JPS6075253A

JPS6075253A - 醤油醸造法

Info

Publication number: JPS6075253A
Application number: JP58180799A
Authority: JP
Inventors: Shigeomi Ushijima; 牛島　重臣; Tadanobu Nakadai; 中台　忠信; Kinji Uchida; 内田　金治
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1983-09-30
Filing date: 1983-09-30
Publication date: 1985-04-27
Also published as: JPH0533973B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、プロトプラスト融合による高プロテアーゼ生
産能を有し且つ高グルタミナーゼ生産能を有する＃］菌
を用いる醤油醸造法、特に窒素利用率が高（しかもグル
タミノ酸含情が高い醤油醸造法に関する。

醤油は、昔からアミノ酸の旨味を主体とする調味料とし
て日常の食生活に親しまれており、今日、その呈味成分
として亀裂な窒素及びグルタミン酸を高濃度に含有する
醤油乞提供′１−ることは醤油醸造界に−１６い℃は１
つの重要ｌよ課題である。

ところで、高濃度食塩水中で原料の酵素分解を行う醤油
醸造法において、佃油諸味中にや素及びグルタミン酸を
著量遊離蓄積せしめることは、極めて困難である。この
解決法の１つとして従来から酵素作用の阻害乞考慮して
仕込当初の食塩水濃度を刺部したり、或いは諸法中に種
々の微生物起源のグルタミナーゼを添加したりして、醤
油諸法中に窒素及びグルタミン酸を著計蓄積せしめよう
とする方法が行なわれているが、いずれも余分な工程を
必要とじ醸造操作が煩雑となり、特に後者のグルタミナ
ーゼを使用する方法は酵素製造のための設備費と人件費
が余分にかかり、経済的に必ずしも得策ではない。

本発明者らは、゛以上の覗１状を考慮して、醤油諸法中
に著量の窒素とグルタミン酸を遊離蓄積する能力乞有す
る醤油怖菌乞取得し、この鉤菌乞用いて醤油＃をつ（す
、これを食塩水に仕込むことにより醤油諸法中に著緊の
窒素及びグルタミン酸を生成蓄積させることが出来れば
、醤油醸造界にとって極めて大きな貢献となることに着
目し、多くの醤油麹乞対象として、高プロテアーゼ生産
能を有し且つ高グルタミナーゼ生産能を有する麹菌を検
索した。

従来、このような優良な麹菌乞検索する方法の一手段と
して人工変異により酵素生産能乞高めた菌株を取得する
方法が知られているが、取得される変異株はグロテアー
ゼ或いはグルタミナーゼのうち一方については親株に比
べ高（とも他方は逆に低い場合が多（、両方とも親株に
比べ高い菌株水乞ヂ得することは困難であった。

そこで、本発明者らは、高プロテアーゼ生産能乞有し且
つ高グルタミナーゼ生産能を有する麹菌乞得る目的で種
々検討を重ねた結果、アスペルギルス属に属する、高プ
ロテアーゼ生産株と高グルタミナーゼ生産株と？プロト
プラスト融合させ、該融合細胞を高張再生培地に培養し
たところ、そこから高プロテアーゼ生産能を有し、計つ
高グルタミナーゼ生産能を有する麹菌乞取得できること
を知り、この知見に基づいて本発明を完成した。

即ち、本発明はアスペルギルス属て属する、高プロテア
ーゼ生産株と高グルタミナーゼ生産株と乞グロトグラス
ト融合させ、該融合細胞を高張再生培地に培養し、培養
物より高プロテアーゼ生産能をイイし且つ高グルタミナ
ーゼ生産能を有する麹。

菌を分離、採取し、得られた麹菌類−４を醤油物療゛料
に接種培養して麹をつくり、この＠ｊを用いて仕込みを
行うことを特徴とする醤油醗造法である。

以下、本発明の詳細な説明１−る。

先ず本発明で使用するアスペルギルス属に属する高プロ
テアーゼ生産株としては、プロテアーゼ生産能が高いア
スペルギルス属に属する自然菌株が挙げられ、醸造用＃
菌の中からプロテアーゼ生産能の高い菌株を検索するこ
とにより容易に人手することができる−０例えばアスペ
ルギルス・ソーヤ（ＡＴＣＣ４２２４９）、同（ＡＴＣ
Ｃ４２２５０）、同（ＡＴＣＣ４２２５１）等が挙げら
れるが、更にこれらの変種又は変異株も使用することが
できる。

また、アスペルギルス属に属する高グルタミナーゼ生産
株としては、醸造用麹菌の中からグルタミナーゼ生産能
の高い菌株を検索することＫより容易に人手することが
できる。例えば、グルタミナーゼ生産能が高いアスペル
ギルス・ソーヤ２６２（ＦｇルＭ−Ｐ２１２８）、同２
１６５（ＦＥ几Ｍ　Ｐ−りλト′）等が挙げられるが、
更にこれらの変種又は変異株も使用することができる。

次にプロトゲラスト融合に供される菌株として子の長さ
かもとの胞子外径の５〜１５倍のものが好ましく、菌体
の培養は麹菌の培養に用いられる培地７用い常法に従っ
て固体培養、好ましくは液体培養することより行なわれ
る。

培養に用いられる培地としては、アスペルギルス属に属
する菌株が必要とする栄養源乞含有するものであればよ
く、合成培地、半合成培地または天然培地が用いられる
。たとえば合成培地としては炭素源としてグルコース、
サッカロース等、窒素源として硫安、硝安等が用いられ
、その具体例としてはツアペック（Ｃｚａｐｅｋ）培地
に酵母エキス０．５％及びカザミノ酸０２チ乞加え、ｐ
Ｈ６，０に調整した培地が挙げられる。また、天然培地
の組成としては、炭素源として割砕小麦、腕等、窒素源
としてスキムミルク、脱脂大豆等が挙げられる。また、
リン酸、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の適当
な無機塩類を適宜使用することができ、さらに必要に応
じて閑の生育等に必要なアミノ酸、ビタミン類を培地に
添加使用することができる。

培養方法として液体培養を行う場合には、と記の適当な
る培地、たとえばグルコース、スキムミルク等乞適宜含
有させた合成あるいは半合成培地をｐ　Ｉ４６．５前後
に調整し、常法による加熱殺菌処理したものに種菌ケ接
種し、２５〜３．５°Ｃで、発芽胞子の長さかもとの胞
子外径の５〜１５倍に生育する５〜１５時間、静置、振
盪、通気培養等好気的に培養する。また、固体培養を行
う場合は、鞍、小麦などの炭素源、大豆などの窒素源、
その他の有機質あるいは無機質乞原料とし、これら乞蒸
煮などの殺菌処理を行った固体培地に麹菌を接種混合し
、２５〜３８℃で、発芽胞子の長さかもとの胞子外径の
５〜１５倍に生育するのに充分な時間、無菌的に培養す
るのが好ましい。

このようにして培養された高プロテアーゼ生産株または
高グルタミナーゼ生産株からプロトプラストＹ得るには
、各々の菌株について、１０６〜１０８　個／ｍｅ（高
張液）の濃度の各発芽胞子懇泄）液乞調製し、上記各懸
濁液７好ましくは等晴Ｓ混合した後、あらかじめ無菌処
理された細胞壁溶解酵素処理を行うか、または各々の発
芽胞子懸濁液を最初に該細胞壁溶解酵素処理を行うこと
により得られる。

ここに用いられる細胞壁溶解酵素としては、麹菌の細胞
壁乞尋解する活性を有するものであればいずれでもよ（
、例えばセルラーゼ［オツズカル−１０（近畿ヤワルト
社製）」、本発明者らが新たに調製して得たバチラス書
サーキュラ／ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎ
ｓ）ＩＡＭ１１６５株及びストレプトマイセス（Ｓｔｒ
ｅｐｔ　ｏ　ｒｎ　ｙ　ｃ　ｅ　ｓ　）属株起源の陶歯
細胞壁溶解酵素、及びキチナーゼ（米国ＩＣＮ社製）な
どが挙げられる。そして、これらの酵素は単独あるいは
併用して用いることができる。特に本発明者らが実験し
たところ、バチラス・サーキュランス起源の酵素ト＊　
チーＪ−−ゼの併用、またはストレプトマイセス属起源
の酵素とキチナーゼとの併用は、プロトプラストの形成
率を著しく高めることができるので好ましい。

プロトグラス）Ｙ得る際、細胞壁溶解酵素の使用濃度は
、麹菌の細胞壁を溶解しプロトゲラストを得るのに充分
な濃度とすることが好ましく、例えばバチラス・サーキ
ュランス起源の粗酵素（培養濾液の硫安塩析乾燥物）の
場合、１０〜５０■／　ｒｎｌ　、好ましくは、２５〜
３５ｍｇ／ｍｌＱアル。また、キチナーゼを併用する場
合、その使用濃度は１−’　１０　ｍ９／ｍｌ、好マＬ
、、　＜　ハ３〜５　ｒｑｌ　／　ｍｌ　テある。

酵素処理の時間は麹菌の細胞壁乞溶解しプロトゲラスト
を得るのに充分な時間とすることが好ましく、通常３０
分〜°６時間が好ましい。また、ｐＨは６．０〜７．０
が好ましい。このようにして酵素処理が終了したら、プ
ロトプラストＹ保護する溶液、例工ば０．７〜１．５Ｍ
ソルビトールあるいは０．５〜１、ＯＭ塩塩化カリウム
液液でプロトプラストを洗浄し、麹菌の細胞壁が溶解除
去されたプロトゲラストを得る。

次に、ここで得られたプロトプラストの融合処理及び融
合プロトプラストの再生は、例えば、Ａｎｎｅ等の方法
［Ｊ、Ｇｅ　ｎ、Ｍ　１ｃｒｏｂｉｏｌ、。

９２．４１３（１９７６）１に阜じて行なうことができ
る。

即ち、０．７〜１．５Ｍソルビトール、５〜１００ｍＭ
ｃａｃｌｚ及び３０〜８０■ｎＭグリシンヲ含む１５〜
３３チポリエチレングリコール６０００（ｐｌ−１７，
５）中に１．上記で得られた高プロテアーゼ生産株と高
グルタミナーゼ生産株のそれぞれの洗浄プロトゲラスト
を添加混合し、２０〜３０℃で１５〜４５分間処理させ
ることによりプロトゲラスト融合を行なわせる。

融合プロトプラストの再生は、プロトゲラストを保護（
損傷を防止）しつつ育成することが可能な高張再生培地
、例えば、０．７〜１．５Ｍのンルビトールを含む米麹
汁（又は麦芽汁）に寒天２係を含有させた高張再生寒天
培地（ｐＨ６，５）及び、０．７〜１．５Ｍのフルビト
ールを含むツアペック液に寒天２係を含有させた高張最
少再生寒天培地（ｐＨ６，５）に、上記で得た融合プロ
トプラスト’ｆｔ移し、２５〜３５℃で２〜１０日間培
養する方法により行なわれる。

次にこのようにして得られた再生コロニーからプロトゲ
ラスト融合細胞の選別は、予じめ高プロテアーゼ生産株
と、高グルタミナーゼ生産株の洗浄プロトプラストにつ
いてもそれぞれ上記と同様にｌ′ｌ＋生させ、得られた
再生コロニーの色相、色彩、明度、光沢、形状、大きさ
等の特徴乞把握しておくことによって、それらとは異な
る特徴を備えた再生コロニーとして選別することができ
る。

尚、上記麹菌の細胞壁溶解処理７行なう前のそれぞれの
親２株に人工変異処理（Ｘ線、紫外線等の照射、ニトロ
ソグアニジン、エチルメチルサルフィート等の化学変異
処理）を施して、麹菌の分生胞子に特徴のある白色、黄
色、茶、黒褐色などの色や、各種の栄養要求性、例えば
アラニ／、メチオニン等のアミノ酸要求性、ビオチン、
−コチン酸、バラアミノ安息香酸等の要求性、を付与せ
しめた変異株を得、この変異株７用いて上記と同様に酵
素処理、プロトプラスト融合処理を行い、次いで再生さ
せると、変異株のプロトプラストは特徴ある色を有する
ので、この色を有しないプロトグラスト融合細胞を明確
に区別し、選別することができる。また変異株のプロト
プラストは再生の際、特定の栄養源が存在しないと生育
が円錐又は生育出来ないので、特定の栄養源が存在しな
くても生育できるプロトグラスト融合細胞を明確に区別
し選別することができる。再生用の検出培地としては、
親株が変異株でない場合には、それぞれの親株の集落を
区別できる検出培地が、そして親株が栄養要求性を有す
る変異株の場合には一般には最少寒天培地が用いられる
。

上記で喝られる高グロテアーゼ生産株の変異株としては
、例えば分生胞子が白色で、パラアミノ安息香酸要求性
の付与されたアスペルギルス・ソーヤＷ２−９１　（ｌ
ｉ”Ｅ４（、Ｍ　Ｐ−７ジク７　）が挙げられ、また高
グルタミナーゼ生産株の変異株としては、例えば分生胞
子が黄色で、ニコチン酸要求性の伺与されたアスペルギ
ルス・ソーヤＭ１２−２−６１（Ｆｈ；ＩもＭＰ−７ノ
ン／　）等が単げられる。

次に、こうして高張寒天培地または高張最少寒天培地で
再生したプロトプラス）　１４１合株は原親株に戻り易
いヘテロカリオンである場合が多（、不安定である。

そこで、これらのへテロカリオン株の分生１抱子に小出
等の方法［Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

んユ、、７５８（１−９６３）’：］に従って紫外線照
射（距離３９（１ｍ、時間１分〜５分）の処理を施し、
検定することによって、安定な２倍体、即ち目的とする
麹菌＃＝４を分離、採取することができる。

例工ば、アスペルギルス・ソーヤり　−７８は、こうし
て得た高グロテアーゼ生産能を有し且つ高グルタミナー
ゼ生産能を有する安定な２倍体株であり、工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第７４’１　号として
寄託されている。

次にこうして得られた麹菌（［旨グロテアーゼ生産能を
有し且つ高グルタミナーゼ生産能を有する菌体）を通常
の醤油麹原料に接種培養して殉乞っくる。

例えば撥水し、蒸煮した大豆と炒黙割砕した小方の混合
物にアスペルギルス・ソーヤＬ）−７ｓｖ接種混合し、
２８〜３２℃で３〜４日間培養し、醤油麹をつ（る。な
お、醤油麹原料としては醤油醸造に用いられる原料７全
て使用することができる。

次に上記醤油＃乞醤油醸造における通常の仕込割合にて
適当濃度の食塩水に仕込み、醤油醸造の常法に従い適宜
攪拌して３ｍ６ケ月間発酵熟成を行うと、窒素及びグル
タミン酸を著喰に含有スル醤油諸法を得ることができる
。

次に上記のようにして得られた熟成諸法は通常の圧搾、
ｆ過、火入、監引等を行って製品醤油とする。

本発明は、上記の如（麹菌のプロトグラスト融合により
初めて創成された高グロテアーゼ生産能を有し高グルタ
ミナーゼ生産能乞有する麹菌を培・麿して得られた＠を
使用するので、本発明によれば酵素作用の阻害を考慮し
て仕込当初の塩水濃度を調節したり、諸法中に種々の微
生物起源のグルタミナーゼを添加したりする等の余分な
工程乞全（加えることなく、直接的方法によって醤油諸
法中にゆ素及びグルタミン酸を著債蓄積せしめることが
可能となり、また醤油原料が頗るよ（分解されるので総
窒素利用率がこれまでよりも約３係〜１０係増と遥かに
向上し、非常に旨味の強い醤油が極めて簡単に得ること
ができる。

実験例１高りロテアーゼ生産株〔アスペルギルス命ソーヤＷ２−
９１　（ＦｇａＭ　Ｐ−７２７７＞　〕及び高グルタミ
ナーゼ生産株〔アスペルギルス・ソーヤＭｌ　２−２−
６１　（１”ＥｌもＭ　Ｐ−り−ｇ／　）〕を、それぞ
れ試験管のスラント培地（米麹汁寒天培地）に接種し、
３０℃で６６時間培養し、２種類の分生胞子７得た。こ
の分生胞子を、それぞれ１〜５　Ｘ　１０７　個／　ｍ
ｌとなるように、０，０１チソルビタン脂肪酸エステル
溶孜［ソルゲンＴＷ−６０（第−工業製薬社製月に分散
混合し、そのｌ　ｍｌを前培養培地３０　ｍｌ　（ツア
ペック（Ｃｚ　ａ　ｐ　ｅ　ｋ　）培地に酵母エキス０
５φ及びカザミノ酸０．２％加え、ｐ　＋−１６，０に
調整し、これを水で１０倍に希釈して得られたもの〕と
ともに、１５０ｍ１容三角フラスコに入れて混合し、３
０℃で１２時間振盪培養し、発芽した胞子の長さかもと
の胞子の外径の約１０倍の発芽胞子を得た。次いで発芽
胞子懸濁０、を遠心分離（４５００，９’、２０分）し
て、そこから発芽胞子を分離した。次いでこの発芽胞子
乞水洗浄したのち、これに麹菌の細胞壁＠解酵素溶液１
ｍ／！を加え、２７℃で２時間、ゆるやかに振禰培ｑ（
５０〜６０往復／分）し、プロトプラスト？得た。

ここに用いた却］胞壁溶屏酵素溶液はバチラス・サーギ
ュラ／スＩＡＭ１１６５ｙ＜常法により液体培養し、得
られた培養濾液に硫安を加えて塩析し、得られた塩析物
を凍結乾燥して得られた粗酵素と、市販のキチナーゼ剤
（米国ＩＣＮ社製）乞それぞれ溶液１　ｍｌ中に３　Ｑ
　ｍ９及び５　ｍ９の割合で溶解し得られたものである
。

次に、こうして得たプロトプラスト７Ｇ−３規格のガラ
スフィルターにより分離し、これを高張液（０，８Ｍツ
ルビニ・−ル溶液）で数回、繰り返し洗浄し、次いで洗
浄プロトグラス］・ヲ高張７１１１　ｍｌに移し、１懸
濁する。

次いで、それぞれのプロト７”ラストが”Ｍ？蜀さ才ｔ
た高張液ケ混合し、２０℃で遠心分離（７００ｇ、１５
分）してプロトプラストのペレットＹ　？Ｗ　だ。

コＩ”Ｌ　Ｋ　Ｏ，８Ａ４７　ルヒトール、Ｉ　Ｏ＋ｎ
Ｍ、ＣａＣＩ　２及び５０　ｍ　Ｍグリシンヶ含む２０
係ボリエ千レングリ−ｔ−ル６０００　（＋）Ｈ７，５
５（１￥液］−ｍｅ　ｙ　ンｊｊ合し、２５°Ｃで３０
分プロトゲラスト１ヤ１１合反応を行った。

次いで融合プロトゲラスト反応液を高張ｉ（０，８Ｍソ
ルビトール）で希釈し、シャーレ上の硬質高張最少再生
培地〔９８Ｍソルビトールを含むツアペック寒天培地（
寒天２爆）〕に播種し、その北から溶解した軟質高張鎗
少再生培地（死人０．５幅）を流し固化させ重層させ、
３０°Ｃで４〜７日間培養じ、プロトプラスト融合細胞
の再生を行った。

ここで再生した集落乞プロトグラスト融合株として選択
し、これを米麹汁寒天斜面培養（３０℃で４日間）し、
緑色、白色、及び黄色の胞子乞もつヘテロカリオン株を
得る。このようにして得られたヘテロカリオン株の胞子
に、３９ｃｍの距離から紫外線４５分間照射し、得られ
た胞子乞最少寒天培地（平板）に塗布し、３０℃で４日
間培養し１．緑色のみの胞子からなる安定な集落を形成
１−る＠閃＃Ｉ＝＝＃を得る。

グルタミナーゼの生産能について調べたところ、第１表
に示す如き結果が得られた。

第　１　表麹菌の酵素生産能注１．第１表におけるグロテアーゼ活性及びグルタミナ
ーゼ活性の測定法。

脱脂大豆３０ｇと炒黙刑砕小秀３０ｇケ原料として、直
径１５αのシャー７内で、通常の醤油的製造法と同１子
に製麹し、ｉ外られた帰について、水１０倍哨を用いて
２時間抽出し、グロテアーゼ活性についてはアンソン−
萩原法によって測定しへその活性はＱ１９’当り１分間
に１μｒｎｏｌのチロシ／を生成する活性を１単位とし
て表わした。グルタミナーゼ活性は、前記抽出残渣の仰
をホモジナイズして、そのホモジナイズＣ夜とＬ−グル
タミンを３０℃で１時間振盪反応させ、濾過後濾液のグ
ルタミン酸ＩＮ’に測定してめた。グルタミナーゼ活性
は、麹１ｇ当り１分間に１μｍｏｌのグルタミン酸晴を
生成する活性乞１単位として表示した。

第１表の結果から、プロテアーゼが高い株は、グルタミ
ナーゼ活性が低（、また反対にグルタミナーゼ活性が高
い株はグロテアーゼ活性が低いのが一般的麹菌の特徴で
あったが、本発明方法によれば、１０ドプラスト蘭合に
より、両親法の持つ特徴を合わせて有し、グロテアーゼ
活性とグルタミナーゼ活性がともに高い麹繭蔭＃が得ら
れることが判る。

実施例１と記実験例１で得られた本発明麹菌及び対照麹菌（親株
）を用いて醤油醸造試験を行った。

脱脂大豆３００ｇと炒酩割砕小麦３００ｇ’＆原料とし
て、麹蓋にて通常の醤油麹製造法に従って製麹し、得ら
れた麹を２５チ食塩水１２００ｒｎＡ’に仕込み、常法
の諸法発酵管理を行い、３０℃で３ケ月発酵熟成させ、
得られた諸法液汁について、総９素１ｉｄ（ＴＮと略記
する）、グルタミン酸喰（十＋；咲Ｇ　Ｉ　ｕと略記す
る）、ｑｌｕ／ＴＮ及び窒素利用率？測定した。

その結果を第２表に示す。

第２表第２表の結果から、本発明で得られた麹菌菌体を用いて
製麹し、醤油を製造すると、醤油原料が頗る良（分解さ
れて窒素利用率が約す〜１ｏ係増と揺かに向上するばか
りか、グルタミン酸が著しく増加するので、９素そのも
のの質が向上し、非常圧旨味の強い醤油が得られること
が判る。

特許出願人　キッコーマン株式会社

Claims

【特許請求の範囲】

（１）　アスペルギルス属に属する、高プロテアーゼ生
産株と高グルタミナーゼ生産株とｔプロトプラスト融合
させ、該融合細胞を高張再生培地に培養し、培養物より
高プロテアーゼ生産能を有し且つ高グルタミナーゼ生産
能を有する麹菌を分離、採取し、得られた紬菌菌噂を醤
油額原刺に接種培養して麹をつくり、この鈎ヲ用いて仕
込みを行うことを特徴とする醤油醸造法。