JPS61212279A - あかぐされ病耐性の強い新しい品種の養殖海苔の作成方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産１上皇剋厘分立 本発明は、養殖海苔に多く発生するあかぐされ病に対し
強い耐性を有する品種の養殖海苔の作成方法に関する。

従来坐肢血迫宣員 養殖海苔に発生するあかぐされ病は、日本水産学会編「
のりの病気」　（恒星社原生閣発行）に記載されている
ように、藻菌類のｐｙｔｈｉｕｍ属に属するあかぐされ
病菌に起因する一病気であって、我国の各地の海苔漁場
に広く発生して海苔の品質や収量を低下させ、時には著
しい被害を惹起する病気の一つである。

あかぐされ病の病徴は、初め海苔葉体の所々に褪色した
小斑点がみられ、その後この斑点は急速に拡がって５〜
２０ＩＩＩｍ程度の赤サビ色の円形斑を示すようになる
。この病斑はその後縁黄色から淡黄色等になり、病斑の
中央部から次第に褪色してゆき、病勢が進むと罹病部は
海苔葉体の全面に及び、脱色した病斑部は次第に腐敗し
て脱落するに至る。

したがって、葉体の基部に罹病部がある場合は、葉体は
ヒビから脱落して流失し、その結果、病勢の進行が早い
ときは病気発生の初期から７〜１０日位の間にヒビが中
綿となってしまうことがある。

一方、このようなあかぐされ病の病原菌の菌学的性状及
びその生育環境要因や栄養要求についての研究報告がみ
られ、また、抗生物質、農薬及び界面活性剤による該病
原菌の菌糸の発育阻止効果についても一部で調べられて
いるが、養殖海苔の海面において上記のような薬剤を使
用することは好ましくないとの配慮から、あかぐされ病
に対する適切な予防法や治療法は未だ確立されていない
のが現状である。

因に、唯一の研究報告として野田はヒスチジン、メチオ
ニン、チロシンのようなアミノ酸によるあかぐされ病の
防除並びに治療効果を報告している（日本水産学誌、第
４５巻９号、１１５５〜１１６２）。

上述したような現況からみて、海苔養殖におけるあかぐ
され病の対策は重・要な課題である。

が”ンしようとする口　占 本発明者は、上述した現状に鑑み、あかぐされ病に対し
て本質的に耐性の強い品種の養殖海苔の作成について検
討した結果、さきに海苔のプロトプラスト化に成功した
ことに伴ない、細胞融合の手法を利用することにより、
本発明をなすに至った。

本発明者は、天然品種であって養殖に通さないマルバア
マノリ、及びスサビノリの突然変異種であるスサビグリ
ーンがあかぐされ病に対して強い耐性を有することを見
出し、これらの天然品種のプロトプラストを調製し、そ
の各プロトプラストを、養殖海苔のプロトプラストと細
胞融合させることにより、あかぐされ病耐性の強い形質
を養殖海苔に導入することに成功した。

また、上記マルバアマノリとスサビグリーンとの各プロ
トプラストを調製し、両者を細胞融合させることにより
、あかぐされ病耐性のくよい、かつ養殖に通した新しい
品種の海苔を得ることにも成功した。

すなわち、本発明は、細胞融合の手法を利用して、あか
ぐされ病耐性の強い品種の養殖海苔を作成するための方
法を提供することを目的とするものである。

以下本発明の詳細な説明する。

鬼皿■盪底 本発明の特徴は、あかぐされ病耐性の強い天然品種であ
るスサビグリーンもしくはマルバアマノリのプロトプラ
ストを調製し、一方養殖海苔のプロトプラストを調製し
、得られる両方のプロトプラストを細胞融合して細胞融
合体を形成し、ついで該細胞融合体を育成すること、及
び上記スサビグリーンとマルバアマノリの各プロトプラ
ストを調製し、得られる両方のプロトプラストを細胞融
合して細胞融合体を形成し、ついで該細胞融合体を育成
することにある。

７　占を　ｔするための 本発明で用いる天然品種（野生株）であるマルバアマノ
リは通称岩のりと呼ばれ、岩に付着して生育するもので
あるが、そき葉体はマル葉型を呈しく養殖海苔の葉体は
細葉型を呈する）密殖性であり、かつ成長率が低いため
、養殖には不適であって用いられない。

また、本発明において同様に用いるスサビグリーンはス
サビノリの突然変異品種であるが、フィコエリスリン色
素（赤色）欠損株であって葉体が緑色を呈するため養殖
には用いられていない。

ところが、マルバアマノリ及びスサビグリーンの性状等
について検討している過程で、この両者の品種は、在来
の養殖海苔に比べあかぐされ病に対して強い耐性の形質
を保有していることが、下記に示す実験結果により見出
された。

実験方法： あかぐされ病菌−うりより月　摂Ｖ枦すμ些−を新崎Ｂ
培地で２０℃で７日日培養し、生成したコロニー縁辺部
を切り取りシャーレ上に置き、軽く押しつぶした後、こ
れに滅菌半海水を加え遊走子を放出させる。この遊走子
４　Ｘ　１０’＋個（トーマ血球計算盤で計数）をシャ
ーレ内の人工海水２０ｍ　ｌに接種し、これにスサビグ
リーン、マルバアマノリ及び養殖海苔としてのアサクサ
ノリ及びスサビノリの各品種の海苔の葉体（１，０〜５
．０ｃｍ程度のサイズ）の５葉体宛を浸漬し、２０℃、
４０００Ｌｕｘ　（明朗９時間、晴朗１５時間）の条件
下で静置培養し、１０日間経日的に各葉体における感染
部位の数及び貫通細胞数を顕微鏡で観察した。ここで感
染とは上記菌の菌糸による貫通細胞が認められることを
基準としたものであり、また、貫通細胞数は菌糸が成長
する速度を示すものである。

上記実験結果は表１乃至３に示すとおりである。

表１ 注）感染確認日は各葉体中に１ケ所以上の感染部位を確
認した経過日数を示す。

表１乃至表３にみられるとおり、スサビグリーン及びマ
ルバアマノリが養殖海苔であるアサクサノリ及びスサビ
ノリに比べて、あかぐされ病に対する耐性の著しく強い
ことがわかる。

本発明では、上述したような従来養殖海苔には通さない
が、あかぐされ病に対する耐性の強いスサビグリーン及
びマルバアマノリに着目し、これらの海苔が保有するあ
かぐされ病耐性の形質を細胞融合の手法を利用して養殖
海苔へ導入することにより、あかぐされ病耐性の強い品
種の養殖海苔を作成するものであり、そのために、まず
、スサビグリーン並びにマルバアマノリのプロトプラス
トを調製する。

このプロトプラストの調製には、前述したように、本発
明者がさきに開発した方法（特願昭５８＝１４９３７８
又は特願昭５９−２２４１５）を通用して行なうとよい
０次に、これらの方法の概要を説明すると、前者の方法
は、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に属
する難消化性多ｔｉ類（マンナン、キシラン及びボルフ
イラン）の加水分解能を有する微生物（シュードモナス
ＳＰｍＰＴ−５，ｍ工研条寄ＮａＢＰ−３３０）を、海
苔もしくは海苔由来の多糖類（海苔を熱水抽出して可溶
性成分を除去して得られる、主としてマンナンもしくは
キシランのような多ｔａｉ類から成る残渣又は該残渣を
更に精製処理して多糖類含量を高めたもの）を誘導物質
とて含む培地中で培養して得られる培養液を遠心分離し
、その上澄液を酵素液として用いて海苔葉体を処理する
ことから成る。上記酵素液にはマンナン加水分解酵素と
キシラン加水分解酵素が含まれているので該酵素液を海
苔葉体に作用させるとマンナン加水分解酵素が海苔の表
面に存在する顆粒状のマンナンに作用して葉体に大きく
切断部を形成し、それによりキシラン加水分解酵素によ
り細胞壁を形成しているミクロフィブリル形態のキシラ
ンが作用され易くなって、葉体の細胞壁が分解除去され
てプロトプラスト化されるようになる。また、上記酵素
液にはボルフイラン分解酵素も含まれているので、海苔
葉体の細胞充間物質としてのボルフイランにも作用して
分解するのでプロトプラスト化が−そう促進される。

なお、上記プロトプラスト化に際して、海苔葉体を予め
パパインのようなプロテアーゼで処理するか、又は上記
酵素液と並行的にプロテアーゼを作用させると、更に効
果的である。

又、後者の方法は、海苔葉体を予めプロテアーゼ処理し
た後、β−１，３−キシラナーゼとβ−１，４−マンナ
ナーゼで処理するか、或はβ−１，３−キシラナーゼと
β−１，４−マンナナーゼ及びボルフイラナーゼとで処
理することから成るものであって、非常に短時間で、し
かも健全な海苔葉体のプロトプラストを調製し得る。

本発明においては、上述した方法によりスサビグリーン
並びにマルバアマノリのプロトプラストをそれぞれ調製
し、一方養殖海苔であるアサクサノリ並びにスサビノリ
のプロトプラストを同じく調製し、スサビグリーンもし
くはマルバアマノリの各プロトプラストと、アサクサノ
リもしくはスサビノリの各プロトプラストとを細胞融合
させる。

この細胞融合は公知の手法を通用して行なうとよく、上
記各２種のプロトプラストを混合して形成させた沈澱に
ポリエチレングリコール溶液とＨｉｇｈ−ｐＨ−Ｃａ熔
液を加えて放置した後、これに培養液（例えば人工海水
Ａｓｐ、　１２又はＰｒｏｖａｓｏｌｉの栄養添加海水
）を加えて培養を行なって融合体を形成する。なお、培
養は１５℃の温度で６０００Ｌｕｘの照度で明朗９時間
、晴朗１５時間の条件下で行なうとよい。

上述のようにして得られた細胞融合体（融合細胞）につ
いて下記の手順により識別（選別）を行なう。この識別
は、ＡとＢの２種のプロトプラストを細胞融合させた場
合、２種の細胞の融合体（ＡｘＢ）のほかに、同種の細
胞の融合体（ＢｘＢ及びＡＸＡ）及び融合しない細胞が
混在しているので、これらから２種の細胞の融合体（Ａ
ＸＢ）を選抜するために行なうものである。なお、上記
識別のための方法としては両者の細胞の形質マーカーに
ついて行なうとよく、それには下記のようにして品種組
合わせ別により行ない得るが、これに限るものでない。

細胞融合体の識別： この選抜は、アサクサノリとスサビノリの各葉体が細葉
型であるのに対して、マルバアマノリの葉体はマル葉型
であり、又、単胞子の放出時期での葉長は、アサクサノ
リが０．２〜１ｍｍ　、スサビノリが１０〜７０ｓ＋ｍ
及びマルバアマノリが０．５〜２３ａｍであってそれぞ
れ異なることを利用するものである。

すなわち、アサクサノリとマルバアマノリの細胞融合体
では細葉で１０ｍ５程度の葉長時に単胞子を放出するも
のを選抜するとよい。

また、直接的な選抜方法として、前記実験から明らかな
ように、マルバアマノリと養殖海苔とのあかぐされ病耐
性の顕著な差異を利用して、あかぐされ病菌を感染させ
感染部位のない細葉を選抜してもよい。

この場合には、３種の融合体とも細葉型であって、この
マーカーは利用し得ないので、葉体の色調の差異を利用
して選抜する。すなわち、アサクサノリとスサビノリは
いずれも黒茶色の葉色であるのに対し、スサビグリーン
は緑色の葉色であるので、黒茶色の葉色のものを選抜す
る。また、スサビノリのスサビグリーンの単胞子の放出
時期は同じであるので、この形質マーカーはスサビノリ
とスサビグリーンとの融合体には利用し得ないが、アサ
クサノリとスサビグリーンとの融合体には上記イ）のよ
うに利用することができ、黒茶色で数１０ｍｍの葉長に
おいて単胞子を放出するものを選抜するとよい。

なお、両者の組合わせにおいてイ）の場合と同様にあか
ぐされ病に対する耐性を利用して直接的に選抜すること
も可能である。

更に、細胞融合体の選抜法として上記イ）及び口）の方
法とは別に、細胞融合の処理直後に顕微鏡下で上記融合
に用いた２種のプロトプラストのそれぞれの色調の混在
した融合体を毛細管により選抜してもよい。例えば、ス
サビグリーンと上記養殖海苔ではそれらのプロトプラス
トの色調は前者が緑色で後者が黒茶色であるので、細胞
融合の処理段階で緑色と黒茶色が入混じった瞬間のプロ
トプラストを選抜するとよい。しかし、マルバアマノリ
と上記養殖海苔の場合は、両者井原茶色の葉色であるた
め、一方のプロトプラストを下記組成のニュートラルレ
ッドで染色したものを用いて細胞融合させ、上記と同様
にして黒茶色とニュートラルレツ１の赤色が入混じった
瞬間のプロトプラストを選抜するようにする。

ニュートラルレッドの組成： ニュートラルレッド　　１０ｍｇ 人工海水（Ａｓｐ、　１２）　　　Ｌｏｏｍ　＆上記組
成の溶液にマンニトールを０．７５Ｍになるように添加
して溶解する。

叙上のようにして、本来の養殖海苔であるアサクサノリ
並びにスサビノリに、野生種であるマルバアマノリもし
くはスサビグリーンが保有するあかぐされ病に対する強
い耐性の形質を導入することにより、あかぐされ病耐性
を有する新しい品種の養殖海苔を作成することができる
。

又、本発明においては、本来あかぐされ病耐性を有する
が、養殖海苔には通さない上記マルバアマノリとスサビ
グリーンの各プロトプラストを細胞融合させることによ
り、あかぐされ病耐性を有し、しかも養殖に適した新し
い品種の養殖海苔を作成することができる。

すなわち、前述したようにしてマルバアマノリとスサビ
グリーンの各プロトプラストを調製し、両者のプロトプ
ラストを前述した手順により細胞融合させ、得られた細
胞融合体について下記のようにして選抜する。

報鳳敢金生立這汰 前述したとおり、マルバアマノリの葉体は黒茶色を呈し
、スサビグリーンの葉体は緑色を呈することから、上記
細胞融合の処理を行なった後、５℃の温度に１２時間放
置後黒茶色と緑色の混り合った細胞を選抜し、これを前
述したと同様にして培養する。

このようにして得られるマルバアマノリとスサビグリー
ンの細胞融合体は、各々が保有していた養殖海苔として
不適当な形質を消し合って養殖に適合した形質を保有す
るようになると共に、あかぐされ病耐性が強いので、新
しい品種の養殖海苔として利用することが可能となる。

の　　　　　　びへ 以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明すると
共に本発明の詳細な説明する。

実施例１ 本例は、マルバアマノリの保有するあかぐされ病耐性の
形質を、養殖海苔であるアサクサノリ並びにスサビノリ
に導入して、あかぐされ病耐性の強い品種の養殖海苔を
作成する態様を示したものである。

上記各海苔の葉体（葉長１０〜２０＋ｗｍ）の１０枚宛
を品種別にＬ型試験管に収容し、それぞれ下記条件下に
パパインの希薄溶液（Ｍ７１５トリス塩酸緩衝液、ｐｔ
ｉ　？。４）　１０ｎ＋Ｊを加えて２０℃で振盪下（１
００ストローク／分）に処理した。

マルバアマノリ及びスサビノリでは１％濃度のパパイン
溶液を用いて１０分間、アサクサノリでは０．２％濃度
のパパイン溶液を用いて５分間処理した。

上述のように処理した各葉体を海水で十分洗浄した後、
別のし型試験管に収容し、これに予めシュードモナス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＰＮａＰＴ−５（微工研条
寄１１ｈＢＰ−３３０）をスサビノリ粉末を基質とする
培地中で培養して得られた酵素液（０，７５Ｍマンニト
ール添加）１０＋ｗｊ！を加え、２０℃で６０分間振盪
（７０ストロ一ク／分）させてプロトプラスト化を行な
った。

得られた各酵素処理混合物を４０μメツシユのナイロン
製網で濾過し、濾液を遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分
間）して上澄液を除き、残渣に適量の下記組成の人工海
水（Ｐｒｏｖａｓｏｌｉの栄養添加海水）を加え、プロ
トプラスト懸濁液をそれぞれ調製した。

人工海水の組成： 濾過した海水１００ｍ　ｌに対し下記栄養剤を２＋ｊ！
を添加。

蒸留水　　　　　　　　　１００　　ｍ１ＮａＮＯ３３
５０ｍｇ Ｎａ２−グリセロリン酸　　　５０　　ｍｇＦｅ（ａｓ
　ＥＤＴＡ；ｌ：１モル）　　　　　２．５ｍｇ＊Ｉｐ
■金属混液　　　　　　２５　　ｍｌビタミンＢ１２　
　　　　　　１０　μｇチアミン　　　　　　　　　０
．５ｍｇビオチン　　　　　　　　　５μｇ ”　ＴＲｌ５　”　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏ、）　　　５０
０　　ｍｇｐＨ７，８ 束Ｉ　　ｐＨ金属混液組成 蒸留水　　　　　　　　　１００　　ｍｊ！Ｎａ２−Ｅ
ＤＴＡ　　　　　　　　　１００　　ｍｇＦｅ（ａｓ　
Ｃ１″″）　　　　　　　　１　　ｍｇＢ（ＨＪＯヨ）
　　　　　　　　　　　　２０　　ｍｇＭｎ（ａｓ　　
Ｃ１”−）　　　　　　　　　　　　４　　ｍｇＺｎ（
ａｓ　Ｃ１−）　　　　　　　　　　５００　　μｇＣ
ｏ（ａｓ　Ｃ１″″）　　　　　　　　　　１００．ｃ
ｒｇ寝止ｌＢμｍλ甑戊 上述のようにして調製したマルバアマノリのプロトプラ
ストと、アサクサノリ並びにスサビノリの各プロトプラ
ストとをそれぞれ組合わせて混合し、得られた各混合物
の０．１ｍｆ　　（約１０’個）宛をバスツールビ゛ペ
ットでベトリ皿内に滴下し、５〜１０分間放置してプロ
トプラストをガラス表面に沈澱させた。この沈澱に下記
組成のポリエチレングリコール溶液の０．２ｍｊ！を加
えて１０分間放置した後、さらに下記組成のＨｉｇｈ　
ｐＨ−Ｃａ溶液の０．５ｍＭを加えて５分間放置した。

ポリエチレングリコール溶液の組成： ポリエチレングリコール（ＭＷ　６．０００）の５４％
水溶液にＣａＣｌ２２Ｈ１０，５ｍＭ　、　ＫｔＰＯｈ
Ｈ２００，７℃ｗＭおよびグルコースＯ，１Ｍを添加す
る。

）１Ｈｇｈ　ｐＨ−Ｃａ溶液の組成： ■　ＣａＣｌ２２Ｈ２０を１００ｍＭおよびグルコース
を０．４１１１の各濃度に蒸留水に熔解する。

■　１００ｍＭ　ＮａＯＨ−グリシン°バッファー（ｐ
Ｈ１０，５）にグルコースを０．４Ｈの濃度に熔解する
。

上記■と■の溶液を使用前に１：１の割合に混合する。

次に、上述のよう放置したものに、下記に示す人工海水
（Ｐｒｏｖａｓｏｌｉの栄養添加海水）から成る培養液
０．３＋／ｌを加え、５分後その０．３ａ＋ｊ！をベト
リＩから吸い上げ、さらにそれに上記培養液を５分後そ
の０．３ｍＭを吸い上げる操作を５回繰返して行なった
後、新たに上記培養液を加えて培養を行なった。培養は
１５℃の温度で６，０００Ｌｕｘ照度下で明朗９時間（
時期１５時間）で行なった。

豊思散企体見逸失 アサクサノリはｍ葉型、スサビノリも細葉型、マルバア
マノリはマル葉型であり、又、単胞子の放出時期は葉長
がそれぞれ０．２〜１ｍｍ　、１０〜７０＋ｕｅ。

０．５〜２３１ＩＩＩＩｌであるので、上記の培養条件
にて培養中に、アサクサノリとマルバアマノリの組合わ
せの場合は、約１０ｍｍ葉長稈度に育った時、細葉型の
み一葉体づつマイクロプレートに入れ、人工海水（Ｐｒ
ｏνａｓｏ目の栄養添加海水）を各５ｍ１ｌ入れ単胞子
放出処理（上述の培養条件で温度のみを１５℃から２０
℃に変える）をし単胞子の放出のあったものを選択した
。

又、スサビノリとマルバアマノリの組合わせの場合も同
様に細葉型で数ｎ１１１葉長程度長稈胞子の放出のあっ
たものを選択した。

このようにして選抜して得られた各細胞融合体から放出
された単胞子を上述の培養条件で培養し、育成して後記
に示すようなあかぐされ病耐性を保有する新しい品種の
養殖海苔を２種類得た。

実施例２ 実施例１に記載したと同様の手順でアサクサノリ、スサ
ビノリ、スサビグリーンのプロトプラストを調製した。

尚、スサビグリーンのパパイン処理条件は、１％パパイ
ン濃度で１０分間行なった。

そして、実施例１に記載と同様の手順でアサクサノリと
スサビグリーンおよびスサビノリとスサビグリーンのプ
ロトプラストを各々細胞融合し、培養しその細胞融合体
の選抜は黒茶色の葉体であかぐされ病感染試験にて感染
しなかった葉体を選択した。

感染試験は前記本文に記載の方法に従がって行ない、６
日目に各葉体を顕微鏡にて観察し感染の全くない葉体を
選抜した。

それらの葉体は滅菌海水でよく洗浄し、濾紙上に葉体を
ひろげ上から別の濾紙をのせ、おさえ、水分をとり、５
℃にて１２時間保持した後、−２５℃にて２４時間保持
した。

因に、あかぐされ病菌は耐乾性及び耐凍性がないので、
上述のように葉を冷凍下に保持する。

上述のようにして選抜した葉体を育成すると、後記する
とおりの、あかぐされ病耐性を保有する２種の新しい品
種の養殖海苔が得られた。

実施例３ 本例は、天然品種であるマルバアマノリとスサビグリー
ンの各プロトプラストを細胞融合させることにより、あ
かぐされ病耐性を有すると共に養殖に通した新しい品種
の養殖海苔を作成する態様を示したものである。

実施例１に記載したと同様の手順で、スサビグリーンと
マルバアマノリの各プロトプラストを調製し、これらを
細胞融合した。融合処理後５℃にて１２時間放置後、オ
リンパス社製インジェクトスコープ（毛細管光３０μ径
）にて緑色と焦茶色の混じりあった細胞をピックアップ
することにより細胞融合体を選抜した。これを前記本文
に記載の培養条件で培養して、後記するようにあかぐさ
れ病耐性を有する養殖に通した海苔を得た。

あかぐされ　に・する　生゛ｙ 実施例１〜３で得られた各細胞融合体から成る海苔葉体
について、あかぐされ病に対する耐性試験を行なった結
果を表４及び５に示す。なお、対照として細胞融合を行
なう前の各海苔葉体についなも同様に試験した結果を併
せて示した。

試験方法： 前記本文記載のあかぐされ病に関する実験方法に準拠し
て行なった。

表４及び５にみられるように、本発明に従って作成され
た各細胞融合体から成る養殖海苔はいずれも優れたあか
ぐされ病耐性を示すこと、及び従来、葉形もしくは葉色
の故に養殖に不通とされていたスサビグリーンとマルバ
アマノリの細胞融合体から成る海苔は養殖海苔として利
用し得るようになる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）あかぐされ病耐性の強い天然品種であるスサビグ
   リーンもしくはマルバアマノリのプロトプラストを調製
   し、一方養殖海苔のプロトプラストを調製し、得られる
   両方のプロトプラストを細胞融合して細胞融合体を形成
   し、ついで該細胞融合体を育成することを特徴とするあ
   かぐされ病耐性の強い品種の養殖海苔の作成方法。
2. （２）養殖海苔がアサクサノリもしくはスサビノリであ
   る特許請求の範囲第（１）頂記載の方法。
3. （３）あかぐされ病耐性の強い天然品種であるスサビグ
   リーンとマルバアマノリとの各プロトプラストを調製し
   、得られる両方のプロトプラストを細胞融合して細胞融
   合体を形成し、該細胞融合体を育成することを特徴とす
   るあかぐされ病耐性の強い品種の養殖海苔の作成方法。