DE69737996T2

DE69737996T2 - Methoden zur herstellung von nukleotidintegrasen

Info

Publication number: DE69737996T2
Application number: DE69737996T
Authority: DE
Inventors: Alan Marc Columbus LAMBOWITZ; Georg Columbus MOHR; Roland Columbus SALDANHA; Manabu Columbus MATSUURA
Original assignee: Ohio State University Research Foundation
Current assignee: Ohio State University Research Foundation
Priority date: 1996-11-19
Filing date: 1997-11-18
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2017-11-19
Also published as: EP0941338A1; DE69737996D1; EP0941338A4; ATE369430T1; US5804418A; CA2271785A1; AU5587198A; CA2271785C; WO1998023756A1; EP0941338B1; US6001608A

Description

HINTERGRUND
Nucleotid-Integrasen sind Molekülkomplexe, die in der Lage sind, doppelsträngige DNA-Substrate an spezifischen Erkennungsstellen zu spalten und Nucleinsäuremoleküle gleichzeitig in das DNA-Substrat an der Spaltungsstelle einzuführen. Daher sind Nucleotid-Integrasen nützliche Werkzeuge, insbesondere für Genomkartierung und Gentechnik.
Strukturell sind Nucleotid-Integrasen Ribonucleoprotein-(RNP-)Partikel, die eine exzidierte Gruppe-II-Intron-RNA und ein von einem Gruppe-II-Intron kodiertes Protein umfassen, das an die Gruppe-II-Intron-RNA gebunden ist. Derzeit werden Nucleotid-Integrasen mithilfe zweier Ansätze hergestellt. Der erste Ansatz umfasst das Isolieren der Nucleotid-Integrase von Quellenorganismen; sowohl die RNA- als auch Proteinuntereinheiten der Nucleotid-Integrase werden durch die DNA in solchen Organismen kodiert. Um Nucleotid-Integrasen zu erhalten, die nicht vom Wildtyp sind, werden Quellenorganismen mutagenisiert. Die Mutagenese ist ein aufwendiges Verfahren in mehreren Schritten, das beschränkte Mengen von Nucleotid-Integrase erbringt.
Der zweite Ansatz, der zur Herstellung von Nucleotid-Integrasen verwendet wird, umfasst die In-vitro-Kombination einer exogenen exzidierten Gruppe-II-Intron-RNA mit einem RNA-Proteinkomplex, in welchem das von einem Gruppe-II-Intron kodierte Protein mit einer spleißdefekten Gruppe-II-Intron-RNA anstelle der exzidierten Gruppe-II-Intron-RNA assoziiert ist. Deshalb fehlt dem RNA-Proteinkomplex Nucleotid-Integrase-Aktivität. Die exogene RNA ersetzt die spleißdefekte Gruppe-II-Intron-RNA, um eine Nucleotid-Integrase zu bilden. Der RNA-Protein-Komplex wird durch Isolation des RNA-Protein-Komplexes aus Quellenorganismen gewonnen. Um den RNA-Protein-Komplex oder ein von einem Gruppe-II-Intron kodiertes Protein, das kein Wildtyp ist, zu erhalten, muss der Quellenorganismus mutagenisiert werden. Die Mutagenese ist ein aufwendiges Verfahren in mehreren Schritten, das begrenzte Mengen des RNA-Protein-Komplexes erbringt. Daher stellt dieses Verfahren auch begrenzte Mengen der Nucleotid-Integrase bereit.
Dementsprechend ist es wünschenswert, über Verfahren zur Herstellung von Nucleotid-Integrase zu verfügen, die nicht aufwendig sind und der Nucleotid-Integrase ermöglichen, einfach vom Wildtyp modifiziert zu werden, und die keine begrenzte Mengen der Nucleotid-Integrase erbringen.
Zimmerly et al., Cell 83, 529-538 (1995), beschäftigen sich mit Gruppe-II-Intron-RNA und schlagen vor, dass diese eine katalytische Komponente einer DNA-Endonuclease ist, die in Intronmobilität involviert ist. Die Autoren schlagen vor, dass die ortsspezifische DNA-Endonuclease, welche den Doppelstrangbruch ausführt, ein Ribonucleoproteinkomplex ist, der das von a12 kodierte Umkehrtranskriptaseprotein und eine exzidierte a12-RNA enthält, wobei die a12-RNA Spaltung des Sense-Strangs der Empfänger-DNA katalysiert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue, verbesserte und einfach zu manipulierende Verfahren zur Herstellung von Nucleotid-Integrasen bereit.
In einer Ausführungsform wird die Nucleotid-Integrase durch Einführung eines DNA-Moleküls, das eine Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz umfasst, in eine Wirtszelle hergestellt. Die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz wird dann in der Wirtszelle exprimiert, sodass RNP-Partikel, die über Nucleotid-Integrase-Aktivität verfügen, in der Zelle gebildet werden. Solche RNP-Partikel umfassen ein exzidiertes eingeführtes DNA-Molekül und ein von Gruppe-II-Intron kodiertes Protein, für welches das eingeführte DNA-Molekül kodiert. Danach wird die Nucleotid-Integrase aus der Zelle isoliert.
In einer anderen Ausführungsform wird die Nucleotid-Integrase durch In-vitro-Kombination einer exzidierten Gruppe-II-Intron-RNA, die hierin nachstehend als „exogene RNA" bezeichnet wird, mit einem von Gruppe-II-Intron kodierten Protein hergestellt. Vorzugsweise wird die exogene RNA durch In-vitro-Transkription eines DNA-Moleküls hergestellt, das die Gruppe-II-Intronsequenz umfasst. Vorzugsweise wird das von Gruppe-II-Intron kodierte Protein durch Einführung eines DNA-Moleküls, das die offene Leserastersequenz eines Gruppe-II-Introns umfasst, in die Wirtszelle und dann durch Expression der offenen Leserastersequenz in der Wirtszelle, sodass das von Gruppe-II-Intron kodierte Protein, für welches die offene Leserastersequenz kodiert, in der Zelle gebildet wird, hergestellt. Danach wird die Zelle aufgetrennt und das Protein gewonnen.
In einer anderen Ausführungsform wird die Nucleotid-Integrase durch In-vitro-Kombination einer exzidierten Gruppe-II-Intron-RNA, die hierin nachstehend als „exogene RNA" bezeichnet wird, mit einem RNA-Protein-Komplex, der in ein von einem Gruppe-II-Intron kodiertes Protein umfasst, hergestellt. Vorzugsweise wird die exogene RNA durch In-vitro-Transkription eines DNA-Moleküls hergestellt, das die Gruppe-II-Intronsequenz umfasst. Vorzugsweise wird der RNA-Proteinkomplex durch Einführung eines DNA-Moleküls, das eine Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz umfasst, die für eine spleißdefekte Gruppe-II-Intron-RNA kodiert, in eine Wirtszelle erreicht. Danach wird die Zelle aufgetrennt und der RNA-Protein-Komplex isoliert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Nucleotid-Integrase und ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von RNA-Protein-Komplexen zur Verwendung in der In-vitro-Herstellung von Nucleotid-integrasen.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Plasmidkarte von Plasmid pETLtrA19.
2 zeigt die Nucleotidsequenz des 2,8-kb-HindIII-Fragments, das in pETLtrA19 vorhanden ist und das die L1.Hrb-Intron-DNA-Sequenz und Abschnitte der Nucleotidsequenz der flankierenden Exons ItrIBE1 und ItrBE2, Seq.-ID Nr. 1, die Nucleotidsequenz des offenen ItrA-Leserasters, Seq.-ID Nr. 2, und die Aminosäure-Sequenz des 1trA-Proteins, Seq.-ID-Nr. 3, umfasst.
3 ist die Plasmidkarte von Plasmid pETLtrA1-1.
4 ist eine schematische Darstellung der Inserts in pLE12, pETLtrA19 und pETLtrA1-1.
5 ist die Sequenz des Sense-Strangs des doppelsträngigen DNA-Substrats, Seq.-ID Nr. 4, das verwendet wurde, um die Nucleotid-Integrase-Aktivität der Nucleotid-Integrase zu beurteilen, die eine exzidierte L1.ItrB-Intron-RNA und ein Itra-Protein umfasst.
6A ist eine schematische Darstellung des Substrats, das durch Nucleotid-Integrase, die L1-ItrB-Intron-RNA und das Itra-Protein umfasst, gespalten wird, und 6B zeigt die IBS1- und IBS2-Sequenzen des Substrats und die Spaltstellen des doppelsträngigen DNA-Substrats, das durch diese Integrase gespalten wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Nucleotid-Integrasen
Nucleotid-Integrasen sind Enzyme, die in der Lage sind, doppelsträngige DNA-Substrate an spezifischen Erkennungsstellen zu spalten und Nucleinsäuremoleküle gleichzeitig in das DNA-Substrat an der Spaltungsstelle einzuführen. Die Nucleotid-Integrasen führen ein RNA-Molekül in den Sense-Strang des gespaltenen DNA-Substrats und ein cDNA-Molekül in den Antisense-Strang des gespaltenen DNA-Substrats ein.
Nucleotid-Integrasen sind Ribonucleoprotein-(RNP-)Partikel, die eine exzidierte Gruppe-II-Intron-RNA und ein von einem Gruppe-II-Intron kodiertes Protein umfassen, das an die Gruppe-II-Intron-RNA gebunden ist. „Exzidierte Gruppe-II-Intron-RNA" wie hierin verwendet bezeichnet die RNA, die ein In-vitro- oder In-vivo-Transkript der Gruppe-II-Intron-DNA ist oder davon abgeleitet ist und der flankierende Exonsequenzen fehlen. Die exzidierte Gruppe-II-Intron-RNA weist typischerweise sechs Domänen und eine charakteristische sekundäre und tertiäre Struktur auf, die in Saldahana et al., Federation of the American Society of Experimental Biology Journal, 15-24 (1993), gezeigt ist. Die exzidierte Gruppe-II-Intron-RNA umfasst auch zumindest eine hybridisierende Region, die zu einer Erkennungsstelle auf der Substrat-DNA komplementär ist. Die hybridisierende Region weist eine Nucleotidsequenz auf, die hierin nachstehend als „EBS-Sequenz" bezeichnet wird, die zur Sequenz der Erkennungsstelle der beobachteten Substrat-DNA komplementär ist, die hierin nachstehend „IBS-Sequenz" genannt wird. Das von Gruppe-II-Intron kodierte Protein weist eine X-Domäne, eine Umkehrtranskriptasedomäne und vorzugsweise eine Zn-Domäne auf. Die X-Domäne des Proteins weist eine Maturase-Aktivität auf. Die Zn-Domäne des Proteins weist Zn² ⁺-fingerähnliche Motive auf.
Gruppe-II-Intron-RNA kann produziert werden, die gewünschte EBS-Sequenzen enthält, die an die entsprechenden Nucleotide auf Substrat-DNA hybridisieren. Zusätzlich dazu kann Gruppe-II-Intron-RNA produziert werden, die zusätzliche Nucleotide in Domäne IV enthält. In den Verfahren der vorliegenden Erfindung werden beide dieser Gruppe-II-RNA-Moleküle aus einer isolierten DNA produziert, die dann in eine Zelle eingeführt wird. Eine solche isolierte DNA wird typischerweise unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts synthetisiert oder gentechnisch hergestellt, wie z.B. durch ortsgerichtete In-vitro-Mutagenese.
A. Herstellung der Nucleotid-Integrase durch Isolation aus einer gentechnisch hergestellten Zelle
In einer Ausführungsform wird eine Nucleotid-Integrase durch Einführung eines isolierten DNA-Moleküls, das eine Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz umfasst, in eine Wirtszelle hergestellt. Geeignete DNA-Moleküle umfassen z.B. Virusvektoren, Plasmide und lineare DNA-Moleküle. Nach Einführung des DNA-Moleküls in die Wirtszelle wird die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz in der Wirtszelle exprimiert, sodass exzidierte RNA-Moleküle, für welche die eingeführte Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz kodiert, und Proteinmoleküle, für welche die eingeführte Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz kodiert, in der Zelle gebildet werden. Die exzidierte Gruppe-II-Intron-RNA und ein von Gruppe-II-intron kodiertes Protein werden innerhalb der Wirtszelle kombiniert, um die Nucleotid-Integrase zu produzieren.
Vorzugsweise umfasst das eingeführte DNA-Molekül auch einen Promotor, noch bevorzugter einen induzierbaren Promotor, operabel gebunden an die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz. Vorzugsweise umfasst das DNA-Molekül weiters eine Sequenz, die für eine Markierung kodiert, um Isolation der Nucleotid-Integrase zu erleichtern, wie z.B. eine Affinitätsmarkierung und/oder eine Epitopmarkierung. Vorzugsweise befinden sich die Markierungssequenzen am 5'- oder 3'-Ende der Sequenz des offenen Leserasters. Geeignete Markierungssequenzen umfassen z.B. Sequenzen, die für eine Reihe von Histidinresten kodieren, das Herpes-simplex-Glykoprotein D, d.h. das HSV-Antigen, oder Glutathion-S-Transferase. Typischerweise umfasst das DNA-Molekül auch Nucleotidsequenzen, die für einen Replikationsstartpunkt und einen selektierbaren Marker kodieren. Gegebenenfalls umfasst das DNA-Molekül Sequenzen, die für Moleküle kodieren, die Expression modulieren, wie z.B. das T7-Lysozym.
Das DNA-Molekül, das die Gruppe-II-Intronsequenz umfasst, wird durch herkömmliche Verfahren in die Wirtszelle eingeführt, wie z.B. durch Klonierung des DNA-Moleküls in einen Vektor und durch Einführung des Vektors in die Wirtszelle durch herkömmliche Verfahren, wie z.B. Elektroporation oder durch CaCl₂-vermittelte Transformationsverfahren. Das Verfahren, das verwendet wird, um das DNA-Molekül einzuführen, hängt mit der bestimmten verwendeten Wirtszelle zusammen. Geeignete Wirtszellen sind jene, die in der Lage sind, die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz zu exprimieren. Geeignete Wirtszellen umfassen z.B. heterologe oder homologe Bakterienzellen, Hefezellen, Säugetierzellen und Pflanzenzellen. In diesen Fällen, wo das Wirtszellgenom und die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz verschiedene genetische Codes verwenden, ist es bevorzugt, dass die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz modifiziert wird, um Codons zu umfassen, die dem genetischen Code der Wirtszelle entsprechen. Die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz wird typischerweise durch Verwendung eines DNA-Synthesegeräts oder durch ortsgerichtete In-vitro-Mutagenese modifiziert, um eine Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz mit verschiedenen Codons herzustellen. Alternativ dazu werden zur Auflösung der Unterschiede im genetischen Code des Introns und der Wirtszelle DNA-Sequenzen in die Wirtszelle eingeführt, die für die tRNA-Moleküle kodieren, die dem genetischen Code des Gruppe-II-Introns entsprechen. Gegebenenfalls werden auch DNA-Moleküle, die Sequenzen umfassen, die für Faktoren kodieren, die zur RNA- oder Proteinfaltung beitragen, oder den RNA- oder Proteinabbau hemmen, ebenfalls in die Zelle eingeführt.
Die DNA-Sequenzen der eingeführten DNA-Moleküle werden dann in der Wirtszelle exprimiert, um eine transformierte Wirtszelle bereitzustellen. Wie hierin verwendet steht der Begriff „transformierte Zelle" für eine Wirtszelle, die gentechnisch hergestellt wurde, um zusätzliche DNA zu enthalten, und ist nicht auf Zellen beschränkt, die kanzerös sind. Dann werden die RNP-Partikel mit Nucleotid-Integrase-Aktivität aus den transformierten Wirtszellen isoliert.
Vorzugsweise wird die Nucleotid-Integrase durch Lyse der transformierten Zellen isoliert, wie z.B. durch mechanische und/oder enzymatische Zerstörung der Zellmembranen der transformierten Zelle. Dann wird das Zelllysat in einen unlöslichen und löslichen Anteil aufgetrennt. Vorzugsweise wird eine RNP-Partikel-Formulierung aus dem löslichen Anteil isoliert. RNP-Partikelherstellung umfasst die RNP-Partikel mit Nucleotid-Integrase-Aktivität sowie Ribosomen, mRNA- und tRNA-Moleküle. Geeignete Verfahren zur Isolation von RNP-Partikel-Formulierungen umfassen z.B. Zentrifugation der löslichen Anteile durch einen Saccharosepolster. Die RNP-Partikel werden vorzugsweise weiters aus der RNP-Partikelformulierung oder aus den löslichen Anteilen durch z.B. Trennung auf einem Saccharosegradienten oder einer Gelfiltrationssäule oder durch andere Formen von Chromatographie gereinigt. Zum Beispiel kann das RNP-Partikel in jenen Fällen, wo die Proteinkomponente des gewünschten RNP-Partikels gentechnisch verändert worden ist, um eine Markierung, wie z.B. eine Reihe von Histidinresten, zu umfassen, weiter aus der RNP-Partikelformulierung durch Affinitätschromatographie auf einer Matrix, welche die Markierung erkennt und bindet, gereinigt werden. Zum Beispiel ist NiNTA-SuperFlow von Qiagen, Chatsworth, CA, für Isolation von RNP-Partikel geeignet, in welchen das von einem Gruppe-II-Intron kodierte Protein eine His₆-Markierung aufweist.
B. Herstellung der Nucleotid-Integrase durch Kombination exogener RNA mit einem von einem Gruppe-II-Intron kodierten Protein, um ein rekonstituiertes RNP-Partikel zu bilden
In einer anderen Ausführungsform wird die Nucleotid-Integrase durch Kombination einer isolierten exogenen RNA mit einem isolierten, von einem Gruppe-II-Intron kodierten Protein in vitro gebildet, um ein rekonstituiertes RNP-Partikel bereitzustellen. Vorzugsweise wird die exogene RNA durch In-vitro-Transkription der Gruppe-II-Intron-DNA hergestellt. Alternativ dazu wird die exogene RNA durch In-vitro-Transkription der Gruppe-II-Intron-DNA und der DNA aller oder Teile der flankierenden Exons hergestellt, um ein unverarbeitetes Transkript zu produzieren, das die Gruppe-II-Intron-RNA enthält und die RNA, für welche die flankierenden Exons oder Teile davon kodieren. Dann wird die exogene RNA aus dem unverarbeiteten Transkript gespleißt.
Das gereinigte, von einem Gruppe-II-Intron kodierte Protein wird durch Einführung eines isolierten DNA-Moleküls in eine Wirtszelle hergestellt. Dieses eingeführte DNA-Molekül umfasst die DNA-Sequenz der offenen Leseraster-(ORF-)Sequenz des Gruppe-II-Introns, operabel an einen Promotor gebunden, vorzugsweise einen induzierbaren Promotor. Alternativ dazu umfasst 3S, das eingeführte DNA-Molekül, (1) die ORF-Sequenz und (2) zumindest einen Abschnitt der DNA-Sequenz des Gruppe-II-Introns, das außerhalb der ORF-Sequenz liegt, und (3) einen Promotor, der im DNA-Molekül ausgerichtet ist, um die Expression der ORF-Sequenz zu steuern. Vorzugsweise umfasst das eingeführte DNA-Molekül auch eine Sequenz am 5'- oder 3'-Ende des Gruppe-II-Intron-ORFs, das, wenn es in der Wirtszelte exprimiert wird, eine Affinitätsmarkierung oder ein Epitop am N-Terminus oder C-Terminus des von einem Gruppe-II-Intron kodierten Proteins umfasst. Markierung des Proteins auf diese Weise erleichtert die Isolation des exprimierten Proteins. Daher kann das DNA-Molekül am 5'- oder 3'-Ende des ORF z.B. eine Sequenz umfassen, die für eine Reihe von Histidinresten oder das HSV-Antigen oder Glutathion-S-Transferase kodiert. Diese DNA-Moleküle können am 5'- oder 3'-Ende des ORF eine Sequenz umfassen, die für Thioredoxin oder ein beliebiges anderes Molekül kodiert, das die Verteilung des Pro teins, für welches der ORF kodiert, in den löslichen Anteil der Wirtszelle verstärkt. Typischerweise umfasst das DNA-Molekül auch Nucleotidsequenzen, die für einen Replikationsstartpunkt und einen selektierbaren Marker kodieren.
Zur Einführung dieser DNA-Moleküle in eine beliebige Wirtszelle, die in der Lage ist, die Gruppe-II-Intron-ORF-Sequenz zu exprimieren, werden herkömmliche Verfahren verwendet. Zum Beispiel kann das CaCl₂-vermittelte Transformationsverfahren, wie von Sambrook et al. in „Molecular Cloning: A Laborstory Manual", 1-82 (1989), beschrieben wurde, zur Einführung der DNA-Moleküle in E.-coli-Zellen verwendet werden. Geeignete Wirtszellen umfassen z.B. heterologe oder homologe Bakterienzellen, Hefezellen, Säugetierzellen und Pflanzenzellen. In diesen Fällen, wo den Wirtszellen entweder tRNA-Moleküle für eine oder mehrere der Codons fehlen oder die über beschränkte Mengen dieser verfügen, die im ORF vorhanden sind, ist es bevorzugt, dass ein DNA-Molekül, das für die seltenen tRNA-Moleküle kodiert, auch in die Wirtszelle eingeführt wird, um die Ausbeute des Proteins zu erhöhen. Alternativ dazu wird die DNA-Sequenz des ORF modifiziert, um die bevorzugte Codon-Verwendung der Wirtszelle zu erreichen.
Die ORF-Sequenz wird dann im Wirt exprimiert, vorzugsweise durch Hinzufügung eines Moleküls, das Expression induziert, um eine transformierte Wirtszelle bereitzustellen. Dann wird die transformierte Zelle lysiert und vorzugsweise in einen löslichen und unlöslichen Anteil aufgetrennt. Dann wird das von einem Gruppe-II-Intron kodierte Protein isoliert, vorzugsweise aus dem löslichen Anteil. Verfahren zur Isolation des Proteins aus dem löslichen Anteil umfassen z.B. chromatographische Verfahren, wie z.B. Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie, die besonders zur Isolation von markierten Proteinmolekülen nützlich ist.
Nach Reinigung des von einem Gruppe-II-Intron kodierten Proteins wird das Protein mit der exogenen RNA inkubiert, vorzugsweise in einem Puffer, um Bildung der Nucleotid-Integrase zu ermöglichen. Gegebenenfalls werden das Protein und RNA vor Inkubation unter Verwendung von Guanidiniumhydrochlorid oder Harnstoff denatu riert. Dann wird während Inkubation das Denaturierte in Gegenwart von Co-Lösungsmitteln, wie Salzen und Metallionen, entfernt, um richtige Faltung des Proteins und der RNA in der Nucleotid-Integrase zu ermöglichen.
C. Herstellung der Nucleotid-Integrase durch Kombination exogener RNA mit einem RNA-Protein-Komplex
Alternativ dazu wird die Nucleotid-Integrase durch Kombination der exogenen RNA mit einem RNA-Protein-Komplex hergestellt, der aus einem Organismus isoliert worden ist, der gentechnisch hergestellt worden ist, um einen RNA-Protein-Komplex herzustellen, in welchem die gewünschten, von einem Gruppe-II-Intron kodierten Proteinmoleküle mit RNA-Molekülen assoziiert sind, die spleißdefekte Gruppe-II-Intron-RNA enthalten, aber denen die exzidierte Gruppe-II-RNA fehlt. Vorzugsweise wird die exogene RNA durch In-vitro-Transkription eines DNA-Moleküls hergestellt, das die Gruppe-II-Intron-Sequenz umfasst.
Vorzugsweise wird der RNA-Protein-Komplex durch Einführung eines isolierten DNA-Moleküls, das eine Gruppe-II-Intron-Sequenz umfasst, die operabel an einen Promotor, vorzugsweise einen induzierbaren Promotor, gebunden ist, in eine Wirtszelle hergestellt. Die Gruppe-II-Intronsequenz kodiert für eine spleißdefekte Gruppe-II-Intron-RNA. Typischerweise umfasst das DNA-Molekül auch Nucleotidsequenzen, die für einen Replikationsstartpunkt und einen selektierbaren Marker kodieren. Dann wird die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz in der Wirtszelle exprimiert. Das Gruppe-II-Intron kodiert für ein funktionales, von einem Gruppe-II-Intron kodiertes Protein und eine spleißdefekte Gruppe-II-Intron-RNA. Daher fehlen dem RNA-Protein-Komplex, der auf diese Weise hergestellt wird, exzidierte Gruppe-II-RNA-Moleküle, die für das von Gruppe-II-Intron kodierte Protein kodieren. Die RNA-Protein-Komplexe enthalten jedoch das funktionale, von Gruppe-II-Intron kodierte Protein, das mit RNA-Molekülen assoziiert ist, welche die mutierte ungespleißte Form der Gruppe-II-Intron-RNA sowie andere RNA-Moleküle umfassen.
Der resultierende RNA-Protein-Komplex wird aus der Wirtszelle isoliert und dann mit der exogenen RNA inkubiert, vorzugsweise in einem Puffer, um die Nucleotid-Integrase zu bilden. Während der Inkubation wird das von Gruppe-II-Intron kodierte Protein von den RNA-Molekülen getrennt, die im RNA-Protein-Komplex vorliegen, und mit der exogenen RNA kombiniert, um die Nucleotid-Integrase zu bilden.
Diese Verfahren ermöglichen Produktion von erhöhten Mengen von Nucleotid-Integrasen. Herkömmliche Verfahren produzieren etwa 0,1 bis 1 μg von Nucleotid-Integrase pro Liter kultivierter Zellen. in der vorliegenden Erfindung werden zumindest 3 bis 10 mg Nucleotid-Integrase pro Liter kultivierter Zellen produziert. Diese Verfahren bieten auch den weiteren Vorteil, den Sequenzen der RNA-Komponente und der Proteinkomponente der Nucleotid-Integrase zu ermöglichen, einfach modifiziert zu werden.
Die folgenden Beispiele für Verfahren zur Herstellung eines von Gruppe-II-Intron kodierten Proteins und zur Herstellung von Nucleotid-Integrasen sind für Zwecke der Veranschaulichung enthalten und sollen den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränken.
In-vivo-Herstellung von Nucleotid-Integrasen
Beispiel 1
Eine Nucleotid-Integrase, die eine exzidierte RNA umfasst, für welche das L1.ItrB-Intron eines konjugativen Laktokokken-Elements prSO1 von Lactococcus lactis kodiert, und das Protein, für welches der ORF des L1-ItrB-Introns kodiert, wurden durch Transformation von Zellen des BLR(DE3)-Stamms des Bakteriums Escherichia coli, das den recA-Genotyp aufwies, mit dem Plasmid pETLtrA19 hergestellt. Plasmid pETLtrA19, das in 1 schematisch dargestellt ist, umfasst die DNA-Sequenz für das Gruppe-II-Intron L1.ItrB von Lactococus lactis, das als dicke Linie dargestellt ist, positioniert zwischen den Abschnitten der flankierenden Exons ItrBE1 und ItrBE2, die als nicht-ausgefüllte Kästchen dargestellt sind. pETLtrA19 umfasst auch die DNA- Sequenz für den T7-RNA-Palymerasepromotor und den T7-Transkriptionsterminator. Die Sequenzen werden im Plasmid auf eine Art ausgerichtet, sodass die ORF-Sequenz, Seq.-ID Nr. 2, innerhalb des L1.Itrb-Introns unter die Kontrolle des T7-RNA-Polymerase-Promotors fällt. Der ORF des L1-ItrB-Introns, das als Pfeilkästchen dargestellt ist, kodiert für das Protein Itra. Die Sequenz des L1-ItrB-Introns und der flankierenden Exonsequenzen, die in pETLtrA19 vorliegen, sind in 2 und Seq.-ID Nr. 1 dargestellt. Vertikale Linien in 2 zeigen die Verbindungen zwischen dem Intron und den flankierenden Sequenzen. Die Aminosäuresequenz des Itra-Proteins, Seq.-ID Nr. 4, ist unter der ORF-Sequenz, Seq.-ID Nr. 2, in 2 dargestellt. Sequenzen von und einschließlich Nucleotid 457 bis und einschließlich 463 (EBS1), von und einschließlich Nucleotid 401 bis und einschließlich Nucleotid 406 (EBS2a) und von und einschließlich Nucleotid 367 bis und einschließlich 367-372 (EBS2b) kodieren für die Exon-Bindungsstellen. Nucleotid 705 bis 2572 kodieren für Domäne IV.
pETLtrA19 wurde zum ersten Mal durch Verdau von pLE12, das von Dr. Gary Dunny von der Universität von Minnesota erhalten wurde, mit HindIII und Isolation des Restriktionsfragments auf einem 1 % Agarose-Gel hergestellt. Ein 2,8-kb-Hind-III-Fragment, welches das L1-ItrB-Intron gemeinsam mit Abschnitten der flankierenden Exons ItrBE1 und ItrBE2 enthält, wurde aus dem Agarose-Gel gewonnen, und die einzelsträngigen Überhänge wurden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt, die von Gibco BRL, Gaithersburg, MD, erhalten wurde. Das resultierende Fragment wurde in Plasmid-pET-11a ligiert, das mit Xbal verdaut und mit Klenow-Fragment behandelt worden war. pET-11a wurde von Novagen, Madison, WI, erhalten.
pETLtrA19 wurde unter Verwendung des herkömmlichen CaCl₂-vermittelten Transformationsverfahrens von Sambrook et al., wie in „Molecular Cloning A Laborstory Manual; 1-82 (1989), beschrieben, in die E.-coli-Zellen eingeführt. Einzelne transformierte Kolonien wurden auf Platten ausgewählt, die Luria-Bertani-(LB-)Medium enthielten, das mit Ampicillin ergänzt war, um das Plasmid auszuwählen, und mit Tetracyclin ergänzt war, um den BLR-Stamm auszuwählen. Eine oder mehrere Kolonien wurden in 2 ml LB-Medium inokuliert, das mit Ampicillin ergänzt war, und über Nacht bei 37 °C unter Schütteln gezüchtet. 1 ml dieser Kultur wurde in 100 ml LB-Medium inokuliert, das mit Ampicillin ergänzt war, und bei 37 °C unter Schütteln bei 200 U/min gezüchtet, bis OD₅₉₅ der Kultur 0,4 erreichte. Dann wurde Isopropylbeta-D-thiogalactose zur Kultur auf eine Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt, und die Inkubation wurde 3 Stunden lang fortgesetzt. Dann wurde die gesamte Kultur durch 5-minütige Zentrifugation bei 2.200 × g, 4 °C, geerntet. Das Bakterienpellet wurde mit 150 mM NaCl gewaschen und letztlich in 1/20 Volumen der ursprünglichen Kultur in 50 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT und 10 Vol.-% Glycerin (Puffer A) resuspendiert. Die Bakterien wurden bei -70 °C gefroren.
Zur Produktion eines Lysats wurden die Bakterien bei -70 °C dreimal aufgetaut und gefroren. Dann wurden 4 Volumina von 500 mM KCl, 50 mM CaCl₂, 25 mM Tris, pH 7,5 und 5 mM DTT (HKCTD) zum Lysat hinzugegeben und das Gemisch beschallt, bis es nicht mehr viskos war, d.h. 5 Sekunden oder länger. Das Lysat wurde in einen löslichen und einen unlöslichen Anteil durch 15-minütige Zentrifugation bei 14.000 × g, 4 °C, aufgetrennt. Dann wurden 5 ml des resultierenden Überstands, d.h. der lösliche Anteil, auf einen Saccharosepolster von 1,85 M Saccharose in HKCTD geladen und 17 Stunden lang bei 4 °C, 50.000 U/min in einem Ti-50-Rotor von Beckman zentrifugiert. Das Pellet, das die RNP-Partikel enthält, wurde mit 1 ml Wasser gewaschen und dann in 25 μl 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM DTT auf Eis gelöst. Unlösliches Material wurde durch 5-minütige Zentrifugation bei 1.500 × g, 4 °C, entfernt. Die Ausbeute von RNP-Partikel, die nach diesem Verfahren hergestellt werden, umfasst die exzidierte L1.ItrB-Intron-RNA und das Itra-Protein.
Beispiel 2
Eine Nucleotid-Integrase, die das Itra-Protein und die exzidierte L1.ItrB-Intron-RNA umfasste, wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass Plasmid pETLtrA19 zur Transformation von Zellen des BL21(D3)-Stamms von E. coli verwendet wurde.
Beispiel 3
Eine Nucleotid-Integrase wurde durch Transformation von Zellen der E.coli-Stämme BLR(DE3) mit pETLtrA19 wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass das transformierte E. coli in Super-Broth-(SOB-)Medium gezüchtet wurde und bei 3000 U/min während dreistündiger Inkubation geschüttelt wurde.
Beispiel 4
Eine Nucleotid-Integrase wurde durch Transformation von Zellen des E.coli-Stamms BL21(DE3) mit pETLtrA19 wie oben in Beispiel 2 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass die Zellen auch mit Plasmid pOM62 transformiert wurden, das auf Plasmid pACYC184 basiert und ein ungefähres 150-bp-Insert des ArgU(dnaY)-Gens an der EcoRI-Stelle aufweist. Das argU-Gen kodiert für die tRNA für die seltenen Arginin-Codons AGA und AGG. Das ItrA-Gen enthält 17 der seltenen Arginin-Codons. Die transformierten Zellen wurden in SOB-Medium wie in Beispiel 3 beschrieben gezüchtet und in einen löslichen Anteil und einen unlöslichen Anteil wie in Beispiel 1 beschrieben aufgetrennt.
Herstellung eines von einem Gruppe-II-Intron kodierten Proteins, das über eine Reinigungsmarkierung auf dem C-Terminus verfügt.
Beispiel 5
Zur Erleichterung der Reinigung des Proteins wurde der Itra-ORF am C-Terminus mit einer His₆-Affinitätsmarkierung und einem Epitop markiert, das von Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein D stammte. Das Plasmid, das die Markierungen hinzufügt, wurde unter Verwendung von PCR in zwei Schritten hergestellt. Im ersten Schritt wurde ein Fragment, das ein Exon 1 und den Itra-ORF enthielt, unter Verwendung von Primern LtrAex1.Xba mit der Sequenz 5' TCACCTCATCTAGACATTTTCTCC 3', Seq.-ID Nr. 5, die eine Xba-I-Stelle in Exon 1 von ItrB einführt, und ItrA expr3 5' CGTTCGTAAAGCTAGCCTTGTGTTTATG 3', Seq.-ID Nr. 6, die ein CGA-(Arginin-) Codon für das Stopcodon substituiert und eine Nhe-I-Stelle am 3'-Ende des Itra-ORF einführt, amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit Xbal und Nhe I geschnitten und die Restriktionsfragmente gelgereinigt und in pET-27b(+) kloniert, mit Xbal und Nhel, das von Novagen, Madison, WI, erhalten wurde, geschnitten. Das resultierende Plasmid pintermediate-C fusioniert das 3'-Ende des ItrA-ORF an eine HSV-Markierung und eine His₆-Reinigungsmarkierung, wovon beide auf dem Vektor pET-27b(+) vorhanden sind. In einem zweiten Schritt wurden Intron-Sequenzen 3' zum ORF und Exon 2 unter Verwendung von pLE12 als Substrat und dem 5'-Primer LtrAConZn1, der über die Sequenz 5' CACAAGTGATCATTTACGAACG 3', Seq.-ID Nr. 7, verfügte, und dem 3'-Primer LtrAex2 amplifiziert, der die Sequenz 5' TTGGGATCCTCATAAGCTTTGCCGC 3', Seq.-ID Nr. 8, aufwies. Das PCR-Produkt wurde mit BclI und BamHI geschnitten, das resultierende Fragment aufgefüllt, gelgereinigt und in pintermediate-C kloniert, das mit Bpu11O21 gespalten und aufgefüllt worden war. Das resultierende Plasmid wird pC-hisLtrA19 genannt.
Zellen des BLR(DE3)-Stamms von E. coli wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit pintermediate-C transformiert und bei 37 °C 3 Stunden lang in SOB-Medium wie in Beispiel 3 beschrieben kultiviert. Die Zellen wurden dann in einen löslichen Anteil, der RNP-Partikel, enthielt und einen unlöslichen Anteil aufgetrennt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
BEISPIEL 6
Um die Reinigung des Proteins zu erleichtern, wurde der Itra-ORF am N-Terminus mit einer His₆-Affinitätsmarkierung und der Epitopmarkierung XPRESS^TM, die von Invitrogen, San Diego, CA, erhalten wurde, markiert. Das Plasmid, das die Markierung hinzufügt, wurde in zwei Schritten unter Verwendung von PCR hergestellt. Im ersten Schritt wurde ein Fragment in zwei Schritten unter Verwendung von PCR-Mutagenese hergestellt. Im ersten Schritt wurden der ItrA-ORF und das 3'-Exon amplifiziert und BamHI-Stellen sowohl an das 5'- sowie das 3'-Ende des ItrA-ORF unter Verwendung von pLE12 als Substrat und dem folgenden Paar angehängt: 5'-Primer N-LtrA-5' mit der Sequenz 5'-CAAAGGATCCGATGAAACCAACAATGGCAA 3', Seq.-ID Nr. 9, und dem 3'-Primer LtrAex2, Seq.-ID Nr. 8. Das PCR-Produkt wurde mit BamHI geschnitten, und das resultierende Restriktionsfragment wurde gelgereinigt und in die BamHI-Stelle von Plasmid pRSETB, das von Invitrogen, San Diego, CA, erhalten wurde, kloniert, Das resultierende Plasmid pIntermediate-N fusioniert den N-Terminus von ItrA-ORF an eine His₆-Reinigungsmarkierung und fügt eine XPRESS^TM-Epitopmarkierung aus dem Vektor hinzu. In einem zweiten Schritt wurde das 5'-Exon und L1-ItrB-Intronsequenzen 5' zum ORF unter Verwendung von pLE12 als Substrat und des 5'-Primers NdeLTR5, der über die Sequenz 5'-AGTGGCTTCCATATGCTTGGTCATCACCTCATC 3', Seq.-ID Nr. 10, verfügt, und des 3'-Primers NdeLTR3', der über die Sequenz 5' GGTAGAACCATATGAAATTCCTCCTCCCTAATCAATTTT 3', Seq.-ID Nr. 11 verfügt, amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit Ndel geschnitten, aufgefüllt, das Fragment gelgereinigt und in pIntermediate-N kloniert, das auch mit Ndel geschnitten worden war. Plasmide wurden auf die Orientierung des Inserts gescreent, und jene, die so ausgerichtet waren, dass das 5'-Exon sich proximal zum T7-Promotor befand, wurden zur Transformation der Wirtszellen verwendet. Das resultierende Plasmid pFinal-N exprimiert eine Nachricht unter der Kontrolle des T7-Polymerase-Promotors, der die E1- und E2-Abschnitte der Exons ItrBE1 und ItrBE2 umfasst, und des ItrA-ORF, der mit einer His₆-Reinigungsmarkierung und mit einer XPRESS^TM-Epitopmarkierung am 5'-Ende fusioniert ist.
Zellen des BLR(DE3)-Stamms von E. coli wurden wie in Beispiel 1 beschrieben mit pintermediate-N transformiert und bei 37 °C 3 Stunden lang in SOB-Medium wie in Beispiel 3 beschrieben kultiviert. Die Zellen wurden auch in einen löslichen Anteil, der RNP-Partikel enthielt, und einen unlöslichen Anteil aufgetrennt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
BEISPIEL 7
Plasmid pETLtrA1-1 wurde dazu verwendet, eine teilweise gereinigte Formulierung des Itra-Proteins herzustellen, für welches der ORF des L1-ItrB-Introns kodiert. Plasmid pETLtrA1-1 ist ein Derivat von pETLtrA19, und es fehlt ihm Exon 1 und die Intronsequenzen stromauf des ItrA-ORF. Dementsprechend befindet sich der ItrA-ORF direkt stromab des Phagen-T7-Promotors nach der Shine-Dalgarno-Sequenz im Plasmid. Die Plasmidkarte von pETLtrA1-1 ist in 3 dargestellt.
PETLtrA1-1 wurde unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion hergestellt, um den ItrA-ORF unter Verwendung des 5'-Primers LtrAexpr 5' AAAACCTCCATATGAAACCAACAATG 3', Seq.-ID Nr, 12, der eine Ndel-Stelle einführt, und des 3'-Primers LtrAex2, Seq.-ID Nr. 8, zu amplifizieren. Das PCR-Produkt wurde mit Ndel und BamHI geschnitten, auf einem 1 % Agarose-Gel gelgereinigt und in pET20-11a kloniert. Die inserts von pLE12, pETLtrA19 und pETLtrA1-1, wovon jedes den ItrA-ORF enthält, sind in 4 dargestellt.
PETLtrA-1 wurde in Zellen des E.coli-Stamms BLR(DE3) eingeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, und die transformierten Zellen wurden 3 Stunden lang in SB-Medium bei 37 °C wie in Beispiel 3 beschrieben gezüchtet. Danach werden die Zellen lysiert und das resultierende Lysat in einen löslichen Anteil und einen nicht-löslichen Anteil durch Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit wie in Beispiel 1 beschrieben aufgetrennt.
Herstellung eines Nucleotids
Beispiel 8
Eine Nucleotid-Integrase wird in vitro durch Kombination einer exogenen RNA, die eine exzidierte L1-ItrB-Intron-RNA umfasst, mit einem gereinigten LtrA-Protein hergestellt. Das gereinigte LtrA wurde durch Unterziehen des teilweise gereinigten Itra-Proteins nach Beispiel 7 einem chromatographischen Standard-Verfahren erhalten. Die exogene RNA wurde durch Klonierung des L1-ItrB-Introns gemeinsam mit seinen flankierenden Exons in ein Plasmid stromab eines T7-Promotors, Linearisieren des Plasmids stromab von Exon 2 unter Verwendung eines Restriktionsenzyms und Transkribieren des Introns mit T7-Polymerase hergestellt. Das In-vitro-Transkript wird eine Stunde lang bei 37 °C in 500 mM NH₄Cl und 50 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 2 Ein heiten RNase-Inhibitor inkubiert, um exzidierte Intron-RNA zu erhöhen oder zu produzieren. Die exogene RNA und gereinigtes Itra-Protein werden dann in einem Puffer inkubiert, um die Nucleotid-Integrase zu bilden. Die Nucleotid-Integrase wird dann aus dem Reaktionsgemisch isoliert.
Vergleichsbeispiel A
RNP-Partikel wurden wie in Beispiel 1 beschrieben aus Zellen des BLR(DE3)-Stamms von E. coli hergestellt, der mit Plasmid pET11a transformiert worden war, dem ein Gruppe-II-Intron fehlt. Dementsprechend umfassen diese RNP-Partikel keine exzidierte Gruppe-II-RNA oder ein von einem Gruppe-II-Intron kodiertes Protein, und deshalb weisen sie keine Nucleotid-Integrase-Aktivität auf.
Vergleichsbeispiel B
RNP-Partikel wurden wie in Beispiel 1 beschrieben aus Zellen des BLR(DE3)-Stamms von E. coli hergestellt, der mit Plasmid pETLtrA19FS transformiert worden war, das die Sequenz eines Itra-ORF mit einer Rasterverschiebung 372 Rasenpaaren stromab des initiationscodons des Itra-ORF-Gerüsts umfasst. Dementsprechend umfassen diese RNP-Partikel ein trunkiertes Itra-Protein, d.h. ein Itra-Protein, dem die Zn-Domäne fehlt, und weisen deshalb keine Nucleotid-Integrase-Aktivität auf.
Charakterisierung der RNP-Partikel aus den Beispielen 1 und 2 Ein Abschnitt der RNP-Partikelformulierung aus den Beispielen 1 und 2 und Vergleichsbeispielen A und B wurde SDS-Gelelektrophorese unterworfen. Färbung des resultierenden Gels mit Coomassie-Blau ermöglichte Visualisierung der Proteine in jedem der Anteile. Eine Bande von etwa 70 kDa, die dem erwarteten Molekulargewicht des Itra-Proteins entspricht, war in den Spuren zu sehen, die Aliquoten der RNP-Partikel aus den Beispielen 1 und 2 enthielten. Diese Bande fehlte in den Spuren, welche die RNP-Partikel enthielten, die aus den Vergleichsbeispielen A und B hergestellt wurden. Auf Basis der Färbungsintensität der 70-kDa-Bande wurde die Menge des Itra-Proteins in 10 OD₂₆₀-Einheiten der RNP-Partikel auf etwa 3 μg geschätzt. Diese Ergebnisse zeigen, dass RNP-Partikel, die das von einem Gruppe-II-Intron kodierte Protein Itra enthielten, durch Expression des Gruppe-II-Intron-L1-ItrB in einer heterologen Wirtszelle hergestellt werden.
Die Umkehrtranskriptaseaktivitäten der RNP-Partikel aus den Beispielen 1 und 2 und die RNP-Partikel der Vergleichsbeispiele A und B wurden durch Inkubation jeder der RNP-Partikelformulierungen mit einer Poly(ra)-Matrize und Oligo (dT18) als Primer getestet. Die RNP-Partikel aus den Beispielen 1 und 2 zeigten Umkehrtranskriptase-Aktivität, während die RNP-Partikel aus den Vergleichsbeispielen A und B keine Umkehrtranskriptase-Aktivität zeigten. Diese Ergebnisse zeigen, dass die in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Verfahren für die Herstellung von RNP-Partikel nützlich sind, die Umkehrtranskriptase-Aktivität zeigen. Die Umkehrtranskriptase-Aktivität, die in Nucleotid-Integrasen gegenwärtig ist, ermöglicht Einführung eines cDNA-Moleküls in die Spaltstelle der doppelsträngigen DNA, die durch die Nucleotid-Integrase geschnitten wird.
Charakterisierung der Verteilung und Ausbeute des Itra-Proteins
Ein Abschnitt des nicht-löslichen Anteils und löslichen Anteils der Lysate aus den Zellen, die gemäß den Verfahren, die in den Beispielen 1, 2, 3, und 4 beschrieben wurden, transformiert und kultiviert wurden, wurden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen. Nach Elektrophorese wurden die SDS-Gele mit Coomassie-Blau gefärbt, um die Ausbeute des Itra-Proteins und die Verteilung des 70-kDa-Itra-Proteins zu vergleichen, das durch die Verfahren der Beispiele 1, 2, 3 und 4 hergestellt wurde. Die Ergebnisse dieses Tests zeigten, dass mehr vom Itra-Protein im löslichen Anteil zu finden war, wenn die transformierten BLR(DE3)-Zellen in SOB-Medium gezüchtet wurden und bei 300 U/min geschüttelt wurden als wenn die transformierten BLR-Zellen in LB-Medium gezüchtet wurden und bei 200 U/min geschüttelt wurden. Diese Ergebnisse zeigten auch, dass die gesamte Menge des Itra-Proteins, das durch die transformierten BLR-Zellen produziert wurde, d.h. die Menge von LtrA sowohl in den löslichen als auch nicht-löslichen Anteilen, zunahm, wenn ein Plasmid, das das L1.ItrB-Intron umfasste, und ein Plasmid, welches das argU(dnaY)-Gen umfasst, beide in die Wirtszellen eingeführt wurden.
Charakterisierung des von einem Gruppe-II-Intron kodierten Proteins, das nach den Verfahren aus den Beispielen 5 und 6 hergestellt wurde
Ein Abschnitt des nicht-löslichen Anteils und der löslichen Anteile der Lysate aus den Zellen, die nach den in Beispiel 5 und 6 und in den Vergleichsbeispielen A und B beschriebenen Verfahren transformiert und kultiviert wurden, wurden Elektrophorese auf doppelten SDS-Polyacrylamidgelen unterworfen, wobei eines der Gele mit Coomassie-Blau gefärbt war und die Proteine auf dem Duplikat durch Western-Blotting auf Nitrozellulosepapier transferiert wurden. Ein primärer Antikörper gegen das HSV-Antigen oder ein mit alkalischer Phosphatase markierter sekundärer Antimaus-IgG-Antikörper wurden in einem enzymgebundenen Immuntest verwendet, um Proteine zu identifizieren, die das HSV-Epitop oder das XPRESS^TM trugen. Die Ergebnisse dieser Tests zeigten, dass der Anti-HSV-Antikörper und der Anti-XPRESS^TM-Antikörper an ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 70 kDa banden, was das Molekulargewicht des Itra-Proteins ist. Das HSV-markierte Itra-Protein und das xpress^TM-markierte Itra-Protein wurden in den löslichen und nicht-löslichen Anteilen aus jenen Zellen festgestellt, die mit pintermediateC und bintermediateN transformiert worden waren, aber nicht in den löslichen Anteilen und nicht-löslichen Anteilen der Zellen, die mit pet27 b(+) und PRSETB transformiert worden waren. Daher sind die Verfahren der Beispiele 5 und 6 zur Herstellung eines markierten, von einem Gruppe-II-Introns kodierten Proteins nützlich. Diese Tests zeigten auch, dass die Menge des markierten, von einem Gruppe-II-Intron kodierten Proteins, das im löslichen Anteil gegenwärtig war, von welchem die RNP-Partikel abstammen, zunimmt, wenn die transformierten und induzierten Zellen bei 28 °C im Vergleich zu 37 °C inkubiert wurden. Alternative Studien zeigten, dass Inkubationszeiten von 30 Minuten bis 3 Stunden zur Produktion des markierten Proteins führten, aber diese Inkubationszeiten zur Produktion einer geringeren Menge des Proteins führten und daher weniger bevorzugt sind.
Verwendung von RNP-Partikel zur Spaltung von dopelsträngiger DNA und zur Insertion von Nucleotidsequenzen in die Spaltstelle
Nucleotid-Integrasen sind zur Spaltung eines oder beider Stränge eines doppelsträngigen DNA-Substrats, Katalyse der Anheftung des exzidierten Gruppe-II-Intron-RNA-Moleküls an einen der Stränge der Substrat-DNA und die Katalyse der Bildung eines cDNA-Moleküls auf dem anderen Strang des gespalteten doppelsträngigen DNA-Substrats nützlich. Daher sind die Nucleotid-Integrasen nützliche analytische Tools zur Bestimmung des Orts einer definierten Sequenz in einem doppelsträngigen DNA-Substrat. Weiters ermöglicht die gleichzeitige Insertion des Nucleinsäuremoleküls in den ersten Strang von DNA eine Markierung der Spaltstelle des ersten Strangs mit einem radiomarkierten Molekül. Zusätzlich dazu ermöglicht die automatische Anheftung eines RNA-Moleküls auf einen Strang des DNA-Substrats Identifikation der Spaltstelle durch Hybridisierungsstudien, die eine Sonde verwenden, die zum angehefteten RNA-Molekül komplementär ist. Ein angeheftetes RNA-Molekül, das mit einem Molekül, wie z.B. Biotin, markiert ist, ermöglicht der gespaltenen DNA auch, affinitätsgereinigt zu werden. Weiters ermöglicht die Spaltung eines oder beider Stränge der doppelsträngigen DNA und die gleichzeitige Insertion einer Nucleotidsequenz in die Spaltstelle Einführung neuer genetischer Information oder eines genetischen Markers in die Spaltstelle sowie Unterbrechung des gespaltenen Gens. Daher sind die Nucleotid-Integrasen auch dazu, die Substrat-DNA nicht-funktional zu machen, oder zur Änderung der Eigenschaften der RNA und des Proteins, für welches die Substrat-DNA kodiert, nützlich. Während Nucleotid-Integrasen zur Spaltung- von doppelsträngigen DNA-Substraten in einem breitgefächerten Temperaturbereich dienen, werden gute Ergebnisse bei einer Reaktionstemperatur von etwa 30 °C bis etwa 42 °C erhalten, vorzugsweise von etwa 30 °C bis etwa 37 °C. Ein geeignetes Reaktionsmedium enthält ein einwertiges Kation, wie z.B. Na⁺ oder K⁺, und ein zweiwertiges Kation, vorzugsweise ein Magnesium- oder Manganion, noch bevorzugter ein Magnesiumion, in einer Konzentration, die geringer ist als 100 mM und größer als 1 mM. Vorzugsweise liegt das zweiwertige Kation in einer Konzentration von etwa 5 bis etwa 20 mM vor. Der bevorzugte pH für das Medium ist etwa 6,0-8,5, noch bevorzugter etwa 7,5-8,0.
Spaltung von 3' und 5'-endmarkierter doppelsträngiger DNA
0,025 OD₂₆₀ der RNP-Partikel aus Beispiel 1 und Vergleichsbeispiele A und B wurden 20 min lang mit 150.000 cpm von jedem eines 5'- und 3'-endmarkierten DNA-Substrats inkubiert, das die Exon-1- und Exon-2-Verbindung des ItrB-Gens umfasst. Die Sequenz des 129-Basenpaarsubstrats, welches die 70-Basenpaar-Exon-1- und Exon-2-Verbindung des IrtB-Gens aufweist, plus Sequenzen des Plasmids ist in 5 und Seq.-ID Nr. 4 dargestellt. Zur Überprüfung der Spaltung wurden die Produkte auf einem 6 % Polyacrylamidgel isoliert.
Das Substrat, das durch die Nucleotid-Integrase gespalten wird, welche die exzidierte L1.trb-Intron-RNA und das Itra-Protein umfasst, ist in 6(a) schematisch dargestellt. Zusätzlich dazu ist die IBS1- und IBS2-Sequenz des Substrats in 6(b) dargestellt. Wie in 6 dargestellt sind die IBS1- und IBS2-Sequenzen, die zu den EBS-Sequenzen der Lltr.B-Intron-RNA komplementär sind, in Exon 1 des Itrb-Gens gegenwärtig. Wie in 6 dargestellt spalteten die RNP-Partikel nach dem Verfahren aus Beispiel 1 den Sense-Strang des Substrats an Position 0, das die Exon-1 und Exon-2-Verbindung ist, und den Antisense-Strang an +9. Wenn die RNP-Partikel, die nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt werden, vor Inkubation der Partikel mit dem Substrat entweder mit RNAse A/T1 behandelt wurden, um die RNA in den Partikeln abzubauen, oder mit Proteinase K, um die Proteinkomponente in den Partikeln abzubauen, war keine Spaltung des Substrats zu beobachten. Diese Ergebnisse zeigen, dass sowohl die RNA-Komponente als auch die Proteinkomponente der Nucleotid-Integrase nötig sind, um beide Stränge der Substrat-DNA zu spalten.
Spaltung beider Stränge der doppelsträngigen DNA und Insertion der Intron-RNA der Nucleotid-Integrase in die Spaltstelle
0,025 OD₂₆₀-Einheiten der RNP-Partikel aus Beispiel 1 wurden mit 125 fmol (150.000 cpm) des innenmarkierten 129-Basenpaar-DNA-Substrats 20 min lang umgesetzt.
Um Spaltung nachzuweisen, wurden die Produkte glyoxalatiert und in einem 1 % Agarose-Gel analysiert.
Eine dunkle Bande von Radiomarkierung von etwa 1,0 kb RNA und eine hellere Bande von etwa 0,8, 1,1, 1,4, 1,5, 1,6, 1,9, 2,5, 3,2 waren auf dem Gel zu beobachten. Vorbehandlung der Reaktionsprodukte mit RNAse vor Isolation auf dem Agarose-Gel resultierte im vollständigen Verschwinden dieser Banden. Diese Ergebnisse zeigen, dass L1.-ItrB-Intron-RNA an das DNA-Substrat während der Reaktion des Substrats mit den RNP-Partikel aus Beispiel 1 angeheftet wurde. Auf Basis der Größe des L1-trB-Introns wird davon ausgegangen, dass die Bande bei 2,5 kb die Integration von Volllängen-Gruppe-II-Intron-RNA in die Spaltstelle des Sense-Strangs repräsentiert. Die Gegenwart kleinerer radiomarkierter Produkte auf dem Gel soll auf den Abbau der integrierten Intron-RNA durch RNAsen zurückzuführen sein, die in der RNP-Partikelformulierung gegenwärtig sein können. Das Ergebnis, dass die RNADNA-Produkte Denaturierung mit Glyoxal standhalten, zeigt eine kovalente Bindung zwischen der Intron-RNA und dem DNA-Substrat. SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Nucleotid-Integrase, bei der es sich um ein Ribonucleoprotein-Partikel handelt, das eine exzidierte Gruppe-II-Intron-RNA und ein von einem Gruppe-II-Intron kodiertes Protein umfasst, die ein doppelsträngiges DNA-Substrat spaltet, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) das Bereitstellen eines DNA-Moleküls, das eine Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz umfasst, worin die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz für eine Gruppe-II-Intron-RNA kodiert und eine offene Leserastersequenz umfasst, die für ein von einem Gruppe-II-Intron kodiertes Protein kodiert; (b) das Einführen des DNA-Moleküls in eine Wirtszelle; (c) das Exprimieren der Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz in der Wirtszelle, um eine exzidierte Gruppe-II-Intron-RNA und ein von einem Gruppe-II-Intron kodiertes Proteinmolekül bereitzustellen, worin sich das Protein und die RNA in der Wirtszelle verbinden, um die Nucleotid-Integrase zu bilden; (d) das Gewinnen der Nucleotid-Integrase aus Schritt (c) aus der Wirtszelle.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das DNA-Molekül weiters einen Promotor umfasst, der operabel an die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin der Promotor ein induzierbarer Promotor ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das DNA-Molekül weiters eine Nucleotidsequenz umfasst, die für eine Markierung kodiert, um die Isolation der Nucleotid-Integrase aus der Wirtszelle zu vereinfachen; und worin das Verfahren weiters das Exprimieren der Nucleotidsequenz, die für die Markierung kodiert, in der Wirtszelle umfasst, um ein markiertes, von einem Gruppe-II-Intron kodiertes Protein bereitzustellen; und worin Schritt (d) das Einsetzen der Markierung zur Gewinnung der Nucleotid-Integrase umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, worin sich die Sequenz, die für die Markierung kodiert, am 5'-Ende oder 3'-Ende der offenen Leserastersequenz der Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz befindet.
Verfahren nach Anspruch 2, weiters folgende Schritte umfassend: das Einführen einer DNA-Sequenz, die für eine tRNA kodiert, weiche dem genetischen Code der Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz entspricht, in die Wirtszelle vor Schritt (b) und das Exprimieren der für tRNA kodierenden DNA-Sequenz in der Wirtszelle.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das DNA-Molekül durch die folgenden Schritte hergestellt wird: das Herstellen einer synthetischen Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz; worin die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz eine Sequenz von Nucleotiden umfasst, die an die Erkennungsstelle der Substrat-DNA binden, und das Inkorporieren der synthetischen Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz in das DNA-Molekül.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz die DNA-Sequenz des LI.ItrB-Introns umfasst und die Ribonucleoprotein-Partikel eine exzidierte LI.ItrB-Intron-RNA und ein ItrA-Protein umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz eine modifizierte DNA-Sequenz des LI.ItrB-Introns umfasst und die RNP-Partikel eine modifizierte exzidierte LI.ItrB-Intron-RNA und ein ItrA-Protein-Molekül umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz eine modifizierte DNA-Sequenz des LI.ItrB-Introns umfasst und die RNP-Partikel eine modifizierte exzidierte LI.ItrB-Intron-RNA und ein modifiziertes ItrA-Protein-Molekül umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Wirtszelle E. coli ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin die Wirtszelle E. coli ist.
Verfahren zur In-vitro-Herstellung einer Nucleotid-Integrase, bei der es sich um ein Ribonucleoprotein-Partikel handelt, das eine exzidierte Gruppe-II-Intron-RNA und ein von einem Gruppe-II-Intron kodiertes Protein umfasst, folgende Schritte umfassend: (a) das Bereitstellen einer isolierten exzidierten Gruppe-II-Intron-RNA; (b) das Bereitstellen eines isolierten, von einem Gruppe-II-Intron kodierten Proteins; und (c) das Inkubieren der exzidierten Gruppe-II-Intron-RNA mit dem von einem Gruppe-II-Intron kodierten Protein ausreichend lange, um eine Nucleotid-Integrase zu bilden, welche die exzidierte Gruppe-II-Intron-RNA an das von einem Gruppe-II-Intron kodierte Protein gebunden umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das von einem Gruppe-II-Intron kodierte Protein durch ein Verfahren hergestellt wird, das folgende Schritte umfasst: (a) das Bereitstellen eines DNA-Moleküls, das eine offene Leserastersequenz eines Gruppe-II-Introns umfasst, wobei die offene Leserastersequenz operabel an einen Promotor gebunden ist; (b) das Einführen des DNA-Moleküls aus Schritt (a) in eine Wirtszelle; (c) das Exprimieren der offenen Leserastersequenz in der Wirtszelle, um das von einem Gruppe-II-Intron kodierten Protein bereitzustellen; und (d) das Isolieren des von einem Gruppe-II-Intron kodierten Proteins aus der Wirtszelle.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das DNA-Molekül weiters eine Sequenz umfasst, die für eine Markierung kodiert, welche die Isolation des von einem Gruppe-II-Intron kodierten Proteins aus der Wirtszelle vereinfacht; und worin das Verfahren weiters das Exprimieren der Nucleotidsequenz, die für die Markierung kodiert, in der Wirtszelle umfasst, um ein markiertes, von einem Gruppe-II-Intron kodiertes Protein bereitzustellen; und worin Schritt (d) das Gewinnen einer markierten Nucleotid-Integrase aus der Wirtszelle umfasst.
Verfahren nach Anspruch 15, worin sich die Sequenz, die für die Markierung kodiert, an einer Position befindet, die aus dem 5'-Ende und dem 3'-Ende der offenen Leserastersequenz ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die offene Leserastersequenz für das ItrA-Protein kodiert und worin die exzidierte Gruppe-II-RNA aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer unmodifizierten, exzidierten LI.ItrB-Intron-RNA und einer modifizierten, exzidierten LI.ItrB-Intron-RNA besteht.
Verfahren zur In-vitro-Herstellung einer Nucleotid-Integrase, bei der es sich um ein Ribonucleoprotein-Partikel handelt, das eine exzidierte Gruppe-II-Intron-RNA und ein von einem Gruppe-II-Intron kodiertes Protein umfasst, folgende Schritte umfassend: (a) das Bereitstellen einer exogenen RNA, die eine exzidierte Gruppe-II-Intron-RNA umfasst; (b) das Bereitstellen eines RNA-Protein-Komplexes, worin der RNA-Protein-Komplex ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, für die ein Gruppe-II-Intron kodiert, und eine RNA, die frei von exzidierten Gruppe-II-Intron-RNA-Molekülen mit einer Sequenz ist, die für das Protein kodiert, umfasst; wobei der RNA-Protein-Komplex durch die folgenden Schritte hergestellt wird: (i) das Bereitstellen eines isolierten DNA-Moleküls, das eine Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz umfasst, worin die Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz für ein von einem Gruppe-II-Intron kodierten Protein und eine spleißdefekte Gruppe-II-RNA kodiert; (ii) das Einführen des DNA-Moleküls in eine Wirtszelle; (iii) das Exprimieren der Gruppe-II-Intron-DNA-Sequenz in der Wirtszelle, worin ein RNA-Protein-Komplex, der das von einem Gruppe-II-Intron kodierte Protein umfasst, und die spleißdefekte Gruppe-II-RNA in der Zelle gebildet werden; (iv) das Gewinnen des RNA-Protein-Komplexes aus Schritt (iii) aus der Wirtszelle; und (c) das Inkubieren der exogenen RNA aus Schritt (a) mit dem RNA-Protein-Komplex ausreichend lange, um eine Nucleotid-Integrase zu bilden, welche die exzidierte Gruppe-II-RNA und das Protein mit einer von einem Gruppe-II-Intron kodierten Aminosäuresequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Wirtszelle eine homologe Bakterienzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Wirtszelle eine heterologe Bakterienzelle ist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die Gruppe-II-Intron-RNA eine modifizierte Gruppe-II-Intron-RNA ist.