JP2009095280A

JP2009095280A - 黄麹菌変異株の育種方法

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Publication number: JP2009095280A
Application number: JP2007269956A
Authority: JP
Inventors: Yoshisato Hanya; 吉識半谷; Taiji Koyama; 泰二小山; Kotaro Ito; 考太郎伊藤; Junya Takechi; 順也武市; Teruo Otsuka; 照雄大塚; Kazunari Narumi; 一成鳴海; Katsuya Sato; 勝也佐藤; Yasuhiko Kobayashi; 泰彦小林; Tetsuya Sakashita; 哲哉坂下; Sumihiro Hase; 純宏長谷
Original assignee: Kikkoman Corp; Japan Atomic Energy Agency
Current assignee: Kikkoman Corp; Japan Atomic Energy Agency
Priority date: 2007-10-17
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2009-05-07

Abstract

【課題】付随変異が少なく、従来の変異方法では獲得できなかった黄麹菌の変異株、例えば、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌、並びに遺伝子の欠失変異株（ｐｙｒＧ変異株）などを得る。
【解決手段】アスペルギルス・ソーヤ及び同・オリゼ等の黄麹菌に重イオンビームを照射し、その照射体及びその培養物から変異の生じた黄麹菌を選択することにより所望の微生物学的特長を有する黄麹菌の変異株を得る。
【選択図】なし

Description

本発明は黄麹菌に重イオンビームを照射し、その照射体及びその培養物から変異の生じた黄麹菌を選択することを特徴とする黄麹菌変異株の育種方法に関する。

黄麹菌は、日本の伝統食品である醤油、味噌、日本酒、みりんなどの醸造に利用される微生物である。黄麹菌は、これらの食品製造において、主に原料を分解する役割を担っている。醤油を例にとると、原料である大豆と小麦に黄麹菌を生育させ、麹を製造する。この段階で麹菌は大豆や小麦のタンパク質、糖質などを分解する酵素を生産する。ここでの分解率が高いと次工程の乳酸発酵、酵母発酵が適正に行われ、製品の品質向上に大きく寄与する。また、タンパク質を高分解することにより、製品の歩留まりが向上し、生産性を向上することができる。これらのことから、黄麹菌の改良は、酵素生産性を向上させることを主な目的として、これまでも精力的に行われている。

黄麹菌の育種方法としては突然変異方法、遺伝子組換え方法がある。遺伝子組換え方法は、効率的に目的株を育種することができる方法であるが、遺伝子組換え技術を食品に応用していくことが日本市場においてはまだ受け入れられていないため、現実の食品製造に使用するのは問題がある。そのため、今でも従来からの突然変異方法が黄麹菌の育種の主流である。突然変異の方法としては紫外線照射、ニトロソグアニジンなどの薬剤による変異などが行われてきたが、どちらの方法も付随変異が多いという欠点がある。つまり、ひとつの菌株に同時に変異が多数生じてしまうため、目的以外の形質も変化してしまうという問題点がある。付随変異により、菌の生育が遅くなる、他の酵素生産性が低下するなどの問題が頻繁に生じ、実用上有望な変異株を取ることが非常に困難である。

また、これらの変異方法は長年実施されてきているが、場合によってはこれらの変異方法では得ることができない変異株があることが知られている。例えば、醤油麹菌においてはプロテアーゼとグルタミナーゼを同時に高生産する株を得ることは非常に困難であることが報告されており、これを解決するために細胞融合法が用いられている（特許文献１参照）。また、紫外線照射、ニトロソグアニジンなどの薬剤による従来の変異方法によると、得られる変異株は塩基置換や塩基挿入、あるいは、わずかな数の塩基の欠失に伴うものがほとんどで、大規模に塩基が欠失した変異株を得ることは困難であった。さらに、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０株（独立行政法人酒類総合研究所、菌株保管）は既にゲノム解析が行われた麹菌であり、遺伝子組換え技術の宿主として非常に重要な株であるが、これを親株としてｐｙｒＧ変異株が紫外線照射、ニトロソグアニジンなどの従来の突然変異方法では得られないことが知られている。ｐｙｒＧ変異株は形質転換を行う際の宿主であるため、この変異株が得られないことは遺伝子組換え技術進展に大きな問題を与える。

このように黄麹菌は醸造食品産業上、また遺伝子工学産業上において重要な微生物であるが、育種に関して上記のような問題があるため、効果的な育種方法を開発することは大きな課題である。また、黄麹菌は黒麹菌などの他の麹菌と異なり、細胞内に複数の核を持っているため、変異を困難にしている。これらのことを背景に、黄麹菌の育種において、効率的で効果的な変異方法の確立が求められている。
特公平３−７３２７１号公報

本発明の課題は、付随変異が少なく、従来の変異方法では獲得できなかった黄麹菌の変異株を得る、黄麹菌変異株の育種方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意研究を重ねた結果、重イオンビームを照射する方法を用いて黄麹菌を変異し、その中から従来の変異方法では得ることができなかった変異株を得ることができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下に示す黄麹菌変異株の育種方法である。
（１）黄麹菌に重イオンビームを照射し、その照射体及びその培養物から変異の生じた黄麹菌を選択することを特徴とする黄麹菌変異株の育種方法。
（２）黄麹菌が、アスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである上記（１）に記載の黄麹菌変異株の育種方法。
（３）重イオンビームが、⁴Ｈｅ²⁺、²⁰Ｎｅ⁸⁺及び¹²Ｃ⁵⁺からなる群のいずれかを線源とする上記（１）に記載の黄麹菌変異株の育種方法。
（４）変異の生じた黄麹菌が、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌である、上記（１）〜（３）のいずれかである黄麹菌変異株の育種方法。
（５）変異を生じた黄麹菌が、アスペルギルス・ソーヤＩ６７−１（ＮＩＴＥＡＰ−４３０）である上記（４）に記載の黄麹菌変異株の育種方法。
（６）黄麹菌に重イオンビームを照射し、その照射体及びその培養物から遺伝子の欠失変異株を得ることを特徴とする黄麹菌変異株の育種方法。
（７）黄麹菌変異株が、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０ｐｙｒＧ-（ＮＩＴＥＡＰ−４３１）である黄麹菌変異株の育種方法。

本発明によれば、付随変異が少なく、従来の変異方法では獲得できなかった黄麹菌の変異株（例えば、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌）、並びに遺伝子の欠失変異株（アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０を親株としたｐｙｒＧ突然変異株）を得ることができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る黄麹菌は、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼに属する任意の菌株が挙げられる。このような菌株としては、従来の醤油、味噌又は清酒の醸造に使用する麹菌が挙げられ、例えば、アスペルギルス・ソーヤ２６２（ＦＥＲＭＰ−２１８８）、アスペルギルス・ソーヤ２１６５（ＦＥＲＭＰ−７２８０）及びアスペルギルス・オリゼ（ＩＡＭ２６３８）、アスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ４２２５１などが挙げられる。

次に、重イオンビームを照射するには、上記菌株の分生子、凍結乾燥させた分生子、発芽分生子、発芽後５℃程度まで冷却した分生子などの胞子懸濁液を、通常の寒天平板培養培地、例えば、マルツ培地（マルツエキス９％、酵母エキス０．５％、寒天２％ｐＨ６）等に０．２〜２０×１０⁶個塗布し⁴Ｈｅ²⁺、²⁰Ｎｅ⁸⁺及び¹²Ｃ⁵⁺などをイオン源とした重イオンビームを照射する。
重イオンビームの線量は２５〜２，５００Ｇｙが好ましく、５０〜８００Ｇｙがより好ましく、１００〜５００Ｇｙが最も好ましい。
この重イオンビームの照射は、例えば、独立行政法人日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所のＴＩＡＲＡを用いることができる。

照射後は、同培地で２５〜３５℃で２〜６日間培養し、分生子を着生させ、この分生子を回収し、変異の生じた黄麹菌を選択する。

変異の生じた黄麹菌を選択する場合の例としては、プロテアーゼ生産能の高い変異株を選択する方法が挙げられる。この方法は、カゼインプレートに、照射した麹菌株を接種し、麹菌の生育適温にて適当時間培養し、培養後、コロニーの周りにできるクリアゾーンの大きい株を選択し、その株について醸造特性を調べ、プロテアーゼ生産能の高い変異株をスクリーニングする方法で行われる。

本発明によれば、付随変異が少なく、従来の変異方法では獲得できなかった黄麹菌の変異株、例えば、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌、並びに遺伝子の欠失変異株、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０を親株としたｐｙｒＧ突然変異株を得ることができる。

（非常に高いプロテアーゼ活性を示しながらも、グルタミナーゼ活性が親株並みの高いレベルを維持している黄麹菌の育種方法）
（重イオンビーム照射に麹菌の育種法）
親株としてアスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ４２２５１を使用した。
アスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ４２２５１の分生子をマルツ培地（マルツエキス９％、酵母エキス０．５％、寒天２％ｐＨ６）に約２×１０⁶個塗布し、¹²Ｃ⁵⁺をイオン源として２５０Ｇｙの強度で照射を行った。
重イオンビームの照射は、独立行政法人日本原子力研究開発機構高崎量子応用研究所のＴＬＡＲＡを用いて行った。
照射後、３０℃で４日間培養し、分生子を着生させた。この分生子を回収し、カゼインプレートによる高プロテアーゼ変異株のスクリーニングを行った。

（カゼイン培地によるスクリーニング）
回収した分生子を約４００個／ｍｌになるように滅菌水で希釈した。
この希釈液を５０μｌずつカゼイン培地（ミルクカゼイン０．４％、カザミノ酸０．０５％、リン酸１カリウム０．３６％、リン酸２ナトリウム１．４３％、硫酸マグネシウム０．５％、硫酸第二鉄０．００２％、寒天２％ｐＨ６．５）（％はｗ／ｗ％を意味する）に塗布し、３０℃で４日間培養した。培養後、コロニーの周りにできるクリアゾーンの大きい株を選択し、その株について醸造特性を調べた。

醤油麹の製造法は定法に従って行った。すなわち、蒸煮した脱脂大豆と焙炒割砕小麦を５０：５０の割合で混合し、ここに種麹を１／１０００量（ｗ／ｗ）加え、３日麹で製麹した。

得られた麹の分析は以下のようにして行った。
（プロテアーゼ活性の測定法）
麹に１０倍量の蒸留水を加え、よく混合し、２時間室温で放置した。これをＮＯ．２の濾紙（アドバンテック社製）で濾過し、得られた抽出液を酵素サンプルとして、「しょうゆ試験法」（財団法人日本醤油研究所昭和６０年）に記載の方法に従って測定した。
プロテアーゼ活性は、麹１ｇ当り１分間に１μモルのチロシンを生成する活性を１Ｕ（ユニット又は単位）として示した

（グルタミナーゼ活性の測定法）
麹に５０倍量の蒸留水を加え、ポリトロンで１分間破砕したものを酵素サンプルとした。この酵素サンプル７ｍｌに０．１ＭＬ−グルタミン溶液（１Ｍトリス、０．１Ｍ塩酸ヒドロキシルアミンｐＨ８）５ｍｌを加え、よく混合した後、３０℃で１時間反応させた。反応は、停止液（５０ｇ塩化第二鉄／１０００ｍｌ８．４Ｎ塩酸）２ｍｌを入れることで停止した。この液をＮＯ．５Ｃの濾紙（アドバンテック社製）で濾過した。この濾液の吸光度を４２０ｎｍで測定した。活性はテストの吸光度から酵素ブランク、水ブランクの吸光度を引いた後、係数として６．０３をかけてＵ／ｇ麹とした。
グルタミナーゼ活性は、麹１ｇ当り１分間に１μモルのグルタミン酸量を生成する活性を１Ｕ（ユニット又は単位）として示した。

得られえた変異株アスペルギルス・ソーヤＩ６７−１の麹分析値を表１に示す。

表１の結果から、変異株は、一番手入れ品温が親株と同等であり、生育も良好で、付随変異が生じていないことが確認された。また、これまでは突然変異により高プロテアーゼ変異株を得るとグルタミナーゼは親株よりも低下してしまうことが知られていたが、ここに示すとおり、Ｉ６７−１は非常に高いプロテアーゼ活性を示しながらも、グルタミナーゼも親株並みの高いレベルを維持していることがわかる。なお、アスペルギルス・ソーヤＩ６７−１は、平成１９年１０月２日付けにて、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターへ寄託し、受領番号：ＮＩＴＥＡＰ−○○○を得ている。

（アスペルギルス・ソーヤオリゼＲＩＢ４０由来のｐｙｒＧ変異株の育種方法）
ｐｙｒＧ変異株の獲得は定法に従って行った。
すなわち、Ｃｚａｐｅｋ−ＤｏｘＢｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に１０ｍＭウリジン、３ｍｇ／ｍｌ５−フルオロオロチン酸を加えたｐｙｒＧ変異株選択培地に重イオンビーム変異処理した分生子を塗布し、生育してきたコロニーをｐｙｒＧ変異株候補株としてピックアップした。

得られたｐｙｒＧ変異株候補株３３株を親株にして、それぞれｐｙｒＧ遺伝子を形質転換し、相補試験を行った。その結果、１株形質転換体を得ることができ、これをＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅＲＩＢ４０ｐｙｒＧ−株とした。なお、この菌株は、平成１９年１０月３日付けにて、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターへ寄託し、受領番号：ＮＩＴＥＡＰ−４３１を得ている。

（アスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ４２２５１由来の欠失変異株の育種方法）
一般にアスペルギルス・ソーヤは野生型では緑色の分生子を着生するが、稀に白い分生子を形成する突然変異株を得ることができる。この突然変異株の一部はｗＡ遺伝子に変異が入ることで得られることが知られているので、この遺伝子の変異を調べることで重イオンビームによる変異のパターンを解析した。実施例２と同様にして重イオンビームによる変異株を得た。比較のため、常法により紫外線変異で、白い分生子を形成する変異株を得た。そして変異株のｗＡ遺伝子配列を解析した。

重イオンビーム変異で得た白色変異株は１１４株中３８株が欠失変異株であったのに対し、紫外線変異で得た白色変異株は３８株中１株も欠失変異株が得られなかった。なお、重イオンビームで得られたｗＡ遺伝子の欠失に伴う白色変異株ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅｗＡ−ＩＢは、平成１９年１０月３日付けにて、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターへ寄託し、受領番号：ＮＩＴＥＡＰ−４２８を得ている。また紫外線変異で得たｗＡ遺伝子の塩基置換による白色変異株ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｓｏｊａｅｗＡ−ＵＶは、平成１９年１０月３日付けにて、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターへ寄託し、それぞれ受領番号：ＮＩＴＥＡＰ−４２９を得ている。

Claims

黄麹菌に重イオンビームを照射し、その照射体及びその培養物から変異の生じた黄麹菌を選択することを特徴とする黄麹菌変異株の育種方法。
黄麹菌が、アスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼである請求項１に記載の黄麹菌変異株の育種方法。
重イオンビームが、⁴Ｈｅ²⁺、²⁰Ｎｅ⁸⁺及び¹²Ｃ⁵⁺からなる群のいずれかを線源とする請求項１に記載の黄麹菌変異株の育種方法。
変異の生じた黄麹菌が、１，１００Ｕ／ｇ麹以上のプロテアーゼ生産能を有し、２．０Ｕ／ｇ麹以上のグルタミナーゼ生産能を有する麹菌である、請求項１〜３のいずれかである黄麹菌変異株の育種方法。
変異を生じた黄麹菌が、アスペルギルス・ソーヤＩ６７−１（ＮＩＴＥＡＰ−４３０）である請求項４に記載の黄麹菌変異株の育種方法。
黄麹菌に重イオンビームを照射し、その照射体及びその培養物から遺伝子の欠失変異株を選択することを特徴とする黄麹菌変異株の育種方法。
黄麹菌変異株が、アスペルギルス・オリゼＲＩＢ４０ｐｙｒＧ-（ＮＩＴＥＡＰ−４３１）である黄麹菌変異株の育種方法。