包括:大豆清洗后,温度控制98~120℃,蒸煮8~10分钟;小麦粉的预处理包括:在温度为98~120℃,蒸煮20~30s,水分控制在22%~24%。经过预处理后,米曲霉能够充分与原料接触,从而提高原料的利用能力。在本发明一实施方式中,酱油酿造包括:将酱油成曲投入发酵罐内,按照1:1~1:2的重量比向发酵罐内加入15~23°B’e食盐水,混匀后,温度控制在10~35℃,pH控制在4.5~6,密闭发酵6个月,得到酱醪,压榨后,获得酱油原汁。采用本发明米曲霉菌株制得的酱油原汁,比起出发菌株,氨基酸态氮含量提高22%、全氮利用率提高25%、还原糖含量提高13%。
在本发明一实施方式中,酿造酱酿造包括:将酿造酱成曲投入发酵罐内,按照1:1~1:1.5的重量比向罐内加入15~20°B’e食盐水,混匀后,温度控制在10~35℃,pH控制在4~6,发酵3~4个月,得到酿造酱。采用本发明米曲霉菌株制得的酿造酱,比起出发菌株,氨基酸态氮含量提高25%、全氮利用率提高23%、还原糖含量提高15%。
根据本发明一种典型的实施方式,提供一种酱油。该酱油由上述应用制备得到。
根据本发明一种典型的实施方式,提供一种酿造酱。该酿造酱由上述应用制备得到。
本发明获得的米曲霉菌株SH153,是发明人经过多次诱变、筛选、分离纯化获得的,具体方法如下:
诱变方法:以米曲霉3.042为出发菌株,调整孢子浓度至106~108CFU/mL,紫外灯功率为20W,在紫外灯下15~20cm处照射处理3~5min。
初筛方法:梯度稀释紫外诱变后的孢子溶液,涂布于含有10%NaCl的酪蛋白平板上,培养基成分:干酪素4g,KH2PO4 0.36g,Na2HPO4 1.07g,ZnCl2 0.04g,CaCl2 0.002g,MgSO4 0.50g,FeSO4 0.002g,NaCl 100g,琼脂20g,蒸馏水1000mL,调节pH5.5~6.0,121℃灭菌15min。30℃培养5d后,挑选在平板中生长旺盛、K值大的菌落转接到复筛培养基中。其中,K值=透明圈直径/菌落直径。
复筛方法:将初筛获得的菌株,点接于含有10%NaCl的淀粉培养基中,培养基成分:大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、可溶性淀粉2g、NaCl100g,琼脂20g,蒸馏水1000mL,调节pH5.5~6.0,121℃灭菌15min。30℃培养5d后,用稀碘液滴在菌落周围,计算菌落K值,K值=透明圈直径/菌落直径。挑选在平板中生长旺盛、K值大的菌落。
将上述筛选性能较好的菌株在三角瓶中进行小规模的制曲、发酵,检测成曲孢子数、耐盐蛋白酶活、耐盐淀粉酶活,检测发酵原油的全氮利用率、氨基酸态氮、还原糖,优选综合酶活力高、发酵原油全氮利用率高、氨基酸态氮高、还原糖高的菌株进行生产试验。
生产试验按照常规方法进行酱油和酱生产,检测成曲孢子数、耐盐蛋白酶活、耐盐淀粉酶活,检酱油和酱成品中全氮利用率、氨基酸态氮、还原糖指标、感官指标。
下面将结合实验数据及实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
米曲霉的诱变及筛选
以沪酿3.042为出发菌株,调整米曲霉孢子浓度至2*106CFU/mL,紫外灯功率为20W,在紫外灯下15cm处照射处理3min后,将孢子离心并用无菌生理盐水洗涤;
梯度稀释紫外诱变后的孢子溶液,涂布于含有10%NaCl的酪蛋白平板上,培养基成分:干酪素4g,KH2PO4 0.36g,Na2HPO4 1.07g,ZnCl2 0.04g,CaCl2 0.002g,MgSO4 0.50g,FeSO4 0.002g,NaCl100g,琼脂20g,蒸馏水1000mL,调节pH5.5~6.0,121℃灭菌15min。30℃培养5d后,挑选在平板中生长旺盛、K值大的菌落转接到复筛培养基中,根据K值大小排序共挑选了50株菌株,命名SH121-SH170。其中,K值=透明圈直径/菌落直径。
复筛方法:将初筛获得的菌株,点接于含有10%NaCl的淀粉培养基中,培养基成分:大豆蛋白胨10g、牛肉膏5g、可溶性淀粉2g、NaCl100g,琼脂20g,蒸馏水1000mL,调节pH5.5~6.0,121℃灭菌15min。30℃培养5d后,用稀碘液滴在菌落周围,计算菌落K值,K值=透明圈直径/菌落直径。挑选在平板中生长旺盛、K值大的菌落。
结合两次筛选结果,根据K值大小排序共挑选出来10株菌,SH123、SH128、SH135、SH136、SH153、SH155、SH159、SH160、SH167、SH169。
实施例2
酱油制曲发酵小试实验
将脱脂大豆和小麦按照1:1的比例添加到500mL三角瓶,进行115℃15min处理,冷却后,按照0.5%的接种比例接种上述10株菌种孢子粉,进行制曲小试实验;制曲结束后,检测成曲孢子数、耐盐蛋白酶活、耐盐淀粉酶活。将成曲与23°B’e食盐水按照1:2比例混合,进行发酵实验,发酵结束后,检测发酵原油的全氮利用率、氨基酸态氮、还原糖。
其中成曲孢子数的检测方法参考《SB/T 10315—1999血球计数板法》测定种曲孢子数。
耐盐蛋白酶活的检测方法参考《SB/T 10317-1999蛋白酶活力测定法》,其中反应体系中补足NaCl浓度10%。
耐盐淀粉酶活的检测方法如下:
粗酶液的制备:取成曲5.0g于100mL的三角瓶中,并加10g/L的NaCl溶液50mL,每隔20min振摇一次,浸泡时间为1h。
酶与底物反应:取100mL三角瓶,加入20mL pH6.0、10%NaCl的磷酸缓冲液,提前预热至40℃,加入1mL稀释酶液(对照加入1mL纯水)与1mL 1%可溶性淀粉溶液于40℃保温反应1h,加0.5mol/L的H2SO4 2mL终止反应。
底物含量测定:取0.5mL上述反应液加入2mL碘液显色,在620nm波长下测吸光度。
1个酶活力单位(U/g)定义为1g成曲在40℃、pH=6.0条件下,1h液化1g可溶性淀粉,即为1个酶活力单位。
淀粉酶计算公式:
淀粉酶活力=((AC-AT)/AC)/10
式中:AC为对照管吸光度;AT为测定管吸光度。
全氮检测方法参考《GB 5009.5-2016食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。
酱油中全氮利用率=(酱油全氮含量*酱油产量)/(脱脂大豆全氮含量*脱脂大豆重量+小麦全氮含量*小麦重量)
酱中全氮利用率=(酱全氮含量*酱产量)/(大豆全氮含量*大豆重量+小麦粉全氮含量*小麦粉重量)
氨基酸态氮检测方法参考《GB 5009.235-2016食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》。
还原糖检测方法参考《GB5009.7-2016食品安全国家标准食品中还原糖的测定》
筛选的10株菌的检测结果如下图1~图6所示。
综合检测结果,优选综合酶活力高、发酵原油全氮利用率高、氨基酸态氮高、还原糖高的菌株进行生产试验,最终确认菌株SH153。
实施例3
酱油制曲发酵中试实验
将最终筛选获得的SH153菌株,与出发菌株沪酿3.042进行中试酱油发酵实验。
将脱脂大豆进行预处理,压力控制0.05~0.15MPa,温度为115~120℃,保持时间为8~10分钟,将小麦进行烘焙,压力控制0.01~0.05MPa,温度控制在300~400℃,粉碎,颗粒大小为80目左右,得到炒麦粉。预处理完毕的脱脂大豆、炒麦粉按照重量比1:1混合后,待温度降低到28℃时,按照0.1%的比例分别接入筛选的SH153和出发菌株沪酿3.042的孢子粉,进行制曲;制曲温度28-42℃,制曲时间36-48h。制曲结束后,检测成曲孢子数、耐盐蛋白酶活、耐盐淀粉酶活,检测方法同上所述。
将制好的曲料与23°B’e食盐水1:2混合,混匀后,温度控制在10~35℃,pH控制在4.5~6,密闭发酵6个月,得到酱油酱醪,压榨后,获得酱油原汁,检测发酵原油的全氮利用率、氨基酸态氮、还原糖,检测方法同上所述。获得成品后,挑选了12位内部专业的品评人员,从体态、色泽、香气、酸味、甜味、苦味、咸味、鲜味、酱香味和综合口感进行评价打分,其中分值为0-5分,分数越高,说明该项指标越好。结果如表1~3所示。
表1酱油制曲成曲质量分析
备注:以沪酿3.042的各项指标为1,诱变菌株换算成对应比值。
比起出发菌株,SH153制曲的耐盐蛋白酶活力提升25%、耐盐淀粉酶活力提升15%。
表2原油质量分析
备注:以沪酿3.042的各项指标为1,诱变菌株换算成对应比值。
比起出发菌株,SH153制得的酱油原汁,氨基酸态氮含量提高22%、全氮利用率提高25%、还原糖含量提高13%。
表3发酵酱油成品感官评价结果
实施例4
酱制曲发酵中试实验
将SH153菌株,与出发菌株沪酿3.042进行中试发酵酱生产。
大豆清洗后,在温度98-120℃下,蒸煮10分钟;小麦粉在温度为98-120℃,蒸煮30s,水分控制在22%-24%,预处理后大豆与小麦按照1:1.5混合,待温度降低到28℃时,按照0.1%的比例分别接入筛选的SH153和出发菌株沪酿3.042的孢子粉,进行制曲;制曲温度28-42℃,制曲时间36-48h。制曲结束后,检测成曲孢子数、耐盐蛋白酶活、耐盐淀粉酶活,检测方法如上所示。
将制好的曲料与20°B’e食盐水1:1.5混合,混匀后,温度控制在10-35℃,pH控制在4-6,发酵3-4个月,得到酱发酵酱醪,检测其全氮利用率、氨基酸态氮、还原糖,检测方法如上所示。获得成品后,挑选了12位内部专业的品评人员,从体态、色泽、香气、酸味、甜味、苦味、咸味、鲜味、酱香味和综合口感进行评价打分,其中分值为0-5分,分数越高,说明该项指标越好。结果如表4~6所示。
表4酱制曲成曲质量分析
备注:以沪酿3.042的各项指标为1,诱变菌株换算成对应比值。
比起出发菌株,SH153进行酿造酱制曲的耐盐蛋白酶活力提升20%、耐盐淀粉酶活力提升12%。
表5成熟期酱醪质量分析
备注:以沪酿3.042的各项指标为1,诱变菌株换算成对应比值。
比起出发菌株,SH153发酵酱醪的氨基酸态氮含量提高25%、全氮利用率提高23%、还原糖含量提高15%。
表6发酵酱成品感官评价结果
从以上的描述中,可以看出,本发明上述的实施例实现了如下技术效果:本发明所述的米曲霉SH153,具有生产能力强、产耐盐蛋白酶能力强、产耐盐淀粉酶能力强的特点,采用该菌株进行酱和酱油生产,原料能够被充分分解,全氮利用率高、发酵成品氨基酸态氮高、还原糖高、提升产品口味,在酱/酱油发酵工业中具有广阔的应用价值和前景。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种米曲霉,其特征在于,所述米曲霉命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)SH153,保藏编号为CGMCC No.19917。
2.如权利要求1所述的米曲霉在酱油或酿造酱制曲、酿造中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述酱油制曲包括:将预处理后的脱脂大豆和炒麦按照1:1~1:1.5混合,按照原料干重,接种0.1~0.5%的所述米曲霉,自然pH值下,在28~42℃下进行制曲36~48h,得到酱油成曲;所述脱脂大豆的预处理包括:将所述脱脂大豆清洗后,温度控制115~120℃,压力控制0.05~0.15MPa,蒸煮8~10分钟;所述炒麦的预处理包括:温度控制300~400℃,压力控制0.01~0.05MPa,所述炒麦后水分控制在0.5~1%,最后进行粉碎,粉碎后颗粒大小为20~100目。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述酿造酱制曲包括:将预处理后的大豆和/或小麦粉按照1:1~1:1.5混合,按照原料干重,接种0.1~0.5%的米曲霉,自然pH值下,在28~42℃下进行制曲36~48h,得到酿造酱成曲;所述大豆的预处理包括:所述大豆清洗后,温度控制98~120℃,蒸煮8~10分钟;所述小麦粉的预处理包括:在温度为98~120℃,蒸煮20~30s,水分控制在22%~24%。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述酱油酿造包括:将所述酱油成曲投入发酵罐内,按照1:1~1:2的重量比向所述发酵罐内加入15~23°B’e 食盐水,混匀后,温度控制在10~35℃,pH控制在4.5~6,密闭发酵6个月,得到酱醪,压榨后,获得酱油原汁。
6.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述酿造酱酿造包括:将所述酿造酱成曲投入发酵罐内,按照1:1~1:1.5的重量比向罐内加入15~20°B’e 食盐水,混匀后,温度控制在10~35℃,pH控制在4~6,发酵3~4个月,得到酿造酱。
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