CN109971653A - 一种金针菇退化菌种的快速复壮方法 - Google Patents

一种金针菇退化菌种的快速复壮方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种金针菇退化菌种的快速复壮方法，包括步骤：退化菌种的转接、子实体诱导、复壮菌种的获得、复壮菌种检测；本发明对金针菇退化菌种进行复壮操作，将得到的复壮菌种与退化菌种进行栽培比较，恢复了原本的农艺性状或性状更优即为复壮成功的金针菇菌种。本发明为金针菇退化菌种提供了一种复壮方法，该方法操作简便，复壮周期短、成本低、不易污染、复壮菌种性状优良，适用于金针菇退化菌种的快速提纯复壮。

Description

一种金针菇退化菌种的快速复壮方法
技术领域
本发明属于金针菇菌种技术领域，特别涉及一种金针菇退化菌种的快速复壮方法。
背景技术
金针菇(Flammulina velutipes(Fr.)Sing)学名毛柄金钱菌，又称毛柄小火菇、构菌、朴菇、冬菇等。金针菇是我国主栽菇种之一，也是当前我国工厂化生产规模最大的菇种，其口感脆嫩，营养丰富，深受消费者喜爱。菌种是食用菌生产的基础，直接关系到最终产品的产量、品质和效益。目前，金针菇生产菌种在PDA培养基中连续传代的过程中，会产生菌种活性的老化、退化等问题，主要表现为产量降低、出菇不齐、生育期延长等，生产企业不得不每隔3-6个月引进新的菌种，严重影响了整个行业的生产效益和稳定运行。如何有效地减缓菌种退化，保持菌种的优良性状已经成了产业亟需解决的问题。
中国专利文献CN107653218A公开了一种金针菇退化菌种的复壮方法，该方法包括：(1)退化菌丝的一次培养；(2)菌丝的二次培养；(3)菌丝单细胞提取；(4)菌丝细胞再生培养；(5)复壮菌丝检测。该方法需要经液体培养、溶壁酶处理获得单细胞原生质体以及再生培养获得。该方法技术复杂，存在后期单细胞培养物鉴定筛选的工作量较大等缺点，并且不同单细胞培养物所具有的优良性状具有偶然性。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种操作简便、污染率低、周期短、成功率高的金针菇退化菌种的快速复壮方法。
一种金针菇退化菌种的快速复壮方法，包括步骤：
(1)无菌培养皿中加入灭菌后的复壮培养基，制成培养基平板，培养基厚度为5-8mm，挑取金针菇退化菌种的菌丝接种到所述复壮培养基平板上，将接种后的培养基平板用封口膜封口置于恒温培养箱中进行培养，得到长满菌丝的平板菌落；
所述的复壮培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、玉米芯80-100g、麦麸80-100g、大豆浓缩蛋白2-4g、邻氨基苯甲酸4-6μg、核黄素40-60μg、琼脂20g，水1000mL；
(2)在步骤(1)得到的长满菌丝的平板菌落上打孔，然后用封口膜将培养基平板重新封口后置于恒温箱中进行子实体诱导培养至子实体形成，将培养获得的子实体进行组织分离，转接至分离培养基上于20-22℃下培养7-9天，即得复壮菌种；
所述分离培养基为马铃薯200g、葡萄糖20g、大豆浓缩蛋白2-4g、磷酸二氢钾0.8-1.5g、硫酸镁0.4-0.6g、琼脂20g，水1000mL。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述培养皿为直径为90mm标准规格的无菌培养皿；以直径为90mm培养皿计，挑取退化菌种的菌丝接种量为0.2-0.3cm2。
根据本发明优选的，步骤(1)中，接种后的培养基平板用封口膜封口1-2层。
根据本发明优选的，步骤(1)中复壮培养基中，所述玉米芯为玉米棒脱粒后剩余的穗轴，并经粉碎机粉碎至粒径1mm以下；大豆浓缩蛋白的粗蛋白含量≥65％质量百分比。
根据本发明优选的，步骤(1)中所述的培养条件为：20-22℃下避光培养9-10天。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的打孔为：用直径5-10mm的打孔器在菌落表面打若干个孔，每个孔间隔5-10mm。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的子实体诱导培养条件为：10-12℃下培养15-20天至菌落上分化出金针菇菇蕾，再转置6-8℃恒温箱中继续培养5-7天至菌落上金针菇子实体分化形成菌盖和菌柄。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述将培养获得的子实体进行组织分离是指选择条形整齐，个体高大、粗壮、菌盖较小未开伞的子实体，分离部位位于菌柄与菌盖的交接处。
根据本发明的方法，上述步骤(2)得到的复壮菌种继续按以下步骤(3)进行检测、验证：
步骤(3)：将步骤(2)得到的菌种挑取0.2-0.3cm2的菌丝移至保存培养基上培养，5-6天后选择生长速度快、菌丝浓白且镜检具有锁状联合的菌落继续培养2-3天至菌落快长满培养皿时，于菌落边缘挑取健壮菌丝到保存培养基上扩大培养，用于保存或生产。考察菌丝生长速度，并与退化菌种进行栽培比较，与退化菌种相比恢复了原本的农艺性状或性状更优，即为金针菇退化菌种复壮成功。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述保存培养基为马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、李子果肉18-22g、大豆浓缩蛋白2-4g、琼脂20g，水1000mL。
本发明的技术特点及有益效果：
1、本发明提供的复壮培养基通过添加适量的玉米芯、麦麸以及邻氨基苯甲酸、核黄素为子实体形成提供充足的营养，结合适宜的温度刺激，能够促进子实体转化，缩短了子实体形成周期。
2、本发明采用在密封、无菌容器中培养子实体，获得组织分离复壮材料，避免了常规开放式培养子实体分离材料易污染的弊端。
3、本发明为金针菇退化菌种提供了一种复壮方法，该方法相对于常规的由母种→原种→栽培种→专用菇房出菇栽培→获得子实体→组织分离等繁琐步骤获取子实体进行组织分离复壮的方法，周期缩短了20-30天，操作更为简便，成本更低，适用于金针菇退化菌种的快速提纯复壮。
4、本发明与常规的菌丝尖端复壮法、原生质体组织培养复壮法相比，具有可操作性强、提纯复壮成功率高、易于筛选、重复性好的优点，具有良好的应用前景。
附图说明：
图1为实施例1中金针菇退化菌株在复壮培养基上诱导形成的子实体。
图2为金针菇退化菌株栽培的子实体形态图片。
图3为实施例1中复壮后的金针菇菌株栽培的子实体形态图片。
图4为对比例1中复壮后的金针菇菌株栽培的子实体形态图片。
图5为对比例2中复壮后的金针菇菌株栽培的子实体形态图片。
图6为对比例3中复壮后的金针菇菌株栽培的子实体形态图片。
具体实施方式：
本发明所涉及原料无特殊限定，采用市售商品即可。
封口膜为市售的Parafilm封口膜。
下面结合实施例对本发明做进一步说明，实施例中未详加说明的接种、培养、发菌、出菇管理等均按本领域金针菇栽培的现有技术。
实施例1
一种金针菇退化菌种的快速复壮方法，包括以下步骤：
退化菌种的转接：在直径90mm标准规格的无菌培养皿中加入灭菌后的复壮培养基，制成厚度为7mm培养基平板，挑取0.3cm2的退化菌种菌丝接种到复壮培养基平板上，将接种后的培养基平板用封口膜封口1层后置于恒温培养箱中，22℃下避光培养9天，得到长满菌丝的平板菌落；
所述复壮培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、玉米芯100g、麦麸100g、大豆浓缩蛋白3g、邻氨基苯甲酸5μg、核黄素50μg、琼脂20g，加水定容至1000mL。
子实体诱导：用直径为5mm的打孔器在长满菌丝的平板菌落上随机打孔，每个圆孔相隔5mm。平板菌落上打孔后用2层封口膜将培养皿重新封口，然后置于12℃的恒温箱中培养15天，至菌落上分化出金针菇菇蕾；再转置于8℃的恒温箱中继续培养6天至菌落上金针菇子实体分化出菌盖和菌柄。
复壮菌种的获得：将培养获得的子实体进行组织分离，转接至分离培养基上，22℃下培养7天即可获得复壮菌种；其中，所述子实体选自条形整齐，个体高大、粗壮、菌盖较小未开伞的子实体，分离部位为菌柄与菌盖交接处；
所述分离培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、大豆浓缩蛋白3g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、琼脂20g，水1000mL。
复壮菌种检测：挑取0.3cm2的复壮菌种菌丝接种至保存培养基上培养，6天后选择生长速度快、菌丝浓白且镜检具有锁状联合的菌落，继续培养2天后转接健壮菌丝到新的保存培养基保存或用于生产；
所述保存培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、李子果肉20g、大豆浓缩蛋白2g、琼脂20g，水1000mL。
实施例2
一种金针菇退化菌种的快速复壮方法，包括以下步骤：
退化菌种的转接：在直径90mm标准规格的无菌培养皿中加入灭菌后的复壮培养基，制成厚度为8mm培养基平板，挑取0.2cm2的退化菌种菌丝接种到复壮培养基平板上，将接种后的培养基平板用封口膜封口2层后置于恒温培养箱中，22℃下避光培养9天，得到长满菌丝的平板菌落；
所述复壮培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、玉米芯80g、麦麸80g、大豆浓缩蛋白3g、邻氨基苯甲酸5μg、核黄素50μg、琼脂20g，水1000mL。
子实体诱导：用直径为8mm的打孔器在长满菌丝的平板菌落上随机打孔，每个圆孔相隔10mm。平板菌落上打孔后用2层封口膜将培养皿重新封口，然后置于10℃的恒温箱中培养20天，至菌落上分化出金针菇菇蕾；再转置于8℃的恒温箱中继续培养7天至菌落上金针菇子实体分化出菌盖和菌柄。
复壮菌种的获得：将培养分化的子实体进行组织分离，转接至分离培养基上，22℃下培养7天即可获得复壮菌种；其中，所述子实体选自条形整齐，个体高大、粗壮、菌盖较小未开伞的子实体，分离部位为菌柄与菌盖交接处；
所述分离培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、大豆浓缩蛋白3g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、琼脂20g，水1000mL。
复壮菌种检测：挑取0.3cm2的复壮菌种菌丝接种至保存培养基上培养，6天后选择生长速度快、菌丝浓白且镜检具有锁状联合的菌落，继续培养2天后转接健壮菌丝到新的保存培养基保存或用于生产；
所述保存培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、李子果肉20g、大豆浓缩蛋白2g、琼脂20g，水1000mL。
对比例1
一种金针菇退化菌种的菌丝尖端复壮法，包括：
a、在培养皿中接入退化菌种，置于26℃下培养，直至菌丝萌发至2cm；
b、用接种工具切取菌丝尖端约2mm的菌丝置于培养基的平板上进行培养，直至菌丝萌发至2cm；
重复b所述的接种与培养共5次，得到复壮菌种。
上述b部分中培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g、琼脂20g、KH2PO4 3g、MgSO41.5g、玉米粉10g、麸皮50g，加水1000mL，pH自然。
对比例2
一种金针菇退化菌种的子实体组织分离复壮方法，包括
a、将退化菌种进行农法生产栽培获得子实体；
b、对栽培获得的子实体进行组织分离，得到复壮菌种。
上述a所述农法生产栽培为传统常规栽培方式，生产流程为：母种→固体原种→固体栽培种→栽培袋发菌培养→专用菇房出菇栽培→获得子实体。
对比例3
一种金针菇退化菌种的子实体组织分离复壮方法，包括
a、将退化菌种以工厂化生产模式进行栽培获得子实体；
b、对栽培获得的子实体进行组织分离，得到复壮菌种。
上述a所述工厂化生产栽培模式为目前工厂化主流栽培方式，生产流程为：母种→摇瓶液体菌种→发酵罐液体菌种→栽培瓶发菌培养→专用菇房出菇栽培→获得子实体。
实验例1
将实施例1、对比例1、对比例2、对比例3的复壮菌种以及退化菌种进行栽培试验。
采用工厂化瓶栽方式进行栽培，液体菌种接种，接种后避光、17℃、空气相对湿度60-65％条件下培养。菌丝满瓶后利用搔菌机进行搔菌、注水后移入出菇房，出菇管理同常规工厂管理。当子实体生长至14-15cm且菌盖将要开伞时采收、测定不同菌株生物学效率。
实施例1复壮菌种栽培的金针菇子实体(如图3所示)相比退化菌种栽培的金针菇子实体(如图2所示)和对比例1复壮菌种栽培的金针菇子实体(如图4所示)生长更为整齐，相比退化菌种生物转化率提高30％以上，相比对比例1生物转化率提高20％以上。实施例1复壮菌种栽培的金针菇子实体相比对比例2复壮菌种的生物转化率提高5％，与对比例3复壮菌种生物转化率相似。实施例1的复壮周期为35天，对比例1的复壮周期为30天，对比例2的复壮周期为137天，对比例3的复壮周期为81天，对比例1的复壮周期虽然最短，但其生物转化率最低，复壮效果最差；对比例2的复壮效果较好，但复壮周期最长，且其组织分离污染率最高，达到50％；对比例3的复壮效果与实施例相似，但其复壮周期明显长于实施例1，其组织分离污染率在10-20％，而实施例1没有污染。综合来说本发明的复壮方法能够实现快速复壮，并且复壮成功率更高。

Claims (10)

1.一种金针菇退化菌种的快速复壮方法，包括步骤：
(1)无菌培养皿中加入灭菌后的复壮培养基，制成培养基平板，培养基厚度为5-8mm，挑取金针菇退化菌种的菌丝接种到所述复壮培养基平板上，将接种后的培养基平板用封口膜封口置于恒温培养箱中进行培养，得到长满菌丝的平板菌落；
所述的复壮培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、大玉米芯80-100g、麦麸80-100g、豆浓缩蛋白2-4g、邻氨基苯甲酸4-6μg、核黄素40-60μg、琼脂20g，水1000mL；
(2)在步骤(1)得到的长满菌丝的平板菌落上打孔，然后用封口膜将培养皿重新封口后置于恒温箱中进行子实体诱导培养至子实体形成，将培养获得的子实体进行组织分离，转接至分离培养基上于20-22℃下培养7-9天，即得复壮菌种；
所述分离培养基为马铃薯200g、葡萄糖20g、大豆浓缩蛋白2-4g、磷酸二氢钾0.8-1.5g、硫酸镁0.4-0.6g、琼脂20g，水1000mL。
2.如权利要求1所述的金针菇退化菌种的快速复壮方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养皿为直径为90mm标准规格的无菌培养皿；以直径为90mm培养皿计，挑取退化菌种的菌丝接种量为0.2-0.3cm2。
3.如权利要求1所述的金针菇退化菌种的快速复壮方法，其特征在于，步骤(1)中，接种后的培养皿用封口膜封口1-2层。
4.如权利要求1所述的金针菇退化菌种的快速复壮方法，其特征在于，步骤(1)中复壮培养基中，所述玉米芯为玉米棒脱粒后剩余的穗轴，并经粉碎机粉碎至粒径1mm以下；大豆浓缩蛋白的粗蛋白含量≥65％质量百分比。
5.如权利要求1所述的金针菇退化菌种的快速复壮方法，其特征在于，步骤(1)中所述的培养条件为：20-22℃下避光培养9-10天。
6.如权利要求1所述的金针菇退化菌种的快速复壮方法，其特征在于，步骤(2)中所述的打孔为：用直径5-10mm的打孔器在菌落表面打若干个孔，每个孔间隔5-10mm。
7.如权利要求1所述的金针菇退化菌种的快速复壮方法，其特征在于，步骤(2)中所述的子实体分化培养条件为：10-12℃下培养15-20天至菌落上分化出金针菇菇蕾，再转置6-8℃恒温箱中继续培养5-7天至菌落上金针菇子实体分化形成菌盖和菌柄。
8.如权利要求1所述的金针菇退化菌种的快速复壮方法，其特征在于，所述将培养获得的子实体进行组织分离是指选择条形整齐，个体高大、粗壮、菌盖较小未开伞的子实体，分离部位位于菌柄与菌盖的交接处。
9.如权利要求1所述的金针菇退化菌种的快速复壮方法，其特征在于，步骤(2)得到的复壮菌种继续按以下步骤(3)进行检测、验证：
步骤(3)：将步骤(2)得到的菌种挑取0.2-0.3cm2的菌丝移至保存培养基上培养，5-6天后选择生长速度快、菌丝浓白且镜检具有锁状联合的菌落继续培养2-3天至菌落长满后，转接健壮菌丝到保存培养基上保存或用于生产；考察菌丝生长速度，并与退化菌种进行栽培比较，与退化菌种相比恢复了原本的农艺性状或性状更优，即为金针菇退化菌种复壮成功。
10.如权利要求9所述的复壮菌种检测，其特征在于，所述保存培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、李子果肉18-22g、大豆浓缩蛋白2-4g、琼脂20g，水1000mL。
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