CN100455653C - 一株米曲霉菌及其应用 - Google Patents

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本发明公开了米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiT05 CGMCC No.1712及其在生产酿造酱油中的应用。试产实验结果证明由该菌株制备的成曲颜色鲜艳，手感轻，菌丝结块好，孢子着生好，发酵制备酱油产量高、能耗低。本发明的菌株将在酿造酱油生产中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一株米曲霉菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株米曲霉菌及其在生产酿造酱油中的应用。
背景技术
米曲霉(Aspergillus oryzae)是酿造酱油中必不可少的微生物，也是酿造酱油生产过程中的核心技术。米曲霉所含的蛋白酶可将原料(黄豆)中的蛋白质分解为氨基酸，所含的淀粉酶可将原料(面粉)中的淀粉分解为糖，从而构成了酿造酱油的主要成分。
优质高产的米曲霉菌种不仅能提高原材料的利用率、产品出品率，还能缩短生产周期、降低生产成本，提高酿造酱油的风味和品质，因此迫切需要一种优质高产的米曲霉菌种。
发明内容
本发明的目的是一株优质高产的米曲霉菌。
本发明所提供的米曲霉菌菌株是(Aspergillus oryzae)LiT05，该菌株已于2006年05月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1712。
米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiT05 CGMCC No.1712的菌落呈圆形，质地疏松，初期菌落中间白色，四周边缘呈透明射线状。菌落刚形成时，仅中间一点呈白色，以后随菌落长大，白色范围也逐渐扩大，而透明的范围从一片缩小成边缘一狭环状。随菌落长大，菌落的中心点先呈黄绿色，然后黄绿色向四周扩展。成熟菌落为黄宰色，有时为淡绿宰色。7-10天可达6cm左右，分生孢子头为放射形，顶囊近视球形，直径一般为40-50μm，有梗茎。该菌株的孢子形成能力为5.55×109/g，发芽率为32.51％。具有较高的蛋白酶活力，酸性蛋白酶活为142.5u/g(发酵物)，中性蛋白酶活为2227.67u/g(发酵物)，碱性蛋白酶活为62.09u/g(发酵物)。
可用常规的米曲霉菌培养基及培养方法对本发明的米曲霉菌(Aspergillusoryzae)LiT05 CGMCC No.1712进行培养。
本发明提供了一株米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiT05 CGMCC No.1712。该菌株是经太空育种的高产优质米曲霉菌菌株。试产实验结果证明由该菌株制备的成曲颜色鲜艳，手感轻，菌丝结块好，孢子着生好，发酵制备酱油产量高、能耗低。本发明的菌株将在酿造酱油生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比浓度，所有培养基中的溶剂均为水。
实施例1、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiT05 CGMCC No.1712的获得及保藏
委托国家航天局、中国科学院遗传与发育生物学研究所将米曲霉菌(Aspergillusoryzae)LiY05 CGMCC No.1711(是对深圳市李金记食品有限公司目前酿造酱油生产用菌种进行筛选获得的高产菌株)由我国第21颗返回式科学与实验卫星携带上太空，在太空中进行了27天的太空育种培育实验，该菌种已于2005年8月29日圆满完成太空育种，然后经中国科学院微生物研究所筛选、分离，最终获得一高产菌株，命名为LiT05，该菌株已于2006年05月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1712。
实施例2、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiT05 CGMCC No.1712与原生产菌种的比较试验
按如下方法进行米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiT05 CGMCC No.1712与上述酿造酱油生产用菌种LiY05-米曲霉(简称LiY05)的比较试验：
1、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiT05 CGMCC No.1712的复接
检测米曲霉菌LiT05能否在常规的米曲霉试管斜面培养基上生长繁殖。分别在常规的米曲霉试管斜面培养基(酐酪素4g，KH2PO4 0.36g，Na2HPO4·7H2O 1.1g，琼脂15g，用水定容至1000mL)上接种了10支米曲霉菌LiT05(命名为T00-T10)，在30℃下培育3天，结果全部复接成功，可作为生产酿造酱油的始发菌种。
2、复接菌种的分离复壮
从复接成功的斜面菌种中筛选出外观形态好、酶活力高的米曲霉单菌株，以获得适合酿造酱油生产需要的适应性强、高产优质菌株。具体方法为：选择外观形态好的试管斜面菌种，将其划线接种于分离复壮平皿(培养基配方与斜面培养基相同)中，在30℃下培育5-6天，并从平皿中挑选菌落直径大、外观形态优良的米曲霉单菌株挑接到斜面试管中，共获得12株斜面试管菌株，分别编号T001-T012，作为第一代试管菌种。
3、分离复壮菌种的初步筛选
将步骤2经复壮获得的菌种T001-T012再次接种于斜面试管中，在30℃下培育3天，结果全部接种成功。然后将此12个斜面菌种分别接种于装有米曲霉菌(Aspergillus oryzae)专用液体培养基(酐酪素4g，KH2PO4 0.36g，Na2HPO4·7H2O 1.1g，用水定容至1000mL)的三角瓶中进行扩大培养，用常规方法检测其酶活力，以LiY05为对照，检测结果见表1，从中挑选出酶活力较高的T002、T005、T007、T012四支斜面复壮菌种以及原用酿造酱油生产用菌株LiY05共5支，作为酱油试产实验用菌种。
表1 T001-T012的酶活力检测结果(单位/克)
  编号   T001     T002     T003     T004     T005   T006
  酶活力   15978.96     17568     15999     11196     15472.3   19073.57
  编号   T007     T009     T010     T012     LiY05
  酶活力   15178.8     18617.02     16720.25     19887.13     17422
4、三角瓶菌种的扩大培养
将步骤3挑选出酶活力较高的T002、T005、T007、T012四支斜面复壮菌种以及原用酿造酱油生产用菌株LiY05接种于装有米曲霉菌(Aspergillus oryzae)专用液体培养基的三角瓶中进行培养，在30℃下培育3天，结果全部培养成功。并对各菌种进行了感官、菌丝镜检、酶活力测定，结果菌落呈圆形，质地疏松，初期菌落中间白色，四周边缘呈透明射线状。菌落刚形成时，仅中间一点呈白色，以后随菌落长大，白色范围也逐渐扩大，而透明的范围从一片缩小成边缘一狭环状。随菌落长大，菌落的中心点先呈黄绿色，然后黄绿色向四周扩展。成熟菌落为黄宰色，有时为淡绿宰色。7-10天可达6cm左右，分生孢子头为放射形，顶囊近视球形，直径一般为40-50μm，有梗茎。该菌株的孢子形成能力约为5.55×109/g，发芽率约为32.51％。具有较高的蛋白酶活力，酸性蛋白酶活约为142.5u/g(发酵物)，中性蛋白酶活约为2227.67u/g(发酵物)，碱性蛋白酶活约为62.09u/g(发酵物)。
5、种曲的试产
在与步骤4相同的培养载体及培养条件下，同时对T002、T005、T007、T012及LiY05进行种曲的试产，以T011为对照，在30℃下培育3天，结果上述菌种的种曲全部试产成功。同时对上述种曲进行了酶活力检测及感官评定，酶活力检测结果见表2，其中以T012的种曲最佳，其酶活力达到19716单位/克，孢子数为150亿/克，色泽翠绿，曲香浓厚，手感均匀疏松，特别适合于生产酿造酱油。
表2  种曲的酶活力检测结果(单位/克)
  编号   T002   T012   T005   T007   LiY05     T011
  酶活力   15941.14   19716.28   9912   11856  12084.59     8200
6、酱油生产用曲的第一阶段试产
现对T002、T005、T007、T012及LiY05种曲进行试产，以T011为对照，以检测其对通风制曲生产工艺的适应情况，及在原料大豆、面粉中的生长、繁殖情况。其中，通风制曲过程中种曲的食盐浓度见表1，在30℃下培育3天；发酵时统一用料量为大豆1650kg/天，面粉600kg/天，在30℃下发酵80-90天。
表3  种曲的盐浓度
    拌种 种曲     盐浓度(g/100mL)     池号
    T002     22.72     B08-3
    T012     21.64     B08-4
    T007     21.96     B07-5
    T005     22.31     B07-3
    LiY05     21.83     B07-4
1)通风制曲结果分析
经太空育种的米曲霉菌种与LiY05菌种相比，感官上有以下几方面的不同：
第一，经太空育种的4个菌种，在种曲生产过程中无需作特别处理，即在原种曲生产工艺的基础上，完全可以正常生产。
第二，太空育种的各种曲与LiY05种曲相比，生长情况总体差别不大，但最后成熟的种曲，无论是种曲的颜色、菌丝着生、孢子量等差别比较大，分析原因，在种曲制作过程中的管理工作对结果也有一定影响。在试产通风制曲过程中发现，经太空育种的四个种曲，孢子萌发期都较LiY05种曲早4-5个小时，菌丝旺盛期(指第一次翻曲的时间)提前了3-5小时，这样T种(太空育种的各个种曲)在通风制曲过程中的成熟时间都提前了，在第20-24个小时已发现孢子着生，曲料开始变黄，LiY05种曲晚5-6小时才发现曲料开始转黄，所以从感官上讲T种各成曲孢子量较大，特别是T012成曲孢子飞扬，色泽黄绿，偏深黄。但是酱油生产制曲的最终目标是使米曲霉在原料(大豆、面粉)中生长繁殖，是要曲霉产生大量的蛋白酶和淀粉酶，所以成曲中菌丝的着生情况亦很重要，若单追求孢子多，而忽视菌丝是否生长旺盛就不全面了。曲香浓、手感松、结块好、孢子着生不很久的成曲才是理想的成曲。
上述试产结果表明T012菌种的适温较强，能在32-38℃下生长正常，孢子萌发期比LiY05缩短近4个小时，用此种曲制曲，将使制曲时间从36小时缩短为30-32小时，可节约近10％的能耗，尤其适用于酿造酱油的生产(但这仅是一次试产的感官和检测，偶然性极高，到底哪一种菌种好，可作为优选的酿造酱油生产用种曲，哪一个差将被淘汰，尚需多次实验对比才可决定)。
2)制醪发酵结果分析
原担心用成曲发酵的酱油颜色问题，在发酵过程中发现，T种制醪发酵24小时时已有颜色(黄色主色)，且较LiY05种曲深，经加热处理后不会变黑，证明并非是黑色素。经6天发酵红色素已产生，估计对酱油色泽影响不大，但在10多天初步发酵过程中，氨基酸生成过快，总酸偏高，但食盐含量正常，分析造成总酸偏高的原因，可能和天气状况不好有关，这一点要密切注意。
发酵终结后，检测用T种和LiY05种制备的酱油的感观特征、理化指标及微生物指标，结果T种制备的酱油呈红褐色，有光泽，澄清，酱香纯厚，滋味鲜美，咸淡适口；氨基酸肽氮含量≥1.8g/100mL；菌落总数(个/mL)≤2000，大肠杆菌(个/100mL)≤20，符合酿造酱油国家标准。LiY05种制备的酱油呈也符合酿造酱油国家标准，但是氨基酸肽氮含量≥1.4g/100mL。上述试产结果表明本发明太空育种的米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiT05 CGMCC No.1712适用于酿造酱油的生产。
实施例3、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiT05 CGMCC No.1712的第二阶段试产
用与实施例2相同的条件对米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiT05 CGMCC No.1712进一步进行试产，包括以下步骤：
一、三角瓶扩大培养
将实施例1复壮的米曲霉菌LiT05再次接种于斜面试管中，在30℃下培育3天，然后将斜面菌种分三批(每批间隔1-3天)接种于装有米曲霉菌(Aspergillus oryzae)专用液体培养基的三角瓶中扩大培养，不同批次的扩大培养时间见表4，扩大培养后的三角瓶菌种，菌丝呈白色，并长满绿黄色孢子，轻轻摇瓶感觉蓬松，孢子可脱落飞扬，三批感觉差异不大，孢子数检测结果为101.12亿/克。同时检测了酶活力，酶活检测结果见表4，不同批次的种曲都具有较高的酶活，但存在一定差距。
表4  扩大培养的米曲霉菌LiT05的酶活检测结果
    批次     菌种编号   酶活力(单位)     备注
  1(4月15日)     T-1三角瓶     15978.96   试产2天种曲
  2(4月19日)     T-2三角瓶     16532.0   试产2天种曲
  3(4月21日)     T-3三角瓶     15918.0   试产1天种曲
二、生产用种曲试产
分五批(编号T-00-1～T-00-5)对上述不同批次的米曲霉菌LiT05种曲进行试产，连续交叉投料10天，具体安排如下：
4月15日种曲：T-00-1、T-00-2试产各二天种曲，4月18日完成；
4月19日种曲：T-00-3、T-00-4试产各二天种曲，4月21日完成；
4月21日种曲：T-00-5试产各一天种曲，4月24日完成。
分别使用4月15日、4月19日、4月21日在相同条件下制作的三批三角瓶种曲，进行试产。三批成熟的种曲从感官上分析，种曲色泽黄绿，孢子着生情况好。试产结果都感觉曲香浓厚，手感轻，蓬松，手轻触种曲孢子立即脱落飞扬，三批种曲都是优质种曲。对成熟后的三批种曲进行了酶活力、孢子数检测。检测方法按中华人民共和国专业标准(孢子数测定法ZBx66028-87，蛋白酶活力测定法SBx.10317-1999)进行，检测结果见表5，三批种曲的酶活力及孢子数均较高。
表5三批成熟种曲的酶活力、孢子数检测结果
Figure C20061001211500081
三、通风制曲试产
从4月26日开始，采用隔天交叉投料的方法对五批(编号T-00-1～T-00-5)米曲霉菌LiT05种曲进行通风制曲试产，并检测酶活力，酶活检测结果见表6，制备的成曲的酶活均较高，但不同批次存在差异。
表6  由五批米曲霉菌LiT05种曲制备的成曲的酶活力
    批次编号     投料时间     出曲时间     酶活力
  T-00-1   4.26   4.28   1523.38
  T-00-2   4.28   4.30   1302.33
  T-00-3   4.30   5.2   1270.60
  T-00-4   5.2   5.4   1522.30
  T-00-5   5.4   5.6
感官上看，上述五批米曲霉菌LiT05种曲制得的成曲颜色都较鲜艳，无异常情况，成曲手感轻，菌丝结块好，孢子着生好，但个别曲料因翻曲破碎不细，所以造成成曲中有直径4-6cm硬的颗粒，致使菌丝、孢子无法深入着生，虽对成曲的质量影响不大，但应注意。
制曲后期温度偏高，曲料表面生长虽然良好，但曲料底层水份感觉不够，因温度偏高水分发挥过快，造成曲料有收缩裂纹的现象，而裂纹又没有经常压紧，造成风从裂纹中跑掉，影响了裂纹周边的供风与成曲质量，可通过降低后期制曲温度以及加强补水进行解决此问题，以保证成曲的质量。
在上述通风制曲过程中，不同批次的米曲霉菌LiT05种曲的孢子萌发、菌丝生成、孢子再生过程都较快，比LiY05种曲快4-8小时，制曲时间可由原来的36-40小时缩短为30-32小时，使能耗降低约20％。
四、制醪发酵
发酵终结后，发酵终结后，检测各个批次LiT05制备的酱油的感观特征、理化指标及微生物指标，结果不同批次的酱油均呈红褐色，有光泽，澄清，酱香纯厚，滋味鲜美，咸淡适口；氨基酸肽氮含量≥1.8g/100mL；菌落总数(个/mL)≤2000，大肠杆菌(个/100mL)≤20，符合酿造酱油国家标准。表明本发明太空育种的米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiT05 CGMCC No.1712适用于酿造酱油的生产。

Claims (2)

1、米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiT05，其特征是所述米曲霉菌的保藏号为CGMCC No.1712。
2、权利要求1所述的米曲霉菌(Aspergillus oryzae)LiT05 CGMCC No.1712在生产酿造酱油中的应用。
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