JPS6359887A

JPS6359887A - 生澱粉分解酵素の製造法

Info

Publication number: JPS6359887A
Application number: JP61202873A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Kanda; 聡神田; Masaaki Hamachi; 浜地　正昭; Takemitsu Honma; 本馬　健光; Yataro Nunokawa; 布川　弥太郎
Original assignee: OOZEKI SYUZO KK; Ozeki Sake Brewing Co Ltd
Current assignee: OOZEKI SYUZO KK; Ozeki Sake Brewing Co Ltd
Priority date: 1986-08-28
Filing date: 1986-08-28
Publication date: 1988-03-15
Anticipated expiration: 2010-07-12
Also published as: JPH0763364B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、新規な生澱粉分解酵素およびその製造ｌ去に
関する。

発明の背景澱粉粒を直接糖化することは、農産物のｆｌｌ用、醸造
工注の省力化、省エネルギーなどの点て宵効である。こ
の目的には生澱粉分解酵素の使用が考えられるが、従来
、好適な酵素は見当たらない。

このような事情に鑑み、本発明者らは、土壌、花、果実
等より、散多くの微生物を分離し、その生澱粉分解活性
について鋭意研究を重ｊ２ｒこ。その結果、里離された
糸状菌が生澱粉分解酵素を生産し、しから、湖化澱扮分
解活性に対する生澱粉分解活性の比が非常に高い特徴を
有することを見出し、本発明を完成するにいたった。

発明の開示すなわら、本発明は新規な生澱粉分解酵素およびその製
造法に関するものである。

本発明の新規生澱粉分解酵素を生産する糸状菌は次のよ
うな菌学的性質を有するものである。

（１）生育状態 ■ツアペック液寒天（Ｃｚａｐｅｋ’ｓ　５ｏｌｕｔｉ
ｏｎ　ａｇａｒ）培地を用い、２８“Ｃ１２週間平板培
養することにより、直径４〜５Ｃスのコロニーを生ずる
。また、色はほとんどが白色であり、コロニー中央部の
一部で胞子形成が見られ淡緑色となる。

■麦芽エキス寒天（Ｍａｌｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｇａ
ｒ）培地を用い、２８℃、２遇開平板培養することによ
り、直径４Ｃス程度のコロニーを生じ、ビロード状の生
育を示す。色は緑色〜０２０２℃あり、非常によく１抱
子を形成する。分生子柄は気菌糸から生じ、最大、長さ
は２００μ、巾は３μである。壁は滑面でめる。また、
フィアロ型分生子を作り、その完全計代が認められない
。

■ツアペック液寒天（Ｃｚａｐｅｋ’ｓ　５ｏｌｕｔｉ
ｏｎ　ａｇａｒ）培地中の炭素源を末生澱粉（１％）に
かえ、３０°Ｃで培養すると、明確なハローを形成する
。

（２）生理的性質 ■澱粉の加水分解性：陽性 ■酵素に対する峠度、好気性 ■生育のｐ）（範囲：ｐＨ３，５〜１２■生育の温度範
囲：　１５〜３５°に孔らの観察結果より、本図は不完全図のベニツリウム属
に属する。ペニンリは複輪生体〜非対亦体であり、分生
子柄は通常長く、コロニーは羊毛状、白色から後に灰緑
色となることにより、ペニシリウム・コマネ（Ｐ、　ｃ
ｏｍｍａｎｅ）系に含まれる。

この系の中には８Ｎ含まれているが、麦芽寒天培地上で
よく抱子形成すること、分生子の表面か細かな粗面であ
ることｔどからペニシリウム・ラノスム・ウニストリン
グ（Ｐｅｎｉｓｉｌｌｉｕｍ　：ａｎｏｓｕｍＷｅｓｔ
ｌｉｎｇ）と同定され、その代表的なペニシリウム・ラ
ノスム○ＧＲ−１を、昭和６０年１ｏ月２３日に工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８４９１号（
ＦＥＲ〜Ｉ　　Ｐ−８４９１）として寄託した。

本図は次の如く分離、純化される。分離は試料のａ量を
シャーレ内にとり、その上より肉汁寒天Ｂｕｉｌｌｏｎ
　　ａｇａｒ　）培地中の炭素源を末生澱粉（１％）に
改変した培地を流し込むことにより行なっ几。３０℃で
３日間インキュベートした後、コロニーの周辺に末生澱
粉か溶解している明確なハ。

−と呼ばれる領域が形成されたものを採取し、前記と同
様な培地で培養し、ハローの形成が再確認されたちのを
分離、呆存する（１次パス画法と称する）。

さらに、１次パス兄妹について、肉汁培地中の炭素源を
末生澱粉（１％）で改変した液体培地中で３０℃、５〜
７日間振１培養し、その培地ブロスを粗酵素液として生
澱粉分解活性および可溶性澱粉分解活性を測定し、可溶
性澱粉の分解速変に対する生澱粉分解速度の比（Ｒ／Ｓ
比）が２０以上のもの６殊を選択し、６株の中で最もＲ
／Ｓ比の大きす味として０ＣＲ−１を選択しＩこ。Ｒ／
Ｓ比：よ下記のような式で与えられる。

生澱粉分解速度（生成還元糖 μ９Ｇｌｃ／培地ブロスｚＱ／ｈｒ）Ｒ／Ｓ＝　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｘ１００
可溶性澱粉分解速度（生成還元糖 μ９Ｇ１ｃ／培地ブロスｘＱ／　ｈｒ）本発明の生澱粉
分解酵素は前記糸状菌を栄養源培地に接種し、培養仕し
めろことにより製造されろ。培養に用いられた培地とし
ては、酵素誘導基質としてのエピクロルヒドリン架橋澱
粉と、当該糸状菌がｆｌｌ用する栄養源を含むものであ
れば何、１ｔでもよいが、本発明者らは酵素生産用培地
として基本培地２０種類、炭素源８種項、窒素源８種類
、誘導基質６種類について鋭意検討の結果、望ましくは
炭素源として１％ソルビトール、窒素源として１％Ｋ　
Ｎ　−Ｏｓ、無銭成分としテ０　、５　％Ｋ　Ｈｚ　Ｐ
○、、０．０１％ＦｅＧＱｓ、０２５％〜＋ｇｓｏ、−
７８、Ｏを含み、誘導基質として０．５％エピクロルヒ
ドリン架橋澱粉からなるｐＨ６，０の独自の培地を用い
ろことか最適であることを見出した。

培毘法として：よ通気培養法か好適である。条件として
は、ｌｖｖｍ３０°Ｃ付近で行なわれる。２〜３日培箋
後、培養液は次の操作に付される。生澱粉分解酵素は通
常、培養ご夜中に存在するので、濾過または遠心分離等
の手段を用いることにより、培撲物から菌体を分離し１
こ後、８０％硫安によろる塩叶を行なうつ次に塩叶によ
り肝出したクンバクの沈澱を遠心分離により集め、蒸留
水に溶解後、透叶、内液を８０％アセトン沈澱処理し、
ざらに遇叶を行ない、凍結乾燥し、ｔｆｌ醇素扮末を得
ろ。

この粗酵素は、次のような理化学的性質を有する。

（＋）作用：里独使用または市販のα−アミラーゼ（ア
ミラーゼＫ）と共に作用して生（無蒸煮）の澱粉を加水
分解しグルコースを得る。（第り図および第２図参照）第１図；よ、各々、生の米澱粉、小麦澱粉、トウモロコ
ン澱扮、せ薯澱粉および馬鈴薯澱粉の水分散液に該新規
酵素を２００μｇタンパク当量でｐＨ５にて作用させ、
３７℃でインキュベートした際のインキュベート時間と
加水分解率の関係を示すグラフである。また、第２図は
、該酵素約２単位と糊化澱粉分解活性を０．ＪＵに調整
した市販のα−アミラーゼの混合物を同様に米澱粉に作
用させた場合のグラフである。なお、活性はμｍｏｌ　
−Ｇ　ｌｃ／分て表し、加水分解率はｇ−生成Ｇｌｃ／
ｇ−澱扮て算出モロ。

（２）至適ｐＨ＋ｐｌ（５，０（第３図参照）第３図に
は各１）Ｈの緩衝液中ての活性を示す。

（３）　ｐＨ安定性：各ｐｉ（の硬街液中で２０時間処
理しに場合、ｐＨ３〜７において９０％以上の残存活性
を示す。（第４図参照）（４）温度安定性：各温度で１Ｇ分間処理した場合、５
０°Ｃまで安定。（第５図参照）残存活性は当初の活性
を１００％とした場合の残存する活性の割合である。

このようにして得られた本発明の生澱粉分解酵素は直接
そのまま、うろい：よ市販のα−アミラーゼ剤を常法に
より適宜配合してなる酵素剤として、蕉煮工睨なしに生
の殿粉を加水分解するために、通常の酵素剤と同様に使
用でき、これにより醸造上１呈の省力化、省エネルギー
）ヒ、さらには農産物の未利用澱粉のエネルギー的回収
に利用できるものである。

次に実施例を挙げて説明する。

実施例１酵素生産のための培養 ■ペニシリウム・ラノスム（Ｐ　、　Ｉａｎｏｓｕｍ）
ＯＧｎ−１保序スラントより、ブイヨン（ｐＨ６，Ｏ）
の平板培地上に一白金耳接種し、３０°Ｃ，２日間培養
する。

■培養後、形成された本図のコロニー上に殺菌水１０ｓ
＋＋２を滴下し、菌体上濁液を作り、殺菌済みガラスフ
ィルター（３Ｇ−３）を用い、６と過し、胞子懸ｉ間液
を得ろ。

０次に胞子濃度をｌ　ｘ　ｌ　Ｏ＠藺／村〜ｌＸｌ０’
個／ｎ【！、望ましく！：ｉ：５ＸＩＯ＠藺／７ａに調
整し、これを１％エピクロルヒドリン架橋澱粉を含むブ
イヨン培地（ｐ＋−＋　６．０）＋　００ｘ（！にっき
ｌｒ＋ｆ！！１し、３０°Ｃ１３０間程度振１培１？す
る（前項谷）。

■■にて得られた前項４％培地をト１とし、１％ソルビ
トール、ｌ　％Ｋ　Ｎ　Ｏｚ、０，５％Ｋ　＋−１、Ｐ
　Ｏ，，０，０１％ＦｅＣｌ２５．０．２５％Ｍｇ５Ｏ
−７１−１ｚＯ１０５％エピクロルヒドリン架橋澱粉か
らなるｐｌ＋６０の本培養培地に２０％のか］合になる
よう添加し、３０°Ｃ，ｌｖｖｍの条件下で通気培養を
行なう。

実施例２租酵素粉末の凋へ。

■培養終了後、濾過または遠心分離により菌体を除去後
、培養濾液をｉ）ろ。

■培程濾液に対し、望ましくは０℃に冷却下ないし５℃
以下の条件でスターシで静かに撹拌しながら、培養θ液
に８０％飽和になるように固形硫安を徐々に加え塩析を
行なった。

■塩析により析出したタンパクの沈澱は、１０００Ｇで
５分間遠心分離し集め、これを蒸留水に溶解後、５°Ｃ
で２４時間透析を行なった。

■この透析液に対し、５°Ｃ以下で８０％アセトン処理
を行ない、再度１０００Ｇ、５分間遠心分離することに
より沈澱物を得、蒸留水に溶解後、■と同条件て透析を
行なった。

■透析液を凍結乾燥することにより粗酵素粉末を得た。

該酵素粉末は前記のような理化学的性質を有していた。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は本発明の生澱粉分解醇二の加水分
解活性を示すグラフ、第３図は該酵素の至適ｐ［（を、
第４図はＩｌＩｌディ性を、また、第５図は温度安定性
を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記の理化学的性質を有する新規生澱粉分解酵素
。［１］作用：α−アミラーゼと共に作用して生（無蒸煮
）の澱粉を加水分解しグルコースを得る。［２］至適ｐＨ：ｐＨ５．０［３］ｐＨ安定性：各ｐＨの緩衝液中で２０時間処理し
た場合、ｐＨ３〜７において９０％以上の残存活性を示す。［４］温度安定性：各温度で１０分間処理した場合、５
０℃まで安定。
（２）ペニシリウム属に属する生澱粉分解酵素生産菌を
、エピクロルヒドリン架橋澱粉、ソルビトール、ＫＮＯ
＿３、Ｋ＿２ＨＰＯ＿４、ＦｅＣｌ＿３およびＭｇＳＯ
＿４から成る培地で液体培養し、その培養濾液より生澱
粉分解酵素を得ることを特徴とする下記の理化学的性質
を有する新規生澱粉分解酵素の製造法。［１］作用：α−アミラーゼと共に作用して生（無蒸煮
）の澱粉を加水分解しグルコースを得る。［２］至適ｐＨ：ｐＨ５．０［３］ｐＨ安定性：各ｐＨの緩衝液中で２０時間処理し
た場合、ｐＨ３〜７において９０％以上の残存活性を示す。［４］温度安定性：各温度で１０分間処理した場合、５
０℃まで安定。
（３）生澱粉分解酵素生産菌がペニシリウム・ラノスム
（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｌａｎｏｓｕｍ）ＯＧＲ−１
である特許請求の範囲第（２）項記載の新規生澱粉分解
酵素の製造法。
（４）下記の理化学的性質を有する新規生澱粉分解酵素
と市販のα−アミラーゼ剤を配合してなる生澱粉分解酵
素剤。［１］作用：α−アミラーゼと共に作用して生（無蒸煮
）の澱粉を加水分解しグルコースを得る。［２］至適ｐＨ：ｐＨ５．０［３］ｐＨ安定性・各ｐＨの緩衝液中で２０時間処理し
た場合、ｐＨ３〜７において９０％以上の残存活性を示す。［４］温度安定性：各温度で１０分間処理した場合、５
０℃まで安定。