CN103740602B - 一株米曲霉prb-1菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株米曲霉（<i>Aspergillus</i><i>？oryzae</i>）PRB-1菌株。所述米曲霉PRB-1菌株是从广东珠江桥生物科技股份有限公司的酱油种曲中复壮、分离、纯化获得。该菌株已于2013年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO：M？2013628。本发明所述菌株生长繁殖力强，菌丝生长旺盛，遗传稳定性好，该菌株制备的成曲色泽鲜绿，孢子丰富，孢子发芽率高，蛋白酶活高，发酵酱油产量高、质量好。本发明的菌株将在酿造酱油中发挥重要作用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域。更具体地，涉及一株米曲霉PRB-1菌株。
背景技术
酱油属于传统发酵调味食品，菌种是发酵的基础，其性能对酱油产量和质量影响甚大。米曲霉（Aspergillus oryzae）是酿造酱油中必不可少的微生物，也是酿造酱油生产过程中的核心技术。酱油酿造主要依赖于米曲霉所产生的丰富的酶系，来分解原料中的多种成分，从而形成酱油独特的色、香、味、体。酱油生产米曲霉菌种的生产性能决定了酱油的品质及原料利用率，优良米曲霉菌种的选用能够提高原料的利用率，缩短发酵周期，降低生产成本，提高酱油的风味和品质，因此，酱油酿造选育优良的米曲霉菌株至关重要，它关系到酱油的产量和质量。
目前，我国酱油酿造企业90%以上使用的是米曲霉（Aspergillus oryzae）沪酿3.042，该菌种具有生长快、产孢子多、酶系丰富、中性蛋白酶活性高等优点，是酱油酿造的主要菌种。然而，随着发酵时间的延长，其蛋白酶活力迅速下降，导致酿造酱油的原料蛋白利用率和氨基酸转化率偏低，产品风味较弱。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有用于酿造酱油的米曲霉的不足，提供一株优良的、孢子丰富、蛋白酶活高、发酵酱油产量高、质量好的米曲霉菌株。
本发明的另一目的是提供所述米曲霉PRB-1菌株的培养方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一株米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株，所述菌株为米曲霉PRB-1菌株，该菌株于2013年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址为中国武汉市武汉大学），保藏编号为CCTCC NO：M 2013628。
所述的米曲霉PRB-1菌株属于曲霉目、曲霉科、曲霉属。
所述的米曲霉PRB-1菌株的形态学特征描述如下：
菌落呈圆形，质地疏松，菌落中间部位着生孢子多，孢子粗壮，菌丝层厚；菌落生长初期小、白色、圆形，随着菌落的逐渐长大，白色范围也逐渐扩大，菌丝层变厚，菌落的中心开始着生浅黄绿色的孢子，然后浅黄绿色逐步向四周扩散；菌落成熟后孢子呈黄绿色，孢子粗壮，菌丝层厚。
上述米曲霉PRB-1菌株是从广东珠江桥生物科技股份有限公司的酱油种曲中，经过大量的复壮筛选、分离、纯化获得的。
具体地，本发明所述米曲霉PRB-1菌株的分离获得方法如下：
S1.分离复壮：取广东珠江桥生物科技股份有限公司酿造酱油种曲，无菌操作，制备成孢子悬液，按照10倍梯度稀释法，分别用无菌生理盐水将孢子悬液稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度，得孢子稀释液；取所述孢子稀释液涂布于复壮分离培养基平板上进行培养；挑选其中菌落生长快、透明圈大、菌落大、孢子多的菌株进行进一步的纯化；
S2.纯化：将S1挑选的菌落生长快、透明圈大、菌落大、孢子多的单菌落孢子接种于改良豆汁固体培养基上进行培养，待长出单菌落，即获得纯菌株；
S3.鉴定：根据菌株的形态学特征进行初步鉴定，所述米曲霉菌株的形态学特征描述如下：
菌落呈圆形，质地疏松，菌落中间部位着生孢子多，孢子粗壮，菌丝层厚；菌落生长初期小、白色、圆形，随着菌落的逐渐长大，白色范围也逐渐扩大，菌丝层变厚，菌落的中心开始着生浅黄绿色的孢子，然后浅黄绿色逐步向四周扩散；菌落成熟后孢子呈黄绿色，孢子粗壮，菌丝层厚；
S4.筛选：对上述培养得到的纯菌株进行扩大培养以及生产试产，筛选出一株生长速度快，种曲和成曲的孢子丰富，孢子发芽率高，蛋白酶活最高的菌株。该菌株命名为米曲霉PRB-1菌株，已于2013年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2013628，保藏地址为中国武汉市武汉大学。
其中，S1所述的复壮分离培养基平板为酪蛋白豆汁平板，其配制方法为：称取干酪素4g，KH2P04 0.36g，无水MgSO4 0.50g，Na2HPO4 1.07g，大豆提取物2.0g，琼脂粉20.0g，溶于1000mL蒸馏水，调pH值至 6.5～7.0，分装，0.1MPa、121℃灭菌20min。
优选地，S1所述培养的条件是30～38℃培养50～72h ，更优选地是32℃培养72h，培养过程中观察记录菌落生长快慢情况、菌落大小及透明圈大小。
S2所述改良豆汁固体培养基的配方为：
按照1～2kg黄豆/L水的比例准备黄豆和水，将黄豆煮烂，过滤后取滤液，用水定容得到豆汁；分别在豆汁中加入0.50g/L的无水MgSO4、1.50g/L的K2HPO4、1.00g/L的Na2HPO4、10.0g/L的可溶性淀粉、20.0g/L的琼脂粉，调pH值至6.5～7.0；分装，0.1MPa、121℃灭菌20min。优选地，所述过滤的孔径为50～100目，所述煮烂的时间为1～2h。
优选地，S2所述培养的温度为30～38℃，优选为32℃。
优选地，本发明还提供了所述米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株的培养方法，包括以下步骤：
S1.一级菌种扩大培养：将米曲霉PRB-1菌株的孢子接种到改良豆汁固体培养基上，培养至成熟即得到成熟的一级菌种孢子。可于4～10℃保存；
S2.二级菌种扩大培养：将成熟的一级菌种孢子接种到改良麸皮固态培养基上，培养至成熟即得到成熟的二级菌种孢子。可于4～10℃保存；
S3.三级菌种扩大培养，将成熟的二级菌种孢子接种到改良麸皮固态培养基上，培养至成熟。可于4～10℃保存。
其中，S1所述改良豆汁固体培养基的配方同前所述。
优选地，S1、S2或S3所述培养至成熟的培养条件为30～38℃培养50～72h。
更优选地，S1、S2或S3所述培养至成熟的培养条件为32℃培养72h。
1.S2或S3所述改良麸皮固态培养基的配制方法为：按照麸皮：面粉的质量比为1～4.5:1称取麸皮和面粉，混匀，加入水和/或豆汁搅拌均匀，灭菌即得；
所述水和/或豆汁的加入量是，以麸皮、面粉与水和/或豆汁的总质量计，水和/或豆汁占总质量的40～60%。水和豆汁配合使用时，两者的比例不做严格限定。
所述豆汁的制备如前所述。
所述水优选采用蒸馏水。
经过大量的试产试验结果证实，本发明所述米曲霉PRB-1菌株生长繁殖力强，菌丝生长旺盛，遗传稳定性好。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株新的米曲霉PRB-1菌株，该菌株生长繁殖力强，菌丝生长旺盛，遗传稳定性好，由该菌株制备得到的成曲色泽鲜绿，孢子丰富，孢子发芽率高，蛋白酶活高，发酵酱油产量高、质量好。所述米曲霉PRB-1菌株生产酱油种曲的孢子数可达到162亿个/克（干基），发芽率高达98.9%，中性蛋白酶活力可达到11880U/克干基（福林法）。所述米曲霉PRB-1菌株在酿造酱油方面具有非常大的生产价值，应用前景广阔。
另外，米曲霉PRB-1菌株在成曲阶段的生长速度明显较其它菌株快，成曲菌丝旺盛，曲香浓，孢子着生均匀，该菌株对温度的适应性较强，能够在30℃～38℃正常生长，制曲时间从原来的44h，缩短为34～36h，使用该菌株进行生产能够显著地节约能源，特别适用于目前倡导的低碳、节约、绿色环保的生产模式。
附图说明
图1为米曲霉PRB-1菌株在酪蛋白豆汁平板上的单菌落形态。
图2为米曲霉PRB-1菌株的成熟斜面菌种形态。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。
实施例1 米曲霉菌株的分离与鉴定
1、实验材料和条件
（1）广东珠江桥生物科技股份有限公司酿造酱油种曲。
（2）培养基：酪蛋白豆汁培养基、改良豆汁固体培养基。
酪蛋白豆汁培养基的配制方法为：称取干酪素4g，KH2P04 0.36g，无水MgSO4 0.50g，Na2HPO4 1.07g，大豆提取物2.0g，琼脂粉20.0g，溶于1000mL蒸馏水，调pH值至 6.5～7.0，分装，0.1MPa、121℃灭菌20min。
改良豆汁固体培养基的配制方法为：按照1～2kg/L的比例，称取黄豆，煮烂，过滤后取滤液，用蒸馏水定容得豆汁；分别在豆汁中加入0.50g/L的无水MgSO4、1.50g/L的K2HPO4、1.00g/L的Na2HPO4、10.0g/L的可溶性淀粉、20.0g/L的琼脂粉，调pH值至6.5～7.0；分装，0.1MPa、121℃灭菌20min。优选地，所述过滤的孔径为50～100目，所述煮烂的时间为1～2h。
（3）无菌操作条件：所有器皿和用具均须经高压灭菌锅灭菌（121℃，30min），接种等操作均在无菌环境内进行。
2、米曲霉PRB-1菌株的分离与鉴定
（1）分离复壮：广东珠江桥生物科技股份有限公司酿造酱油种曲，无菌操作，制备成孢子悬液，按照10倍梯度稀释法，分别用无菌生理盐水将孢子悬液稀释到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的浓度，得孢子稀释液。
分别取0.1～0.2mL上述孢子稀释液涂布于复壮分离培养基平板上，32℃培养72h，培养过程观察记录菌落生长快慢情况、菌落大小及透明圈大小。整个过程共观察记录106个单菌落。
挑选其中12个菌落生长快、透明圈大、菌落大、孢子多的菌株，记为PRB-1～PRB-12，对这12个菌株进行进一步的纯化。
其中，所述的复壮分离培养基平板为酪蛋白豆汁培养基。
（2）纯化：分别挑取上述12个菌落接种于改良豆汁固体斜面培养基上，32℃培养，待长出单菌落，即获得纯菌株。
（3）鉴定：根据菌株的形态学特征进行初步鉴定。
所述米曲霉菌株的形态学特征描述如下：
菌落呈圆形，质地疏松，菌落中间部位着生孢子多，孢子粗壮，菌丝层厚；菌落生长初期小、白色、圆形，随着菌落的逐渐长大，白色范围也逐渐扩大，菌丝层变厚，菌落的中心开始着生浅黄绿色的孢子，然后浅黄绿色逐步向四周扩散；菌落成熟后孢子呈黄绿色，孢子粗壮，菌丝层厚。
实施例2 米曲霉PRB-1菌株的获得
1、米曲霉PRB-1菌株的筛选
对实施例1得到的12个单菌落进行扩大培养以及生产试产，筛选高产的米曲霉菌株。
（1）三角瓶菌种的扩大培养
筛选出的12个菌株接种到装有改良麸皮固态培养基的三角瓶中，进行三角瓶扩大培养，在32℃条件下培养72h至成熟，成熟菌种孢子旺盛，色泽鲜绿，疏松均匀。培养成熟后，检测孢子数、发芽率和中性蛋白酶活，结果如表1所示。
所述改良麸皮固态培养基的配制方法为：按照麸皮：面粉=1～4.5:1（w/w）称取麸皮和面粉，混匀，用40～60%（w/w）的蒸馏水和/或豆汁补足，搅拌均匀，灭菌即得。所述豆汁是按照1～2kg/L的比例，称取黄豆，煮烂，过滤后取滤液，用蒸馏水定容得到。蒸馏水和豆汁配合使用时，两者的比例不做严格限定。
表1
由表1可以看出，米曲霉PRB-1菌株的发芽率、孢子数和中性蛋白酶活的指标都最高。
（2）种曲的制备
对实施例1得到的12个单菌落进行制备种曲进行性能的筛选。
种曲的培养条件及培养基的配方同（1）所述，进一步的扩大培养，培养时间为72h，种曲色泽鲜绿，疏松均匀，孢子旺盛。
检测发芽率、孢子数和中性蛋白酶活。结果显示，各指标水平与三角瓶扩大培养阶段一致，PRB-1菌株在发芽率、孢子数和中性蛋白酶活的指标都最高。
（3）大豆曲的制备
大量实验和实际生产结果显示，利用本发明所述米曲霉PRB-1菌株，按照本领域常规的制曲原料和方法均能够制备出各指标都非常优良的成曲。本实施例以黄豆和面粉为原料，采用通风制曲的方法，对筛选出的12个菌株进行大豆曲的制曲试验。为了方便说明，本实施例所用原料质量配比为黄豆：面粉=7：3。
中性蛋白酶活的检测结果如表2所示。
表2
从表2的数据也可以看出，米曲霉PRB-1菌株在制曲阶段的蛋白酶活最高，优势明显。
另外，结果显示，米曲霉PRB-1菌株在大豆曲阶段的生长速度明显较其它米曲霉菌株快，制曲成曲菌丝旺盛，曲香浓，孢子着生均匀，该菌株对温度的适应性较强，能够在30℃～38℃正常生长，制曲时间从原来的44h，缩短为34～36h，使用该菌株进行生产能够显著地节约能源，特别适用于目前倡导的低碳、节约、绿色环保的生产模式。
综上所述，经过一系列菌种扩大培养以及生产试产，从12个菌株中筛选出一株生长速度快，种曲和成曲的孢子丰富，孢子发芽率高，蛋白酶活高的菌株。命名为米曲霉PRB-1菌株，该菌株已于2013年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2013628，保藏地址为中国武汉市武汉大学。
所述米曲霉PRB-1菌株的形态学特征描述如下：
菌落呈圆形，质地疏松，菌落中间部位着生孢子多，孢子粗壮，菌丝层厚；菌落生长初期小、白色、圆形，随着菌落的逐渐长大，白色范围也逐渐扩大，菌丝层变厚，菌落的中心开始着生浅黄绿色的孢子，然后浅黄绿色逐步向四周扩散；菌落成熟后孢子呈黄绿色，孢子粗壮，菌丝层厚。
米曲霉PRB-1菌株在酪蛋白豆汁平板上的单菌落形态如附图1所示；米曲霉PRB-1菌株的成熟斜面菌种形态如附图2所示。
实施例3 米曲霉PRB-1菌株的传代稳定性
将米曲霉PRB-1菌株接种于改良麸皮固态培养基的三角瓶中，32℃进行培养，传代10代，检测发芽率、孢子数和中性蛋白酶活。
所述改良麸皮固态培养基的配制方法同前所述。
所述发芽率、孢子数和中性蛋白酶活的检测方法均为本领域常规方法。
结果分别如表3～表5所示。
表3 米曲霉PRB-1传代发芽率检测
从表3可以看出，传代10代，各三角瓶中米曲霉PRB-1菌株的发芽率全部在96.0%以上，发芽率稳定。
表4 米曲霉PRB-1传代孢子数检测
从表4可以看出，传代10代，各三角瓶中米曲霉PRB-1菌株的孢子数全部在150亿个/克干基以上，孢子数稳定。
表5 米曲霉PRB-1传代中性蛋白酶活检测结果
从表5的数据可以看出，传代10代，各三角瓶中米曲霉PRB-1菌株的中性蛋白酶活均不低于11000U/g干基，中性蛋白酶活稳定。
实施例4 米曲霉PRB-1菌株在酱油生产中的应用
米曲霉PRB-1菌株进行5批次的制醪发酵，采用大罐进行高盐稀态发酵，按照国家标准（GB-18186酿造酱油）进行酱油发酵和指标检测，发酵时间60天，过滤头油，检测氨基酸态氮指标，并对感官质量进行鉴定，结果如表6所示。
表6
如表6所示，5个批次酱油的氨基酸态氮指标全部超过1.2g/100mL，超过酿造酱油特级标准的要求，且感官质量稳定，达到酿造酱油特级标准的感官质量要求。
另外，微生物指标、卫生指标全部符合国家标准的要求，充分表明了利用米曲霉PRB-1菌株酿造酱油的各项指标都非常优良。
Claims (8)
1.一株米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株，其特征在于，所述菌株为米曲霉PRB-1菌株，该菌株于2013年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2013628。
2.根据权利要求1所述米曲霉菌株，其特征在于，所述的米曲霉PRB-1菌株属于曲霉目、曲霉科、曲霉属。
3.根据权利要求1所述米曲霉菌株，其特征在于，所述的米曲霉PRB-1菌株的形态学特征描述如下：
菌落呈圆形，质地疏松，菌落中间部位着生孢子多，孢子粗壮，菌丝层厚；菌落生长初期小、白色、圆形，随着菌落的逐渐长大，白色范围也逐渐扩大，菌丝层变厚，菌落的中心开始着生浅黄绿色的孢子，然后浅黄绿色逐步向四周扩散；菌落成熟后孢子呈黄绿色，孢子粗壮，菌丝层厚。
4.一种权利要求1～3任一项所述米曲霉菌株的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.一级菌种扩大培养：将米曲霉PRB-1菌株的孢子接种到改良豆汁固体培养基上，培养至成熟即得到成熟的一级菌种孢子；
S2.二级菌种扩大培养：将成熟的一级菌种孢子接种到改良麸皮固态培养基上，培养至成熟即得到成熟的二级菌种孢子；
S3.三级菌种扩大培养，将成熟的二级菌种孢子接种到改良麸皮固态培养基上，培养至成熟；
其中，步骤S1所述改良豆汁固体培养基的配制方法为：
S11.制备豆汁：按照1～2kg黄豆/L水的比例准备黄豆和水，将黄豆煮烂，过滤后取滤液，用蒸馏水定容；
S12.分别在豆汁中加入0.50g/L的无水MgSO4、1.50g/L的K2HPO4、1.00g/L的Na2HPO4、10.0g/L的可溶性淀粉、20.0g/L的琼脂粉，调pH值至6.5～7.0，灭菌处理即得；
步骤S2或S3所述改良麸皮固态培养基的配制方法为：按照麸皮：面粉的质量比为1～4.5:1称取麸皮和面粉，混匀，加入水和/或豆汁搅拌均匀，灭菌即得；
所述水和/或豆汁的加入量是：以麸皮、面粉与水和/或豆汁的总质量计，水和/或豆汁占总质量的40～60%；
所述豆汁是按照1～2kg黄豆/L水的比例准备黄豆和水，将黄豆煮烂，过滤后取滤液，用水定容得到。
5.根据权利要求4所述米曲霉菌株的培养方法，其特征在于，S1、S2或S3所述培养至成熟的培养条件为30～38℃培养50～72h。
6.根据权利要求4所述米曲霉菌株的培养方法，其特征在于，S1、S2或S3所述培养至成熟的培养条件为32℃培养72h。
7.根据权利要求4所述米曲霉菌株的培养方法，其特征在于，S11所述煮烂的时间为1～2h。
8.根据权利要求4所述米曲霉菌株的培养方法，其特征在于，S11所述过滤的孔径为50～100目。
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