JPS60184384A - Ν−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 - Google Patents
Ν−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法Info
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- JPS60184384A JPS60184384A JP59039652A JP3965284A JPS60184384A JP S60184384 A JPS60184384 A JP S60184384A JP 59039652 A JP59039652 A JP 59039652A JP 3965284 A JP3965284 A JP 3965284A JP S60184384 A JPS60184384 A JP S60184384A
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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- C12R2001/19—Escherichia coli
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造方
法に関する。
法に関する。
Ｎ−アシルノイラミン酸アルトラ−ｔＩＣＮ−ｎｔｕｌ
ｎｚｕｒａｍｉｎａｔｚ ａｌｄｏｌａｓｔ ） Ｒ１
凭］名シア シ酸アルドラーゼとも呼ばれ国際生化学連
合酵素委員会の酵素番号Ｅ、 Ｃ，４，１，３，３，に
分類され、系統名ではＮ−アシルノイラミン酸：じルピ
ン酸リアーｉ！ （Ｎ −ａｅｙｌｎｔｕｒａｍｉｎａ
ｔｔ ： 戸ｙｒｕｖａｔｔ １ｙａｓｔ ） と呼ば
れている酵素である。本酵素は下記の反応式に示す如く
、シアル酸（Ｎ−アシルノイラミン＃Ｉ）の分解及び合
成反応を触媒する酵素である。
ｎｚｕｒａｍｉｎａｔｚ ａｌｄｏｌａｓｔ ） Ｒ１
凭］名シア シ酸アルドラーゼとも呼ばれ国際生化学連
合酵素委員会の酵素番号Ｅ、 Ｃ，４，１，３，３，に
分類され、系統名ではＮ−アシルノイラミン酸：じルピ
ン酸リアーｉ！ （Ｎ −ａｅｙｌｎｔｕｒａｍｉｎａ
ｔｔ ： 戸ｙｒｕｖａｔｔ １ｙａｓｔ ） と呼ば
れている酵素である。本酵素は下記の反応式に示す如く
、シアル酸（Ｎ−アシルノイラミン＃Ｉ）の分解及び合
成反応を触媒する酵素である。
シアル酸≠Ｎ−アシルマンノサミン＋じルヒン酸本発明
者らは、先にニジエリしア属、その他の数種の属に属す
る公知菌を、シアル酸の存在下に培養する時には、上記
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼが工業的規模で容
易に製造できることを見い出し、該酵素の製造技術を確
立した（特公昭５６−５４１５３号、特許第１１１１３
４６号）。
者らは、先にニジエリしア属、その他の数種の属に属す
る公知菌を、シアル酸の存在下に培養する時には、上記
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼが工業的規模で容
易に製造できることを見い出し、該酵素の製造技術を確
立した（特公昭５６−５４１５３号、特許第１１１１３
４６号）。
しかるに上記確立された方法では、培地へのシアル酸の
添加が必須であり、このシアル酸自体その調製に煩雑な
操作等を有し且つ高価なものである不利があった。しか
もとのシアル酸添加を行なわない限り、Ｎ−アシルノイ
ラミン酸アルトラ−ぜは生産されないか或は極微量生産
されるのみで、側底工業的実施はできないものであった
。即ち上記方法に利用される微生物は、それ自体シアル
酸の不存在下ではＮ−アシルノイラミン酸生産能を実質
的に発現し得ないものであった。
添加が必須であり、このシアル酸自体その調製に煩雑な
操作等を有し且つ高価なものである不利があった。しか
もとのシアル酸添加を行なわない限り、Ｎ−アシルノイ
ラミン酸アルトラ−ぜは生産されないか或は極微量生産
されるのみで、側底工業的実施はできないものであった
。即ち上記方法に利用される微生物は、それ自体シアル
酸の不存在下ではＮ−アシルノイラミン酸生産能を実質
的に発現し得ないものであった。
本発明者らは、上記方法の最大の欠点とするシアル酸利
用を必須とする点を解消し、該シアル酸を利用せずとも
工業的規模で大量のＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼを製造できる方法を開発すべく鋭意研究を重ねた。そ
の結果上記方法に利用された微生物のうちニジエリしア
属に属する菌を変異処理した所、得られる変異株は、シ
アル酸等の誘導物質の無添加培地においても著量の目的
酵素を生産し得るという事実、即ち上記変異処理により
顕著なＮ−アシルノイラミン酸アルトラ−ぜ生産能が付
与されるという新しい事実を発見した。本発明はこの新
しい知見に基づいて完成されたものである。
用を必須とする点を解消し、該シアル酸を利用せずとも
工業的規模で大量のＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼを製造できる方法を開発すべく鋭意研究を重ねた。そ
の結果上記方法に利用された微生物のうちニジエリしア
属に属する菌を変異処理した所、得られる変異株は、シ
アル酸等の誘導物質の無添加培地においても著量の目的
酵素を生産し得るという事実、即ち上記変異処理により
顕著なＮ−アシルノイラミン酸アルトラ−ぜ生産能が付
与されるという新しい事実を発見した。本発明はこの新
しい知見に基づいて完成されたものである。
即ち１本発明はニジエリしア属に属し、誘導物質の存在
を必要とすることなくＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼ生産能を発現するように変異された変異株を、培養
して培養物からＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを
採取することを特徴とするＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼの製造法に係る。
を必要とすることなくＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼ生産能を発現するように変異された変異株を、培養
して培養物からＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを
採取することを特徴とするＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼの製造法に係る。
本発明によれば調製するのが面倒なシアル酸、その類縁
体等のＮ−アシルノイラミン酸アルトラ−ぜの誘導物質
を培地中に添加せずとも、通常の微生物の培養に用いら
れる培地中で、上記変異株が有意な量の目的酵素を産生
ずるだめ、該酵素を工業的規模で大量に且つ容易に製造
することができる。
体等のＮ−アシルノイラミン酸アルトラ−ぜの誘導物質
を培地中に添加せずとも、通常の微生物の培養に用いら
れる培地中で、上記変異株が有意な量の目的酵素を産生
ずるだめ、該酵素を工業的規模で大量に且つ容易に製造
することができる。
本発明方法においては、ニジエリしア属に属する変異株
を用いることが重要であり、該変異株は、３− ニジエリしア属に属する公知の各種菌、例えばニジエリ
しア コリー（Ｅ、 ｃｏｌｉ ） 、ニジエリしアフ
ロインディー（Ｅ、 ｆｒｚｕｎｄｉｉ ）、ニジエリ
しアイジターメディア（Ｅ、 ｉｎｔｅｒｍｔｄｉａ
）等を起源として、之等に、一般に用いられている公知
の各種変異処理手段を適用することにより得られる。該
変異処理手段としては、例えばニド０ソタアニジン、マ
イトマイシンＣ５４−ニド０＋ノリンー１−オ十シト、
メチルメタジスルホン酸、メチルエタンスルホン酸、エ
チルエタンスルホン酸、２−アミノづリン、５−９０℃
ウラシル、亜硝酸、しドロ士ジルアミン、アクリフラじ
ン１プ０ワラビジーアクリジンマスタード等の化学的突
然変異誘起剤処理、Ｘ線等の放射線照射、紫外線照射等
を単独で又は適宜組み合せて用いることができる。
を用いることが重要であり、該変異株は、３− ニジエリしア属に属する公知の各種菌、例えばニジエリ
しア コリー（Ｅ、 ｃｏｌｉ ） 、ニジエリしアフ
ロインディー（Ｅ、 ｆｒｚｕｎｄｉｉ ）、ニジエリ
しアイジターメディア（Ｅ、 ｉｎｔｅｒｍｔｄｉａ
）等を起源として、之等に、一般に用いられている公知
の各種変異処理手段を適用することにより得られる。該
変異処理手段としては、例えばニド０ソタアニジン、マ
イトマイシンＣ５４−ニド０＋ノリンー１−オ十シト、
メチルメタジスルホン酸、メチルエタンスルホン酸、エ
チルエタンスルホン酸、２−アミノづリン、５−９０℃
ウラシル、亜硝酸、しドロ士ジルアミン、アクリフラじ
ン１プ０ワラビジーアクリジンマスタード等の化学的突
然変異誘起剤処理、Ｘ線等の放射線照射、紫外線照射等
を単独で又は適宜組み合せて用いることができる。
本発明に特に好適に用いられる上記変異株の一例として
は、ニジエリしア コリー ＩＦＯ３３０１を親株とし
て得られたニジエリしア コ−４＋ リー Ｍ８３２Ｂを例示できる。該Ｍ８３２８株は、以
下の変異処理手段により得られる。即ちエシェリヒア
コリー ＩＦＯ３３０１を肉工十スおよび酵母工牛スを
含む培地（殺菌前の戸Ｈ７，Ｏｌ ″以下Ａ培地と呼ぶ
）に−白金耳植菌し、３０°Ｃでソジアニジシを添加し
、３７°Ｃで軽く振盪処理を施したのち、遠心分離して
菌体を集め、これを生理食塩水で洗滌後、生理食塩水に
懸濁させ、その一部をとってＡ培地に植菌する。３０°
Ｃで振盪培養した後、遠心分離して集菌し、生理食塩水
で洗滌した菌体をシアル酸、リン酸二カリウム、リン酸
二カリウム、硫酸アン七ニウム及び硫酸マグネシウムを
含む培地（殺菌前の戸Ｈ６，８、以下Ｂ培地と呼ぶ）に
植菌し、３７℃で３時間振盪培養後との懸濁液に最終濃
度１００Ｕ／ＮｌになるようにペニシリンＧを加え、更
に３７°Ｃで振盪培養を行ない、遠心分離により菌体を
集め、生理食塩水で菌体を洗滌した後、段階希釈してブ
ドウ糖、リン酸二カリウム、リン酸−カリウム、硫酸ア
ンモニウム、硫酸マグネシウム及び寒天（殺菌前の戸Ｈ
６゜８、以下Ｃ培地と呼ぶ）からなる固体培地に塗りつ
け、これを３７℃で培養し、生じたコロニーをＢ培地に
寒天を添加した固体培地（以下、ＢＡ培地と呼ぶ）及び
Ｃ培地にしブリ力法で塗りつける。３７°Ｃで培養後、
Ｃ培地で生育しない菌をシアル酸非資化性菌株として得
る。さらに本菌株をＡ培地に培養後、上記と同じ条件で
ニド０ソクアニジン処理を行ないＡ培地に植えて振盪培
養する。
は、ニジエリしア コリー ＩＦＯ３３０１を親株とし
て得られたニジエリしア コ−４＋ リー Ｍ８３２Ｂを例示できる。該Ｍ８３２８株は、以
下の変異処理手段により得られる。即ちエシェリヒア
コリー ＩＦＯ３３０１を肉工十スおよび酵母工牛スを
含む培地（殺菌前の戸Ｈ７，Ｏｌ ″以下Ａ培地と呼ぶ
）に−白金耳植菌し、３０°Ｃでソジアニジシを添加し
、３７°Ｃで軽く振盪処理を施したのち、遠心分離して
菌体を集め、これを生理食塩水で洗滌後、生理食塩水に
懸濁させ、その一部をとってＡ培地に植菌する。３０°
Ｃで振盪培養した後、遠心分離して集菌し、生理食塩水
で洗滌した菌体をシアル酸、リン酸二カリウム、リン酸
二カリウム、硫酸アン七ニウム及び硫酸マグネシウムを
含む培地（殺菌前の戸Ｈ６，８、以下Ｂ培地と呼ぶ）に
植菌し、３７℃で３時間振盪培養後との懸濁液に最終濃
度１００Ｕ／ＮｌになるようにペニシリンＧを加え、更
に３７°Ｃで振盪培養を行ない、遠心分離により菌体を
集め、生理食塩水で菌体を洗滌した後、段階希釈してブ
ドウ糖、リン酸二カリウム、リン酸−カリウム、硫酸ア
ンモニウム、硫酸マグネシウム及び寒天（殺菌前の戸Ｈ
６゜８、以下Ｃ培地と呼ぶ）からなる固体培地に塗りつ
け、これを３７℃で培養し、生じたコロニーをＢ培地に
寒天を添加した固体培地（以下、ＢＡ培地と呼ぶ）及び
Ｃ培地にしブリ力法で塗りつける。３７°Ｃで培養後、
Ｃ培地で生育しない菌をシアル酸非資化性菌株として得
る。さらに本菌株をＡ培地に培養後、上記と同じ条件で
ニド０ソクアニジン処理を行ないＡ培地に植えて振盪培
養する。
寒天を含まないＣ培地を使用し、ペニシリンＧ処理を行
なった後、Ｃ培地にコロニーを形成させＢＡ培地とＣ培
地とにレプリカ法により塗りつける。ＢＡ培地及びＣ培
地の両方に生育した菌株につき、常法通１ｐＮ−アシル
ノイラ″：、：Ｊ酸アルドラーゼ活性を測定してシアル
酸を添加しない培地で７− の培養によっても著量の該酵素を生産する菌株を収得す
る。
なった後、Ｃ培地にコロニーを形成させＢＡ培地とＣ培
地とにレプリカ法により塗りつける。ＢＡ培地及びＣ培
地の両方に生育した菌株につき、常法通１ｐＮ−アシル
ノイラ″：、：Ｊ酸アルドラーゼ活性を測定してシアル
酸を添加しない培地で７− の培養によっても著量の該酵素を生産する菌株を収得す
る。
かくして得られるＭ８３２８株は、親株と対比して誘導
物質の存在しない培養条件下においても著量のＮ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ生産を有する点において際
立った相違が認められる以外、その菌学的性質において
は親株と同一の諸特徴を有している。従ってこれはニジ
エリしア属に属する変異株と同定される。本菌株は通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所にＭＢ３２Ｂと
して寄託（受託番号 微工研菌寄第７４４６号、ＦＥＲ
Ｎ 戸−７４４６）されている。
物質の存在しない培養条件下においても著量のＮ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ生産を有する点において際
立った相違が認められる以外、その菌学的性質において
は親株と同一の諸特徴を有している。従ってこれはニジ
エリしア属に属する変異株と同定される。本菌株は通商
産業省工業技術院微生物工業技術研究所にＭＢ３２Ｂと
して寄託（受託番号 微工研菌寄第７４４６号、ＦＥＲ
Ｎ 戸−７４４６）されている。
本発明者らの研究によれば、上記親株（Ｅ。
ｃｏｌｉ ＺＦＯ３３Ｑｌ ）に限らず、本発明者らが
先に確立した方法に利用するニジエリしア属微生物、即
ちニジエリしア属に属し、シアル酸添加培地でＮ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有する微生物は、
いずれも上記ニド０ソタアニジン８− を用いた処理により、シアル酸無添加培地で著量のＮ−
アシルノイラミン酸アルトラ−せ生産能を有する所望の
変異株に誘導できることが見い出された。また上記各種
の微生物は、ニド０ソグアニ、；シを用いる処理以外の
、前記した各種の変異処理手段によっても、同様の酵素
生産能を有する変異株に誘導できる。これらのことより
、上記微生物は、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
生産能を澤在的に有しており、通常これは発現されない
が、変異処理によりこの潜在的酵素生産能が活性化され
確実に発現されるものと考えられる。
先に確立した方法に利用するニジエリしア属微生物、即
ちニジエリしア属に属し、シアル酸添加培地でＮ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有する微生物は、
いずれも上記ニド０ソタアニジン８− を用いた処理により、シアル酸無添加培地で著量のＮ−
アシルノイラミン酸アルトラ−せ生産能を有する所望の
変異株に誘導できることが見い出された。また上記各種
の微生物は、ニド０ソグアニ、；シを用いる処理以外の
、前記した各種の変異処理手段によっても、同様の酵素
生産能を有する変異株に誘導できる。これらのことより
、上記微生物は、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
生産能を澤在的に有しており、通常これは発現されない
が、変異処理によりこの潜在的酵素生産能が活性化され
確実に発現されるものと考えられる。
いずれにせよ、従来かかる顕著に向上された酵素生産能
を有するニジエリしア属微生物は全く知られておらず、
勿論公知のニジエリしア属微生物が変異処理によシかか
る酵素生産能を発現させ得るという事実も知られていな
い。
を有するニジエリしア属微生物は全く知られておらず、
勿論公知のニジエリしア属微生物が変異処理によシかか
る酵素生産能を発現させ得るという事実も知られていな
い。
本発明方法は、上記ニジエリしア属に属する変異株を、
培ＲｊＩ＋るととにより実施される。上記微生物を培養
するだめの培地としては炭素源、窒素源、無機化合物そ
の他の栄養素を含むものなら細菌の培養に一般に使用さ
れている合成培地、半合 □成培地或いは天然培地のい
ずれをも使用することができる。上記各培地に利用され
る炭素源としては、例えばブドウ糖、果糖、転化糖、澱
粉糖化液、ソルビトール、クリｔｏ−ル等の糖質類、じ
ルじン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類等が、窒素
源としては、硫酸アン七ニウム、塩化アン七ニウム、硝
酸アン七ニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニ
ウム、酒石酸アン七ニウム、酢酸アン七ニウム、尿素等
が、炭素源にも窒素源にもなるものとしては、ぺづトン
、肉工十ス、コーンステイープリカー等が、無機化合物
としては、す：Ｊ酸−カリ、リン酸二カリ、リン酸−ナ
トリウム、リン酸二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩
化マグネシウム、塩化カリ、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、塩化第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第二鉄、硫酸マンガ
ン、塩化マンガン等が、その他の栄養源としては酵母工
十ス、ビタミン類等が夫々例示される。
培ＲｊＩ＋るととにより実施される。上記微生物を培養
するだめの培地としては炭素源、窒素源、無機化合物そ
の他の栄養素を含むものなら細菌の培養に一般に使用さ
れている合成培地、半合 □成培地或いは天然培地のい
ずれをも使用することができる。上記各培地に利用され
る炭素源としては、例えばブドウ糖、果糖、転化糖、澱
粉糖化液、ソルビトール、クリｔｏ−ル等の糖質類、じ
ルじン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類等が、窒素
源としては、硫酸アン七ニウム、塩化アン七ニウム、硝
酸アン七ニウム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニ
ウム、酒石酸アン七ニウム、酢酸アン七ニウム、尿素等
が、炭素源にも窒素源にもなるものとしては、ぺづトン
、肉工十ス、コーンステイープリカー等が、無機化合物
としては、す：Ｊ酸−カリ、リン酸二カリ、リン酸−ナ
トリウム、リン酸二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩
化マグネシウム、塩化カリ、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、塩化第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第二鉄、硫酸マンガ
ン、塩化マンガン等が、その他の栄養源としては酵母工
十ス、ビタミン類等が夫々例示される。
培養は、液体培地又は固体培地のいずれでも行ない得る
が通常液体培地の方が有利であって、特に振盪培養又は
通気攪拌培養を行なうのが量産上有利である。培養温度
は２０°Ｃ乃至４５’Ｏ，好ましくは２８℃乃至３７°
Ｃとするのが好適である。培養中は適当な中和剤を用い
てｐＨを６乃至９に調整するのが好ましい。上記培養を
通常１０時間乃至５０時間行なえば、Ｎ−アシルノイラ
Ｅ：Ｊｔｌｌアルドラーゼ活性は最高に達する。本酵素
は一般に菌体内酵素であるので、培養物からの本酵素を
採取し、精製するに当っては、上記培養液から遠心分離
等の方法で菌体を集め、得られた菌体を超音波処理、ガ
ラスじ−ズを用いる摩砕処理、或いはフレシチプレス処
理等によって破砕し、酵素を抽出するのが好ましい。抽
出液はこれを硫安塩析法、イオン交換り０マドクラフイ
ー、ゲル濾過法等の常法により処理して精製Ｎ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼとすることができる。
が通常液体培地の方が有利であって、特に振盪培養又は
通気攪拌培養を行なうのが量産上有利である。培養温度
は２０°Ｃ乃至４５’Ｏ，好ましくは２８℃乃至３７°
Ｃとするのが好適である。培養中は適当な中和剤を用い
てｐＨを６乃至９に調整するのが好ましい。上記培養を
通常１０時間乃至５０時間行なえば、Ｎ−アシルノイラ
Ｅ：Ｊｔｌｌアルドラーゼ活性は最高に達する。本酵素
は一般に菌体内酵素であるので、培養物からの本酵素を
採取し、精製するに当っては、上記培養液から遠心分離
等の方法で菌体を集め、得られた菌体を超音波処理、ガ
ラスじ−ズを用いる摩砕処理、或いはフレシチプレス処
理等によって破砕し、酵素を抽出するのが好ましい。抽
出液はこれを硫安塩析法、イオン交換り０マドクラフイ
ー、ゲル濾過法等の常法により処理して精製Ｎ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼとすることができる。
以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
なお、各側におけるＮ−アシルノイラ、ニジ酸アルドラ
ーセ活性は、バーネットらの方法〔Ｊ、Ｅ、Ｇ。
ーセ活性は、バーネットらの方法〔Ｊ、Ｅ、Ｇ。
Ｂａｒｎｚｔｔ、 Ｄ、Ｌ、 Ｃａｒｉｎａ、 ａｎｄ
Ｇ、Ｒａ５ｏｏｌ 、 ＢｉｏｃｈｔｍｉｔａｌＪＯ
ｔｌｒｎａｌ、１２５，２７５（１９７ｍ））Ｋ従い測
定したものであり、酵素活性の１単位は、反応温度３７
°Ｃにおいて１分間に１マイクロ七ルのＮ−アｔチルノ
イラ、ｌ：ン酸を分解する活性をいう。
Ｇ、Ｒａ５ｏｏｌ 、 ＢｉｏｃｈｔｍｉｔａｌＪＯ
ｔｌｒｎａｌ、１２５，２７５（１９７ｍ））Ｋ従い測
定したものであり、酵素活性の１単位は、反応温度３７
°Ｃにおいて１分間に１マイクロ七ルのＮ−アｔチルノ
イラ、ｌ：ン酸を分解する活性をいう。
実施例１
ブドウ糖１．Ｏｆ、硫安０．２ｆ、リン酸にカリウム０
．７Ｆ、す、７酸−カリウム０．２ｆ、酵母工十ス０．
０５Ｆ及び水１００ ｗｒｌを５００ ｍｌ容三角フラ
スコに入れ、ｐＨ６，８になる様に調整後、加熱滅菌し
た培養液に、ニジエリしア コリー Ｍ８３２８（微工
研繭・ＩＦ７第７４４６号）を接種し、３０℃にて２４
時間振盪培養を行なった。その後菌体を遠心分離法によ
シ集め、得られた菌体を２５ｍＭリン酸緩衝液（戸＃７
．５）１００耐に懸濁して超音波処理を行ない細胞を破
砕し、菌体内の酵素を抽出した。遠心分離により沈漬と
上澄とを分離した後、抽出液（上澄）のＮ−アシルノイ
ラ、ニジ酸アルドラーゼ活性を測定した所、抽出液１
ｗｌ当たシ１．０２単位と測定された。
．７Ｆ、す、７酸−カリウム０．２ｆ、酵母工十ス０．
０５Ｆ及び水１００ ｗｒｌを５００ ｍｌ容三角フラ
スコに入れ、ｐＨ６，８になる様に調整後、加熱滅菌し
た培養液に、ニジエリしア コリー Ｍ８３２８（微工
研繭・ＩＦ７第７４４６号）を接種し、３０℃にて２４
時間振盪培養を行なった。その後菌体を遠心分離法によ
シ集め、得られた菌体を２５ｍＭリン酸緩衝液（戸＃７
．５）１００耐に懸濁して超音波処理を行ない細胞を破
砕し、菌体内の酵素を抽出した。遠心分離により沈漬と
上澄とを分離した後、抽出液（上澄）のＮ−アシルノイ
ラ、ニジ酸アルドラーゼ活性を測定した所、抽出液１
ｗｌ当たシ１．０２単位と測定された。
尚、参考のため上記培地のブドウ糖の代シにシアルｌ！
ｌ！ｃＮ−アセチルノイラミン酸）を１．０％添加した
培地を用いて親株（ニジエリしア コリーＩＦＯ３３０
１）を同様に培養して得られた酵素活性を同様に測定し
た結果、抽出液１ ｔｘ！当たりの活性は１．０４単位
であった。
ｌ！ｃＮ−アセチルノイラミン酸）を１．０％添加した
培地を用いて親株（ニジエリしア コリーＩＦＯ３３０
１）を同様に培養して得られた酵素活性を同様に測定し
た結果、抽出液１ ｔｘ！当たりの活性は１．０４単位
であった。
次に上記のニジエリしア コリー Ｍ３８２８由来の酵
素抽出液１００ｍ？（１０２単位の酵素活性を有す）を
硫安で塩析し、３０〜８０％飽和区分（飽和度はオズボ
ーン（０ｓｂｏｒｎｚ ）法で表示）を遠心分離により
集め、沈澱を２０ｇ／の’１５ｍＭリン酸緩衝液（戸Ｈ
７，５）に溶かして同緩衝液に対して充分透析した後、
凍結乾燥した結果、Ｎ−アシルノイラミシ酸アルドラー
セの粗酵素粉末１２６、Ｏｑが得られ、粉末１１１１ｇ
当たりの該酵素活性は０．７５単位であった。
素抽出液１００ｍ？（１０２単位の酵素活性を有す）を
硫安で塩析し、３０〜８０％飽和区分（飽和度はオズボ
ーン（０ｓｂｏｒｎｚ ）法で表示）を遠心分離により
集め、沈澱を２０ｇ／の’１５ｍＭリン酸緩衝液（戸Ｈ
７，５）に溶かして同緩衝液に対して充分透析した後、
凍結乾燥した結果、Ｎ−アシルノイラミシ酸アルドラー
セの粗酵素粉末１２６、Ｏｑが得られ、粉末１１１１ｇ
当たりの該酵素活性は０．７５単位であった。
ここに得られた粗酵素粉末は、これをイオン交換り０マ
ドクラフイー、グル濾過、等の常法に従って精製するこ
とにより更に純化された酵素標品を得ることができる。
ドクラフイー、グル濾過、等の常法に従って精製するこ
とにより更に純化された酵素標品を得ることができる。
比較例１
実施例１において、変異株Ｍ３Ｂ２Ｂに代え、親株（ニ
ジエリしア コリー ｚｐｏ３３０１）を用い、同様に
培養して得られた酵素活性を同様に測定した所、抽出液
１ ｍｌ当たシの酵素活性は０．００１単位であった。
ジエリしア コリー ｚｐｏ３３０１）を用い、同様に
培養して得られた酵素活性を同様に測定した所、抽出液
１ ｍｌ当たシの酵素活性は０．００１単位であった。
比較例２〜４
比較例１において、以下の各微生物を用い、同様にシア
ル酸無添加培地で培養して得られた酵素活性を同様に測
定した所、夫々下記第１表に示す通りであった。
ル酸無添加培地で培養して得られた酵素活性を同様に測
定した所、夫々下記第１表に示す通りであった。
尚第１表には各微生物をシアル酸添加培地（実施例１に
示した培地のブドウ糖の代シにシアル酸を１．０％添加
した培地）で培養して、同様の酵素活性をめた結果を併
記する。
示した培地のブドウ糖の代シにシアル酸を１．０％添加
した培地）で培養して、同様の酵素活性をめた結果を併
記する。
第 １ 表
１５一
実施例２
コハク酸１．Ｏｆ、ペプトンｘ、ｏｙ、酵母工牛スｔ、
ｏｒ及び水１００ ｍｌを５００ ｍｌ容三角フラスコ
に入れ、戸Ｈ６，５になる様に苛性ソーダで戸Ｈを調整
し、加熱滅菌した培養液に、実施側蓋と同じニジエリし
ア フリー Ｍ８３２Ｂを接種し、３０°Ｃにて２０時
間振確培養を行なった０以後実施例１と同様にして酵素
を抽出し、活性を測定した結果、抽出液１ ｍｌ当たり
のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性は１．２５
単位であった。
ｏｒ及び水１００ ｍｌを５００ ｍｌ容三角フラスコ
に入れ、戸Ｈ６，５になる様に苛性ソーダで戸Ｈを調整
し、加熱滅菌した培養液に、実施側蓋と同じニジエリし
ア フリー Ｍ８３２Ｂを接種し、３０°Ｃにて２０時
間振確培養を行なった０以後実施例１と同様にして酵素
を抽出し、活性を測定した結果、抽出液１ ｍｌ当たり
のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性は１．２５
単位であった。
ここに得られた抽出液１００ｍ／（１２５単位の酵素活
性を有す）を出発原料にして、実施例監に記した方法と
同様にして凍結乾燥標品を調製した結果１Ｎ−アシルノ
イラミン酸アルトラ−での粗酵素粉末１４３．ＩＷが得
られ、粉末ｌＷｇ当りの該酵素活性は０．８２単位であ
った。
性を有す）を出発原料にして、実施例監に記した方法と
同様にして凍結乾燥標品を調製した結果１Ｎ−アシルノ
イラミン酸アルトラ−での粗酵素粉末１４３．ＩＷが得
られ、粉末ｌＷｇ当りの該酵素活性は０．８２単位であ
った。
（以 上）
手続補正書（自制
１、事件の表示
昭和５９年特 許 願第３９６５２ 号２・ 発明０名
称 Ｎ−アシルノイラー：、ン酸アルドラーゼの製造法
３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４、代理人 大阪市東区平野町２の１０沢の鶴ビル電話０６−２０３
−０９４１（代）８、補正の内容 補正の内容 （１） 明細書第７頁第９行に「Ｃ培地で」とあるを「
Ｃ培地で生育し、Ｂ培地で」と訂正する。
称 Ｎ−アシルノイラー：、ン酸アルドラーゼの製造法
３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ４、代理人 大阪市東区平野町２の１０沢の鶴ビル電話０６−２０３
−０９４１（代）８、補正の内容 補正の内容 （１） 明細書第７頁第９行に「Ｃ培地で」とあるを「
Ｃ培地で生育し、Ｂ培地で」と訂正する。
（２）明細書第１２頁第１行に「ゲル濾過法」とあるを
「ゲル濾過法」と訂正する◇ （３）明細書第１５頁記載の第１表中「アシル酸無添加
培地」とあるを「シアル酸無添加培地」と訂正し、また
「アシル酸添加培地」とあるを「シアル酸添加培地」と
訂正する。
「ゲル濾過法」と訂正する◇ （３）明細書第１５頁記載の第１表中「アシル酸無添加
培地」とあるを「シアル酸無添加培地」と訂正し、また
「アシル酸添加培地」とあるを「シアル酸添加培地」と
訂正する。
（以 上）
Claims (1)
- ■ ニジエリしア属に属し、誘導物質の存在を必要とす
ることなくＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能
を発現するように変異された変異株を、培養して培養物
からＮ−アシルノイラーＦ、シ酸アルドラーゼを採取す
ることを特徴とするＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼの製造法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59039652A JPS60184384A (ja) | 1984-02-29 | 1984-02-29 | Ν−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 |
| US06/758,116 US4699883A (en) | 1984-02-29 | 1985-07-23 | Process for producing N-acylneuraminate aldolase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59039652A JPS60184384A (ja) | 1984-02-29 | 1984-02-29 | Ν−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60184384A true JPS60184384A (ja) | 1985-09-19 |
| JPS6228678B2 JPS6228678B2 (ja) | 1987-06-22 |
Family
ID=12559012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59039652A Granted JPS60184384A (ja) | 1984-02-29 | 1984-02-29 | Ν−アシルノイラミン酸アルドラ−ゼの製造法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4699883A (ja) |
| JP (1) | JPS60184384A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07114695B2 (ja) * | 1986-06-16 | 1995-12-13 | 丸金醤油株式会社 | ノイラミニダ−ゼの製造法 |
| US5162513A (en) * | 1991-09-20 | 1992-11-10 | The Scripps Research Institute | L-isomeric sugars having formed stereogenic centers of R configuration: methods and compositions |
| US6353095B1 (en) * | 1991-09-20 | 2002-03-05 | The Scripps Research Institute | Ketoaldonic acids having formed stereogenic centers of R configuration: methods and compositions |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5550890A (en) * | 1978-10-09 | 1980-04-14 | Marukin Shoyu Kk | Preparation of n-acylneuraminic acid aldolase |
| US4492755A (en) * | 1982-06-30 | 1985-01-08 | Nabisco Brands, Inc. | Process for isomerizing L-mannose to L-fructose |
-
1984
- 1984-02-29 JP JP59039652A patent/JPS60184384A/ja active Granted
-
1985
- 1985-07-23 US US06/758,116 patent/US4699883A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6228678B2 (ja) | 1987-06-22 |
| US4699883A (en) | 1987-10-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |