CN107746812B - 一株米曲霉za156及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种适用于酱油生产的米曲霉ZA156，还涉及所述米曲霉在提升酱油原酿谷氨酸方面的应用。本发明的米曲霉ZA156中性蛋白酶活性和淀粉酶活性高、谷氨酰胺酶活力高，适合用于原酿高鲜酱油的生产，使原油中谷氨酸提升了10％左右，氨基氮收率提升了8％，沉淀量减少了3％，使酱油纯酿发酵感官鲜味得到显著提升。

Description

一株米曲霉ZA156及其应用

技术领域

本发明属于食品发酵与食品加工技术领域，涉及米曲霉(Aspergillus oryzae)，具体涉及一种适用于酱油生产的米曲霉ZA156，还涉及所述米曲霉在提升酱油原酿谷氨酸方面的应用。

背景技术

酱油产品主要指以小麦和豆类为主要原料，经过微生物发酵制成的一种液态调味品。目前，中国酱油生产用菌株主要以传统米曲霉为主，绝大多数调味品企业使用的生产菌株为As3.951(沪酿3.042)。该菌株具有酶系种类丰富，生长旺盛，产孢子能力强，传代遗传稳定性好等特点。

生产菌株是酱油发酵的基础，其性能对酱油产量和质量影响甚大。菌种的选育和持续改良技术贯穿于整个酱油生产过程的始终，根据生产需求，有针对性的选育菌株至关重要。有研究表明，米曲霉在制曲阶段分泌的酶系种类和活力状况对酱醪发酵成熟的快慢、原料利用率的高低、成品色泽的浓淡以及味道的鲜美与否都有着直接的关系。在米曲霉生长过程分泌的众多酶系中，谷氨酰胺酶活性的高低将直接影响到天然酿造原油中谷氨酸的含量及成品的口感鲜味，进而影响酱油产品的品质。随着人们生活水平的提升，对天然酿造的鲜味需求度日益提升。因此，设法提高成曲谷氨酰胺酶活力是高端酱油提升天然呈鲜的重要途径。

味之素株式会社在中国发明专利ZL99808661.4即发明名称为“一种新的谷氨酰胺酶及其基因和生产方法”中涉及一种新的谷氨酰胺酶和编码这种酶的基因，并具体公开了谷氨酰胺酶可用作食品加工中的酶从而将谷氨酰胺转化为谷氨酸，以使食物表现出更强的“鲜味”味道。其中，该专利提到酱油生产过程中，谷氨酸释放率不高与曲霉的谷氨酰胺酶活力不足有关。

从已有专利/专利申请和非专利文献调研获悉，通过谷氨酰胺酶提升谷氨酸多采用外源酶添加或者基因改良技术，或者引入其他菌种采用多菌种发酵提升谷氨酰胺酶，直接从主发酵菌米曲霉诱变选育角度提升的报道较为少见。1990年陈红玲对沪酿3.042诱变育种产生中性蛋白酶活力高的UE336后进行再次诱变，选育获得一株谷氨酰胺酶提升2倍以上、酱油谷氨酸含量提升40％左右的米曲霉菌株沪酿3.422(陈红玲，谷氨酰胺酶高产菌沪酿3.422米曲霉的育种，中国酿造，1990年第3期第38-40页)。沪酿3.422的菌丝粗壮浓厚，孢子数较少。

公开号为CN103555594A的中国发明专利申请文件记载了一种米曲霉及其应用：该菌株遗传性能稳定，易于扩大培养；在制曲阶段产生的中性蛋白酶活力高、产孢子量少，有利于保持车间现场环境的卫生，避免孢子飞扬；在发酵阶段易于与盐水混合均匀使后期发酵更为充分，可提高原料利用率和降低杂菌污染，从而稳定的获得高品质的发酵调味品。该发明专利申请中的菌株相对沪酿3.042孢子数降低了50％左右，中性蛋白酶活力平均提升了15％左右。

综上可知，米曲霉的菌株性状与产品质量的关系值得长期深入研究，通过选育技术提升主发酵菌性能是发酵行业品质提升的重要手段。

发明内容

根据提升酱油产品天然呈鲜提升品质的需求，本发明的研究目的首先是通过对诱变选育后的米曲霉菌种的进行再次诱变选育，基于诱变后米曲霉生成孢子数低、综合酶系高的基础上，获得谷氨酰胺酶提升的米曲霉菌株，提高发酵原油的氨基酸态氮和谷氨酸水平，提升酱油品质的同时，提高氨基酸态氮收得率，减少沉淀量。

为了实现本发明的目的，本发明人通过大量的实验和不懈的探索，最终获得了如下实验方案：

本发明提供了一株米曲霉ZA156。此米曲霉菌株于2017年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏编号为：GDMCC No：60185。

本发明的米曲霉ZA156的形态学特征描述如下：

该米曲霉菌落呈圆形，颜色呈黄绿色，四周边缘呈透明射线状，ZA156菌丝分枝较短，孢子囊松散。

本发明的米曲霉是以佛山市海天调味食品有限公司经紫外诱变选育获得的菌株作为原始菌株，进行二次诱变后初步筛选，在确保蛋白酶活性和淀粉酶活性相对于出发菌株更具优势的情况下，获得一批谷氨酰胺酶相对初始菌株高的米曲霉菌株。蛋白酶活性和淀粉酶活性高，确保原料的酶解效率和程度；谷氨酰胺酶活力高，使原油天然呈鲜更佳。

本发明所采用的诱变筛选方法，是由紫外诱变、化学诱变、ARTP诱变等公知菌种诱变方法的一种或者几种诱变方法的相互结合。

本发明以出发菌株为对照，对初筛后获得性状优良且菌丝相对短的米曲霉菌株，进行小试制曲和发酵实验筛选，对综合酶系和发酵指标进行分析，获得相对更为优秀的菌株。

本发明人对上述获得的优秀菌株进行试产实验，以评价菌株在提升酱油产品天然呈鲜方面的应用效果，进而提升酱油产品品质。

本发明的酱油制作依照传统酱油酿造工艺，包括以下步骤：

1)选豆：所选黄豆要颗粒均匀，干燥，无皱皮，相对密度大，且无霉烂变质，无损坏；

2)泡豆：分别将黄豆去除泥砂等杂质，置于温水中浸泡至软硬适度，豆心发白；

3)煮豆：再将豆类原料于高压锅中分别蒸煮至软硬适度，易于被米曲霉利用；

4)拌料：取蒸煮后黄豆，拌入面粉，混合均匀；

5)制曲：接入诱变筛选获得的米曲霉菌株，混合均匀，在曲池培养至菌丝发白，曲料松散，成曲结束后，收曲备用；围绕提升原油呈鲜的目的，在制曲阶段进行了蛋白酶活力、产孢子能力、谷氨酰胺酶、遗传稳定性等方面的综合性能分析；

6)发酵：加入盐水浸泡、发酵，压榨、过滤制备获得酱油。对原油中谷氨酸、还原糖、氨基酸转化率、全氮利用率等指标进行分析。

因此，在一方面，本发明提供米曲霉ZA156。

在另一方面，本发明提供所述米曲霉ZA156在食品发酵中的用途。在一个实施方案中，所述食品发酵为酱油发酵。

在又一个方面，本发明提供所述米曲霉ZA156在制曲中的用途。在一个实施方案中，所述制曲获得的成曲用于制备酱油。

在另一个方面，本发明提供所述米曲霉ZA156在制备酱油中的用途。

本发明的有益效果在于通过对诱变后的酱油生产菌株(米曲霉)的进行二次诱变筛选，获得中性蛋白酶活性和淀粉酶活性高、谷氨酰胺酶活力高的米曲霉菌株，更适合用于原酿高鲜酱油的生产，使原油中谷氨酸提升了10％左右，氨基氮收率提升了8％，沉淀量减少了3％，使酱油纯酿发酵感官鲜味得到显著提升。

附图说明

本发明采用以下附图来举例说明本发明的有益效果。应当理解的是，这些仅用于说明本发明的具体实施方案，并不意图限制本发明的范围。

图1为本发明米曲霉ZA156的获得及应用流程图。

图2为本发明米曲霉ZA156菌株在豆汁培养基上的菌落形态照片。

图3为发酵原油感官鉴评结果图。

生物保藏信息

本发明的米曲霉ZA156，于2017年5月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏编号为：GDMCCNo：60185。

具体实施方式

为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1

米曲霉ZA156菌株的获得

通过对出发诱变菌株进行二次诱变获得10株性状优良的米曲霉菌株，并对初筛后获得10株米曲霉菌株，以出发菌株为对照菌株，进行小试制曲和发酵筛选。综合分析结果如菌落直径、孢子数、蛋白酶活力、淀粉酶活力、谷氨酰胺酶活力总结于下表1中，各项发酵指标分析结果总结于下表2。

表1菌株筛选制曲质量分析结果

备注：①以对照菌株值为1，其他菌株换算成相应比值。

②表中菌株YA1505即本发明人进行专利保藏的米曲霉ZA156。

如表1的结果所示，选育获得的米曲霉ZA156菌株具有以下特点：(1)孢子生成量少，生长速度相较对照菌株略慢；(2)综合酶系高，蛋白酶活力、淀粉酶活力、谷氨酰胺酶活力显著提升20％左右，预期可显著提高发酵原油的理化指标水平。

表2菌株小试筛选发酵质量分析结果

备注：①以对照菌株值为1，其他菌株换算成相应比值。

②表中菌株YA1505即本发明人进行专利保藏的米曲霉ZA156。

如表2的结果所示，选育获得的米曲霉ZA156菌株发酵指标检测结果显示，其具有氨基氮和全氮高、铵盐和硝酸盐低的优势；虽然其还原糖与对照菌株生成量相当，但谷氨酸比对照菌株高出11％以上。上述发酵指标有利于改善发酵原油的鲜味，使口感更加丰富，因此，选育获得的米曲霉ZA156菌株具有明显优势。

本实施例选育获得的米曲霉ZA156菌株已经由本发明人保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：60185。

图2显示了米曲霉ZA156菌株在豆汁培养基上的菌落形态。

实施例2

米曲霉ZA156菌株遗传稳定性检测

诱变获得选育菌株产酶活的传代稳定性是关系到菌种质量的重要考察指标。将选育获得的诱变菌株米曲霉ZA156进行连续传代，在低、中、高三个温度进行了培养温度与水解圈相关性实验，结果见下表3。

表3选育菌株在不同温度下在酪蛋白培养基上传代稳定性分析

如表3所示，通过5代传代实验分析了米曲霉ZA156菌株在28℃、32℃和36℃三个温度下的稳定性、菌落直径和K值结果显示，该米曲霉ZA156菌株在菌落形态和蛋白酶分泌方面表现出了良好的稳定性，符合生产使用需求。

实施例3

米曲霉ZA156菌株的在酱油酿造中的应用

黄豆清洗后于常温下(25℃)浸泡12h，用蒸气锅蒸煮60min后冷却至约40℃。冷却后的黄豆与小麦面粉以5:2(w/w)的比例进行混合，再接种米曲霉种曲(0.1％，w/w)制曲，制曲完毕后进行大罐发酵实验。

米曲霉ZA156的制曲结果见表4，发酵结果见表5。

表4米曲霉ZA156菌株第一批次制曲质量分析

备注：以对照菌株值为1，其他菌株换算成相应比值。

如表4的结果所示，选育获得的米曲霉ZA156菌株其蛋白酶、淀粉酶和谷氨酰胺酶显著高于对照菌株，谷氨酰胺酶活力相对提升20％左右；杂菌菌落总数相对对照菌株明显减少，表现为良好的抗杂性能；通过选育获得的米曲霉ZA156菌株孢子生成量少，综合酶系高，制曲环节表现较好。

表5米曲霉ZA156菌株第一批次原油理化发酵质量分析

备注：以对照菌株值为1，其他菌株换算成相应比值。

如表5的结果所示，选育获得的米曲霉ZA156菌株在氨基氮、还原糖方面略有优势，谷氨酸方面优势明显，谷氨酸较对照菌株提高13％；由于选育获得的米曲霉ZA156菌株发酵生产的原油鲜味更好，综合酶系更高，原料利用更充分，进而产品收得率(以对照菌株为1换算)显著优于对照菌株，提高了8％；在沉淀物方面，选育菌株米曲霉ZA156相对生产对照菌株的沉淀物减少了3％。

本实施例还召集10名有丰富经验的鉴评人员进行感官鉴评。感官鉴评的评价指标包括体态、色泽、香气、鲜味、甜味、苦涩味、咸味、酸味和综合口感，分值为0～4分，分数越高，该项指标越好。感官鉴评结果总结于表6和图3中。

表6米曲霉ZA156发酵酱油感官鉴评结果

表6和图3的感官鉴评结果显示，试产菌株米曲霉ZA156菌株的鲜味、甜味明显好于生产对照菌株，同时带来感官咸味、苦涩味较生产对照的感官体验更好，鲜、甜对咸味、苦涩味具有一定的抑制作用，综合口感也更具有优势。

本文提供的任何和所有实施例或示例性语言的使用仅旨在更好地说明本发明，而不对本发明的范围构成限制，除非另有要求。说明书中的语言不应被解释为指示任何未要求保护的元素对于实施本发明是必要的。

本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

Claims (6)

1.米曲霉(Aspergillus oryzae)ZA156，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075，保藏编号为：GDMCC No：60185。

2.权利要求1的米曲霉ZA156在食品发酵中的用途。

3.权利要求2所述的用途，其中食品发酵为酱油发酵。

4.权利要求1的米曲霉ZA156在制曲中的用途。

5.权利要求4所述的用途，其中制曲获得的成曲用于制备酱油。

6.权利要求1的米曲霉ZA156在制备酱油中的用途。