HU189407B - Process for producing proliferating plant cell-formations - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás protoplasztokból (sejtek sejtfalon belüli állománya) képezett növényi sejtek termesztése illetve szaporítása agaróz-táptalaj alkalmazásával.

A föld népességének gyors növekedésére való tekintettel a biológiai kutatások egyik súlypontját az értékesíthető növények tenyésztése képezi.

Egyrészről alternatív, reprodukálható élelmiszer-, energia- és nyersanyagforrások, mint például előnyös tulajdonságokkal, például betegség-kórokozókat (mint növénypusztító rovarok, gombák, baktériumok, vírusok és hasonlók), továbbá időjárási vagy helyi hatások (mint hőség, hideg, szél, talajminőség, nedvesség, szárazság és mások) iránt fokozott ellenállóképességgel rendelkező, vagy a levelekben, magokban, gumókban, gyökerekben, szárakban és hasonlókban fokozott tartalék- és készletképzésre képes új növény-, különösen hibridfajták után kutatnak. Másrészről az értékes biomasszák iránti kereslet mellett fokozódik a gyógyszerészetileg hasznosítható növényi hatóanyagokkal és ezek származékaival, mint például alkaloidokkal, szteroidokkal és hasonlókkal szembeni kereslet, amelyeket természetes előfordulású anyagokból való alacsony kitermelésük miatt egyre inkább alternatív úton, például génmanipulált növényfajtákból tesznek hozzáférhetővé.

Ezért fokozódó érdeklődés mutatkozik számos növényfajta célzott génmanipulációjának gyakorlati lehetőségeivel szemben.

Mint ismeretes, magasabbrendű növények izolált, totipotens sejtjei polimertartalmú táptalajokon (vagy táptalajokban) embrionális sejtformáció kialakítására és egyes esetekben élet- és szaporodóképes növények létrehozására késztethetők. Mivel azonban a viszonylag szilárd sejtfalak általában áthidalhatatlan gátat képeznek a manipulációk, mint sejtfúziók vagy génátültetések számára, ilyen esetekben előnyösen a csupasz protoplasztokat használják, melyek a sejtfalak önmagában ismert módon való eltávolítása útján, például enzimek (pektinázok, cellulózok és mások) segítségével a megfelelő totipotens, ép sejtekből állíthatók elő.

Növényi sejtek és különösen protoplasztok táptalajához gélképző anyagként eddig szokásosan agart használtak. Megállapítható azonban, hogy az agar a legtöbb protoplasztfajtára nézve mérgező és csak néhány kivételes eset ismeretes, amikor különlegesen ellenállóképes protoplasztok agarban eredményesen tenyészthetők.

Ezért az utóbbi időben kutatások kezdődtek el más, előnyös táptalajok iránt. Egyebek között megállapították, hogy az alginát és az agar azonos értékű tenyésztési tulajdonságokkal rendelkezik (Adaoha-Mbanaso É. N., Roscoe D. H., Plánt Sd. 25, 61-66 (1982)).

Agarózt eddig kizárólag állati sejtek tenyésztéséhez és mikroorganizmusok szaporításához alkalmaztak. Növényi sejtek tenyésztésénél azonban a teljesen eltérő fiziológia miatt egészen más problémakörrel állunk szemben. Az állati sejtek szaporítási módszerei növényi sejtek szaporítására kényszerűen nem vihetők át, éppoly kevéssé, mint növényi formációknak protoplasztokból való előállítására.

A találmány célkitűzése ezért azoknak a nehézségeknek a leküzdése, melyek növényi protoplasztokból nyert sejtkultúrák agaron vagy tisztított agaron való tenyésztésénél fellépnek, és nemcsak különösen erőteljes, hanem minden protoplasztfajtára általánosan alkalmazható eljárás kidolgozása, melynek során sejtformációk illetve embrionális növények tenyésztése a tápközeg növénymérgező hatásának elkerülése mellett egyszerű, a gyakorlatnak megfelelő módon lehetséges. E feladatot a találmány szerint meglepő módon oldottuk meg.

Az agar egyik alkotórésze az agaróz. A kereskedésbeli agar ugyanis főleg semleges agaróz és nagyszámú kötött oldalcsoportot tartalmazó ionos agaropektin keverékéből áll. A szokványos minőségű agarózt általánosan ismert módszerekkel agárból állítják elő. Általában visszamarad néhány oldalcsoport, melyek alapvetően meghatározzák a fizikokémiai tulajdonságokat, mint a gélképződést és a gélesedési és olvadási hőmérsékletet. .

Alacsony hőmérsékleteken olvadó és gélesedő agaróz például úgy állítható elő, hogy az agarózmolekulába utólag hidroxi-etil-csoportokat visznek be. Az így módosított agarózt itt és az alábbiakban LMT-agaróznak („low melting agarose”) nevezzük.

Meglepő módon azt találtuk, hogy a protoplasztokból képződött növényi sejtek agarban való szaporításánál fellépő nehézségek - különösen a protoplasztok nagyfokú pusztulása - lényegesen csökkenthetők, ha agar helyett agarózt használunk. A protoplasztokból nyert sejtek szaporodása még tovább fokozható, ha nemcsak agarózzal, különösen LMT-agarózzal szilárdított táptalajt használunk, hanem a protoplasztokkal beoltott táptalajt még kisebb szegmensekre is felosztjuk és ezeket a szegmenseket egyesével vagy csoportosan tápoldatban inkubáljuk kívánt nagyságú sejtformációk képződéséig.

Egyáltalában nem volt előrelátható, hogy a tetszőleges eredetű agaróz a különféle protoplasztfajták - különösen az érzékeny protoplasztfajták sejttenyészeteinek képződési készségét olyan döntően képes fokozni, hogy eddig nem tenyészthető protoplasztfajták is most már sejtformációk, sőt egész növények képzésére késztethetők.

A találmány tárgya eljárás proliferáló (szaporodó) sejtformációk előállítására, mely szerint (a) izolált protoplasztokat, vagy izolált, protoplasztokból regenerált sejteket agarózzal szilárdított tápkozegben (vagy tápközegen) egyenletesen szétoszlatunk, és/vagy (b) ezt az előkezelt és gélesített táptalajt felaprítjuk, a kapott szegmenseket tápfolyadékba helyezzük, és a tenyészetet mindkét esetben a sejtformációk kívánt nagyságának eléréséig folytatjuk.

Sejtformáció alatt áttekinthető (számlálható) mennyiségű növényi sejtekből vagy kész növényekből álló tenyészetek értendők.

Különösen előnyben részesítjük a proliferáló növényi sejtformációk előállítására szolgáló eljárást, mely szerint (a) izolált protoplasztokat vagy izolált, protoplasztokból regenerált sejteket agarózzal gélesített tápközeg(b)en egyenletesen szétoszlatunk, vagy (b) ezt az előkezelt és gélesített táptalajt felaprítjuk, a szegmenseket 1-10 000-szeres, előnyösen

189 407

5-10 000-szeres, különösen 2-100-szoros térfogatú, növénysejtszaporitásra alkalmas tápoldatba helyezzük és a tenyésztést mindkét esetben 0-40 ’C hőmérsékleten, a kívánt nagyságú sejtformációk eléréséig folytatjuk.

A sejtformációk tenyésztéséhez különösen előnyös hőmérséklet a 12-30 ’C.

Az érdeklődés előterében a protoplasztokból származó növények technikai-ipari tenyésztése áll.

Az új eljárásnál célszerűen a mikroorganizmusok szaporítására szokásosan használt lemezes tenyésztő módszert úgy módosítjuk, hogy az ismert módon izolált, sterilezett és tisztított protoplasztokat agar helyett agarózzal szilárdított (táp)közegben veszszük fel, a protoplasztokat benne egyenletesen diszpergáljuk és a protoplasztokkal így beoltott és agarózzal gélesített közeget kisebb, előnyösen egyenletes szegmensekre osztjuk fel, e szegmenseket egyenként vagy együttesen megfelelő tápoldattal részben megtöltött tartályba helyezzük és azt az említett hőmérsékleteken, adott esetben sötétben, egyenletesen addig rázatjuk, amíg kívánt nagyságú sejtformációk vagy embrionális, életképes növénykék képződnek.

A sejtformációkkal átjárt agarózszegmensek kiválóan alkalmasak bioreaktorokban való ipari szintű továbbtenyésztésre, értékes alkotórészek kinyerése céljából.

Embrionális növénykék érett növényekké, például előnyös tulajdonságokkal rendelkező hibridnövényekké tenyészthetők és biológiailag normális úton továbbszaporíthatók.

A „szegmens” kifejezést helyettesítőleg alkalmazzuk itt háromdimenziós, szokásosan azonos nagyságú képződményekre, melyek szabálytalan vagy előnyösen szabályos térbeli kiteqedésűek, például hasábok, gömbök, kockák, prizmák, kúpok és hasonlók lehetnek; közepes átmérőjük körülbelül 1-100 mm, előnyösen körülbelül 2-60 mm, különösen 2-10 mm. A sejtformációk fermentorokban történő ipari továbbtenyésztéséhez különösen a közepes átmérőjű, gömb alakú szegmensek alkalmasak.

A találmány szerinti eljárás hatékonyabb számos ismert eljárásnál, különösen nehezen kezelhető illetve érzékeny protoplasztokból származó sejttenyészetek előállításánál. Az eljárás egyszerűen hajtható végre és úgy különféle eredetű protoplasztokhoz, mint fuzionált, valamint génmanipulált protoplasztokhoz alkalmazható. A bevezetőben leírt egy vagy több előnyös tulajdonsággal rendelkező növényi sejtkultúrák szelektív tenyésztésére alkalmas. Ezenfelül daganatszövetből nyert protoplasztokhoz is használható.

Agaróznak növényi sejtek illetve sejttelepek tenyésztésére való alkalmazása tehát a találmány szerint eljárás alapvető része, ugyanakkor mindegy, milyen agarózfajtát használunk, minthogy a különböző agaróztipusok a találmány szerinti felhasználásuk szempontjából csak fokozatokban térnek el egymástól és az agárhoz viszonyítva lényegesen alkalmasabbak protoplasztokból nyert növényi sejtformációk tenyésztéséhez.

Bár az alábbi 1-5. példa kísérleti eredményei már kétséget kizáróan mutatják, hogy protoplasztokból nyert növényi sejttenyészeteknél az agaróz minden esetben felülmúlja az agart, a gyakorlatban agaróz alkalmazásakor is jelentkezik bizonyos probléma. Egyes esetekben ugyanis megfigyelhető, hogy egy előrehaladott fejlődési fázisban a sejtformációk képződése leáll, sőt elhalás is bekövetkezik: az elsőként említett jelenség valószínűleg a táptalaj bizonyos kimerülésére vagy kilúgozódására, az utóbbi pedig a növekedő sejtformációk mérgező kiválasztási termékeinek felszaporodására vezethető vissza. Meglepő módon azonban mindkét nemkívánatos hatás egyszerű módon kiküszöbölhető. Ha ugyanis az agarózzal szilárdított és protoplasztokkal beoltott primer táptalajt kisebb, előnyösen egyenletes nagyságú illetve formájú szegmensekre osztjuk fel és e szegmenseket például rázótartályban, előnyösen nagyobb térfogatú, alkalmas tápfolyadékkal átöblítjük, akkor a sejtformációk akadálytalan növekedése figyelhető meg. Ugyanakkor bizonyos körülmények között előnyös, ha a protoplasztfajtától függően az agarózzal megszilárdított táptalaj szegmentálását a protoplasztokkal való beoltást követő 0-7 nap, a legtöbb esetben 3-4 nap múlva hajtjuk végre Petúnia-protoplasztok esetében a beoltás utáni 4. nap, dohánynál és Crepis capillaris-nái a 3. nap bizonyult a legmegfelelőbb időpontnak. Brassica rapa protoplasztoknál a szegmentálást legjobb az agaróz gélesedése után azonnal elvégezni.

Az agaróznak szilárdító táptalajként való alkalmazása mellett a találmány fontos részét képezi az agarózzal megszilárdított és a protoplasztokkal beoltott táptalaj alkalmas szegmensekre való feldarabolása. A találmány körébe tartoznak a leírt eljárással nyert sejtformációk illetve növények is.

A találmány szerinti eljárás keretében alkalmazott tápoldatok a sejtnövekedés gyorsítása céljából szerves vegyületek nyomait is tartalmazhatják, mint például vitaminokat, szénforrásokat, mint nádcukrot és glükózt, fitohormonokat, mint auxint és citokinint, és természetes kivonatokat, mint malátakivonatokat vagy kókusztejet és szükség esetén egyéb adalékokat. A tenyésztési illetve inkubálási körülmények, mint például a táptalaj hőmérséklete, fényhatás és az inkubálás illetve továbbtenyésztés időtartama, a mindenkori adottságokhoz, mint a növény- illetve protoplasztfajtákhoz, vagy a kísérlet méretéhez alkalmazkodnak.

A használható protoplasztok nyerését az alábbi a-c. előírásokban részletesen leírjuk, de a szóban forgó sejttenyészet a növény tetszőleges szervéből vagy szövetéből, például a gyökerekből, szárakból, levelekből, virágokból, magokból, pollenből és hasonlókból, például kallusz (sebkéreg) tenyészetekből is származhat. A protoplasztok előállítására szolgáló módszerek általánosan ismertek és nem korlátozódnak az a-c. előírásokban megadottakra.

Előírások tiszta protoplasztok előállításához

a) Előírás: 0,25 M szorbitot, 0,025 M CaCl₂ 2H₂O-t és 0,5% [w/v] 2-/n-morfolin-etánszulfonsavat (MES) tartalmazó, 5,2 pH-jú oldatban 4% [w/v] celluláz Onozuka R. 10-et (Yakult Co. Ltd. Japán), 2% [w/v] drizelázt (Chemische Fabrik Schweizer3

-3189 407 halle, Svájc) oldunk és a Hyoscyamus muticus nemzetség auxotróf (csak életfontosságú vegyületeket tartalmazó táptalajban szaporodó) sejtvonalának tenyészetéből önmagában ismert módon előállított szuszpenziót protoplasztok nyerése céljából a fenti oldattal kezeljük. Az inkubálást sötétben, éjszakán át 26 ^eC-on hajtjuk végre. Ezután a keveréket acélszitán (pórusátmérő 100 pm) átszűrjük és a szűrletet azonos térfogatú 0,6 M szacharózoldattal hígítjuk. A hígított szűrletre 0,16 M CaCl₂ · 2H₂O-t és 0,5% [w/v] MES-t (pH 5,6) tartalmazó oldatot rétegzünk és a képződött protoplasztokat a két réteg határfelületén összegyűjtjük, kétszer átmossuk a rárétegzésre használt oldattal és Gebhardt és munkatársai (Planta 153, 81-89 (1981)) szerint előállított B1 médiumban tároljuk. (A „B1 médium”-ot a továbbiakban A/ táptalajként jelöljük meg).

b) Előírás: Nicotina tabacum VR2 sejtvonalának protoplasztjait Shillito és munkatársai (Mutat. Rés. 81, 165-175 (1981)) szerint izoláljuk. E protoplasztok tisztítását azonban úgy módosítjuk, hogy azokat az enzimtartalmú oldatban való inkubálás után 1/2 térfogat 0,6 M szacharózoldattal hígítjuk, a hígított keveréket az a) példa szerint az említett CaCl₂-oldattal felülrétegezzűk, a határfelületen a protoplasztokat összegyűjtjük, az említett CaCl₂-oldattal mossuk, majd az a) előírás szerint járunk el és a protoplasztokat K3 médiumban (az alábbiakban BXtáptalaj) tenyésztjük.

c) Előírás: a haploid (egyszeres kromoszómasorozatot tartalmazó) „Mitchell” két Petúnia hybrida sejtvonalának - melyet M. Hanson (Charlottenville, VA, Amerikai Egyesült Államok) bocsátott rendelkezésre - és „Mutator-Gen Petúnia” (Potrykus I., Z. Pflanzenzüchtung 63,24-40 (1970)) izolálása.

Fiatal, teljesen kifejlődött leveleket 10 percig 0,01 % [w/v] HgCl₂-ot és 3 csepp Tween 80-at tartalmazó 100 ml oldattal sterilezünk és ötször desztillált vízzel mosunk. Mindig középér nélküli 6 levélfelet teszünk egymásra, izozmotikus oldattal (0,375 M mannit, 0,05 M CaCl₂,0,5% [w/v] MES; pH 5,8) megnedvesítjük és vékony, 0,5 mm széles csíkokra vágjuk. Ezeket a csíkokat vákuumban átitatjuk az enzimoldattal (0,2% [w/v] celluláz Onozuka R. 10, 0,2% [w/v] macerozim; pH 5,6, a fenti izozmotikus oldatban). Az inkubálást éjszakán át, 12’C-on, sötétben hajtjuk végre. Végül a fenti izozmotikus oldat 1 térfogatát adjuk hozzá és a keveréket 10 pm pórusméretű szitán átszűrjük. A protoplasztokat kétszer mossuk az izozmotikus oldattal és a nem kívánatos melléktermékek kiküszöbölése céljából 0,6 M szacharózoldatot rétegzünk alája. A határfelületen kinyert protoplasztokat még egyszer tisztítjuk az izozmotikus oldattal és tenyésztő táptalajban (Durand és munkatársai szerint, Z. Pflanzenphysiol. 69, 26-34 (1973)) 12 óráig sötétben, 26 ’Con inkubáljuk.

Az összehasonlító vizsgálatok alábbiakban közölt eredményei meggyőzően szemléltetik azokat a meglepő, előnyös kihatásokat, melyek (a) az agárnak agarózzal való helyettesítése és (b) az agarózzal gélesített tápközegek szegmentálása következtében növényi sejtformációk protoplasztokból való tenyésztésekor megfigyelhetők.

Táptalajként agart és agarózt alkalmazó összehasonlító vizsgálatok példái

a) Kísérleti körülmények

Minden táptalajt ultraszűréssel (Nalgene-szűrő, pórusátmérő 0,22 pm) sterilezünk. Gélesedő táptalajok előállítása céljából kétszeres töménységű tápoldat azonos térfogatát kétszeres töménységű és autoklávozott gélesítőszerrel keverjük össze. Folyékony tápoldatként például az A, B, C, D és E jelzésű alábbi tenyésztőközegek illetve tápoldatok alkalmazhatók:

A) Komplett B1 médium: Gebhardt és munkatársai, Planta 753, 81-89 (1981).

B) K3 médium: Nagy és Maliga, Z. Pflanzenphysiologie 78, 453-455 (1976).

C) DPD médium: Durand és munkatársai, Z. Pflanzenphysiologie 69, 26-34 (1973).

D) : Linsmaier, E. M. és Skoog, F. szerint, Physiologia Plantarum 18, 100-127 (1965).

E) : Nitsch, J. P. és Nitsch, C. szerint, Science 163, 85-87 (1969).

Gélesítő- és sűrítőszerekként az alábbiakat használjuk :

1. Agaróz: minden esetben „Sea Plaqne LMT” (Maríné Colloids). (Csak az alábbi 5. példában leírt kísérletekben használunk további, ott megadott agarózfajtákat).

2. Agár: minden kísérletben Difco-Bacto-Agár.

3. Tisztított agar: 454 g agart (Difco-Bacl< - Agár) egymás után 10 liter vízzel, 5 liter acetonr ! és 5 liter etanollal mosunk és vákuumban 4* C-on megszárítunk. Fehér, szagtalan port kapun

Az a-c. előírások szerint kapott protopla iokat szokásos lemeztenyésztéses eljárással Petri-C' érzékben vékony rétegben beviszünk a gélesedő és tisztított táptalajokba. Az agart illetve agarózt - uyéb megjegyzés híján - 0,4% [w/v] koncentrál ‘bán használjuk. 6 cm átmérőjű Petri-csészékben mindig 3 ml táptalajt és 9 cm átmérőjű csészékben 10 ml táptalajt alkalmazunk.

Azokban a próbákban, ahol agar- vagy agarózszegmenseket használunk, a protoplasztokat a tápközeg szegmentálása előtt a tápközegben egyenletesen eloszlatjuk. Végül a szegmenseket 30 ml tápoldatban 10 cm átmérőjű tartályokba tesszük és forgó-rázógépen 26 °C-on sötétben vagy világosban inkubáljuk és a folyékony tápközeget szabályos időközönként vagy folyamatosan cseréljük.

A módszer használhatóságának illetve a protoplasztokból nyert sejttelepképződés előnyös befolyásolásának értékelését mikroszkóp alatt végezzük el 4-6 hetes inkubálási idő után. A mikroszkópos értékelésnél megfelelő mennyiségű látótérben leszámoljuk és megítéljük a képződött sejtformációkat. A szegmentációs kísérletekben a csészéket a bennük levő tápoldatban úszó szegmensekkel 14 napos időközönként lefényképezzük és kiértékeljük a szegmensekben látható sejtformációk számát és nagyságát.

-4189407 .

$) Kísérleti eredmények

1. példa:

a Hyoscyamus muticus fajta, VIIIB9 vonal (trp“) 10’ sejtjének vagy 10⁵ protoplasztjának 10 ml szilárdított A) táptalajban való lemezöntése után képződött sejttelepek száma

Szilárdított B) táptalaj	Sejtek	Protoplasztok
0,4% agar	20	0
0,4% agaróz	nem vizsgáltuk	1102
0,8% agaróz	1024	472
Gélesítőszer
nélkül	1000	120

Az 1. példa eredményei azt mutatják, hogy az agaróz úgy a sejtek, mint a protoplasztokból származó sejtek tenyésztésénél alkalmasabb az agamái, és hogy az agar a használt protopasztokra és sejtekre mérgezőleg hat. Sűrűség/ml alatt itt és az alábbiakban a tenyésztőközeg 1 ml-ében levő protoplaszt- vagy sejtszám értendő.

2. példa:

Dohány (VR2) protoplasztok lemeztenyésztésének hatékonysága növekvő hígításnál, B) tápközegben

Sűrűség/ml: szilárdított B) táptalaj	6000	3000	1000	300
Agaróz	formáció*	4,3	2,2	0,22
Agár	formáció*	1,9	0	0
Gélesítőszer nélkül	formáció*	1,3	0	0

* = Sejtformáció, melynek sűrűsége nem teszi lehetővé a sejtszámolást

Amint az alábbi 4. példa Hyoscyamus muticus (VIII B9 trp~) protoplasztfajta esetében világosan mutatja, az agar mérgező hatása legalább részben a tápközegben végbemenő diffúziós folyamatokra vezethető vissza, minthogy úgy az agar, mint a tisztított agar a rárétegzett agarózban gátolja a sejtfejlődést.

4. példa:

Sejttelepek száma, melyek a Hyoscyamus muticus (VIII B9 trp^-) fajta protoplasztjainak agarózzal vagy tisztított agarral vagy agarral alárétegzett, agarózzal gélesített vagy nem gélesített A) táptalaj (össztérfogat 3 ml) vékony rétegében való lemeztenyésztése után képződtek

Protoplaszt- szám/ml	50 000	10000
felső réteg:	azonos	agaróz	azonos	agaróz
Szilárdított A) táptalaj Agaróz	215	221	66	68
Tisztított agar	0	0	1	2
Agar	0	0	0	0
Gélesítőszer nélkül	48*		3,3*
* folyékony kontrollok

A következő 5. példa különböző agarózfajták elvi alkalmasságát mutatja Hyoscyamus muticus és dohány (VR2) fajták protoplasztjainák tenyésztésére, ami úgy magas, mint alacsony protoplasztkonccntrációnál megmutatkozik. A tisztított agar és az agar a ranglista végén áll, míg a Sea Plaque, a BRL-LMT-agarózok hasonló jellegzetességeket mutatnak és minden más vizsgált agarózfajtát jelentősen felülmúlnak. Ezzel szemben a tisztított agar és az agar minden kísérletben lényegesen roszszabb eredményt ad az agarózoknál, és általában inkább fejlődésgátló hatást gyakorol a protoplasztokra,

5. példa:

A vizsgált agar- és agarózfajták kvalitatív használhatóságának rangsora a Hyoscyamus muticus és dohány (VR2) fajták protoplasztjaiból származó sejtkultúrák tenyésztésénél

Rang- sor	Agaróz-típus	Előállító
1	' ( Sea Plaque LMT	Marine Colloids
	\(IMP	Bethesda Research Laboratories (BRL)
3	VII típus	Sigma	> alkal-
			más
4	HGT	Sigma
6	HGTP, HGT, LE	Marine Colloids
8	Standard LMT	BioRad
9	Sea-Prep (0,8%)*	J
10 11	Tisztított agar Bacto-Agar	az alkalmazáshoz Difco alkalmatlan, mivel gyakran mérgező

* Minden próbát 0,8% és 0,4% [w/v] koncentrációnál hajtunk végre, mivel ezeknél a koncentrációknál már gél képződik. ' A „Sea-Prep” csak 0,8% [w/v] felett gélesedik.

A megszilárdult, protoplasztokkal beoltott táptalaj szegmentálásának a sejttenyészetek képződésére kifejtett hatását petúnia-protoplasztok, éspedig a „Mitchell” haploid segítségével vizsgáljuk. A szegmensek alapjául szolgáló táptalajokhoz gélesítő szerként agart, tisztított agart és agarózt alkalmazunk. Ugyanakkor összehasonlítjuk a szegmensekben levő sejtformációk mosását a Petri-csészékben hagyományos lemeztechnikával készített lemezekével. Amint a következő 6. példa kísérleti eredményei mutatják, a protoplasztokból képződött

-5.- 189 407 sejttelepek száma a szegmensekben mindig na- i gyobb, mint az átöblítő oldattal nem kezelt hagyományos lemezekben. Az összes vizsgált tápközeg közül az agarózt tartalmazó szegmensekben következik be a sejtformációk legerőteljesebb nőve- ’ kedése.

6. példa:

Sejtformációk képződésének összehasonlító vizsgálata a hagyományos lemeztechnikával készült gélesített tápközegekben és a tápoldatba átvitt szegmentált formában. ,

A Petúnia hybrida „Mitchell” haploid sejttelepei- '⁵ nek %-os megoszlása; a telepek a megszilárdított tápközegben 2 hét múlva képződnek a protoplasztokból; a tápközeget vagy szegmensekre osztjuk fel és a tápoldatban* rázás közben tartjuk el, vagy felaprítás nélkül a Petri-csészékben hagyjuk. ²⁰ * C) tápoldat

Sűrűség/ ml:

4x 10*

2x10*

Módszer:	lemez	szeg- mens	lemez	szeg- mens	lemez	szeg- mens
Agaróz , Tisztított	14,8	22,8	26,0	31,2	27,2	52,4
agar	3,2	14,2	6,2	8,4	7,4 ;	10,6
Agár	2,6	5,4	2,2	3,2	0,12 i	0,81

A kísérlet egyértelműen bizonyítja, hogy a szegmentált agaróznak folyékony tápközegben való alkalmazása sokkal előnyösebb a tisztított agárnál vagy az agamái, úgy lemezformában, mint szeg- ₃₅ mentáit formában.

Hasonló eredményeket kapuak például a Crepis capillaris fajta protoplasztjaival, a Petúnia hybrida „Mutator Gens Potrykus” protoplasztjaival, a Brassica rapa fajta, a Lycopersicon esculentum faj- ₄₀ ta, valamint a Nicotiana tabacum fajta protoplasztjaival.

7. példa

Növények regenerálása a Nicotiana tabacum fajta protoplasztjaiból

A Nicotiana tabacum fajta körülbelül 5 x 10*/ml protoplasztját 1 % [w/v] agarózzal gélesített B) táp- ₅₀ talajban [K.3 táptalaj] diszpergáljuk és 10 napig lezárt Petri-csészékben a klímakamrában (fény: 3000 lux; hőmérséklet: 24 ’C; levegőnedvesség: körülbelül 100%) tenyésztjük. Utána ezt a gélesített táptalajt egyforma nagyságú szegmensekre (1 cm ₅₅ átmérő) osztjuk fel és a szegmenseket 0,25 mól szacharózt, 0,05 mg/1 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavat, mg/1 2-naftil-ecetsavat, 0,1 mg/1 6-benzil-amínopurint és 0,1 mg/1 kinetint tartalmazó módosított B) tápoldatba helyezzük és abban egyenletesen ráz- „ zuk. Egy hét múlva a B) tápoldatot megújítjuk, amikor is a szacharóztartalmat 0,2 mólra csökkentjük. A szegmens/tápoldat keveréket 4 hétig tovább rázatjuk és a tápoldatot minden héten megújítjuk. Végül a képződött sejttelepeket 0,2 mól szacharózt,

0,05 mg/1 2,4-diklór-fenoxi-ecetsavat, 2 mg/12-naftil-ecetsavat, 0,1 mg/1 6-benzil-amino-purint és 0,1 mg/1 kinetint tartalmazó, agarózzal megszilárdított D) tápközegre visszük fel. Ez a statikus tenyészet 4 héten belül kallusz-tenyészeteket képez, melyeket 0,2 mg/16-benzil-amino-purint tartalmazó, agarózzal megszilárdított D) táptalajra viszünk át, ahol egyedi sarjak képződnek. Az utóbbiakat agarózzal megszilárdított É) táptalajra visszük át és a gyökerek kialakulása után földbe ültetjük és érett növényekké neveljük fel.

Claims (17)

1. Szabadalmi igénypontok

   4. Eljárás proliferáló növényi sejtformációk létrehozására, azzal jellemezve, hogy

   a) izolált protoplasztokat vagy protoplasztokból regenerált izolált sejteket agarózzal gélesített tápközeg(b)en egyenletesen szétoszlatunk, és/vagy

   b) ezt az előkezelt és gélesített táptalajt szegmentáljuk, a szegmenseket tápoldatba visszük át és a tenyésztést mindkét esetben kívánt nagyságú sejtformációk képződéséig folytatjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a) izolált protoplasztokat vagy protoplasztokból regenerált izolált sejteket agarózzal gélesített tápközeg(b)en egyenletesen szétoszlatunk, vagy b) ezt az előkezelt és gélesített tápközeget szegmentáljuk, a szegmenseket növényi sejtszaporításra alkalmas 1-10 000-szeres térfogatú tápoldatba visszük át és a tenyésztést mindkét esetben 0° és 40 °C közötti hőmérsékleten kívánt nagyságú sejtformációk képződéséig folytatjuk.
3. 3. Az 1. vagy a 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy manipulált protoplasztokat vagy már ismét regenerált sejtfallal rendelkező manipulált protoplasztokat tenyésztünk.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a manipulációk esetében gén-, sejtelemátültetést vagy sejtfúziót végzünk.
5. 5. Az í-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy inkubálási hőmérsékletként 12’ és 30’C közötti tartományt alkalmazunk.
6. 6. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a szegmenseket térfogatuk 5-10 000-szeresét kitevő, növényi sejtszaporításra alkalmas tápoldatba visszük be.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzaljellemezve, hogy a szegmenseket térfogatuk 20-100-szorosát kitevő, növényi sejtszaporításra alkalmas tápoldatba visszük be.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy az agarózzal megszilárdított primer tápközeg szegmentálását a protoplasztokkal való beoltása után 0-7 nap múlva hajtjuk végre.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a szegmentálást a beoltást követő 3-4. napon hajtjuk végre.

   -689 407 «
10. 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szabályos térbeli kiterjedésű, körülbelül 1-100 mm közepes átmérőjű, azonos nagyságú szegmenseket állítunk elő.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 2-60 mm közepes átmérőjű szegmenseket készítünk.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szegmensekként hasábokat, gömböket, kockákat, prizmákat, oszlopokat vágy kúpokat állítunk elő, melyeknek közepes átmérője 2-10 mm.
13. 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy Nicotiana tabacum, Hyoscyamus muticus, Lycopersicon esculentum, Crepis capillaris, Brassica rapa vagy Petúnia hybrida növényfajtákból izolált protoplasztokat használunk.
14. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy Sea Plaque LMT, LMP, Type VII, HGT, HGPT, LE Standard LMT vagy Sea-Prep típusú agarózokat alkalmazunk.
15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a protoplasztokkal vagy regenerált sejtfallal rendelkező protoplasztokkal beoltott és agarózzal megszilárdított szegmenseket nagytechnikai szinten bioreaktorokba visszük át.
16. 16. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a sejtszaporítást élet- és szaporodásképes növények képződéséig folytatjuk.
17. 17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szaporító illetve tenyésztőközegként protoplasztokból vagy már regenerált sejtfalú protoplasztokból származó növényi sejttelepekhez agaróz táptalajt használunk.