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Verfahren zur Gewinnung der ECoRI-Restriktionsendonuklease
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aus Escherichis coli Die ECoRI-Kestriktionsendonuklease hat große
Bedeutung in der DNA-Analyse erlangt, da sie eine hohe Substratspezifität aufweist.
Die spezifische Doppelstrang-Erkennungsstelle besitzt dabei folgende Sequenz: 5'--
AjT-G-A-A-T-T-C-A/T - - 3' 3'-- T/A-C-T-T-A-A-G-T/A - - 5' r Diese zeichnet sich
auch dadurch aus, daß sie überlappende Einzelstrangenden erzeugt. DNA-Fragmente
die durch "ECoRI" gespalten werden, lassen sich an ihren Enden reassoziieren und
mit Polynucleotidligase verknüpfen. Diese Arbeitsweise gestattet, DilA-Bruchstücke
prokaryotischen und eukaryotischen Ursprungs an replizierfähige DNA, wie Plasmid-DNA
oder Phagen-DA, anzuhängen. Die in vitro rekombinierten DNA-Fragmente können durch
Transformation bzw. Transfektion in Bakterienzellen übertragen und vermehrt werden.
Es kann somit die Aufgabe gelöst-werden, neue genetische Information in Bakterien
einzuschleusen. Durch gezielte Auswahl der einzubringenden DNA können mit diesem
Verfahren Bakterien genetisch so verändert werden, daß sie wichtige Naturstoffe
produzieren.
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Es ist aus Nature 214, 885 - 887 (1967)bekannt, daß der Antibiotikaresistenzfaktor
R1, ein fi + -Faktor, in Escherichia coli Resistenzen gegen Chloramphenicol, Kanamycin,
Streptomycin, Ampicillin und Sulfonamid kodiert und weiter ist aus J. Bacteriol.
112.1275-1279(1972)bekannt, daß er die Synthese der ECoRI-Restriktionsendonuklease
ECoRI determiniert. Es ist weiter allgemein eine Deletionsmutante dieses R1-Faktors
bekannt, der nur nach Resistenz gegen Kanamycin trägt; dieser heißt Rldrd16. Aus
In Methods in molekular Biology, New York, Marcel-Dekker, Inc. V. 7, 67-105(1974).
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Ist ein Verfahren zur Herstellung der ECoRI-Restriktionsendonuklease
bekannt, in welchem zu ihrer Gewinnung die Zellsubstanz zerstört wird und zu ihrer
ersten Anreicherung in mehrstufigen Fällungsschritten arbeitet.
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Das Verfahren gemäß der Erfindung bietet dagegen den Vorteil, daß
zur Gewinnung von "ECoRI" ein Bakterium, das keine Antibiotika-Resistenz trägt,
benutzt wird, die Zellsubstanz nicht zerstört wird und danach zu ihrer leisten Anreicherung
ein einstufiger Fällungsschritt durchqeführt wird.
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Es wurde ein Verfahren zur Herstellung der ECoRI-Restriktionsendonuklease
aus Escherichia coli SB 5, DSM-Nr ga6 , die keine Antibiotika-Resistenz, jedoch
t'ECo-RI" besitzt, gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß unter aeroben Bedingungen
Escherichia coli SB5 in einem wässrigen Nährmedium aus Proteinen, anorganischen
Salzen, Glycerin als C- und Energiequelle,.in welches Luft oder 02-angereicherte
Luft bei einer Reaktionstemperatur von 30° - 40°C bis zur logarithmischen Phase
zugeführt und eine Submerskultur erzeugt wird, danach aus dem Reaktionssystem.die
Zellmasse abzentrifugiert und der lösliche Uberstand abgeführt wurd, danach die
Zellmasse in einer wässrigen PEMA (lo m M KH2P04-K2 HP04pH 7,o,o,7 mit Mercaptoäthanal
und im M EDFA) mit etwa bis 0,1 Molarer NaCl und gegebenenfalls .etwa o,2%igemnicht
ionischeml
Detergens bei 0 - 40 C suspendiert wird, danach eine
Teilmenge Enzymaktivität durch Rühren mit Scherkräften von der im wesentlichen unzerstörten
Zellmasse abgelöst, durch Zentrifugieren die Zellmasse abgetrennt und ausgeführt
wird, die Lösung unter Rühren mit Cetyltrimethylammoniumbromid bis zu einer 1 Vol
%igen Endkonzentration zur Beseitigung von störenden Nebenaktivi täten versetzt
der entstehende Niederschlag abgetrennt und ausgeführt wird.
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Zum Oberstand Phosphocellulose gerührt mit 0,1 M NaCI 1 haltigem
Puffer gewaschen und danach mit 1 M NaCl haltigem Puffer durch Waschen eluiert wird,
danach gegen 0,1 M NaCl haltigem Puffer zum Entfernen des überschüssigen NaCl dialysiert,
danach die Lösung auf einer Phospho-Cellulose-Säule gepumpt, die Enzymaktivität
an die Säule gebunden, die Lösung ausgeführt wird, danach die Aktivität mit einem
linearen 0,3 - 0,8 M NaCl-Gradienten eluiert1 in Teil fraktionen gesammelt, die
ausgetesteten aktiven Franktionen, welche '2ECo-RI"-Aktivität enthalten, auf eine
Hydroxylapatit-Säule aufgepumpt,nach Waschen mit 0,1 M NaCl-Puffer, die gebundene
Aktivität mit einem linearen 0,01 - 0,5 M Phosphat-Gradienten in Teilfraktionen
eluiert wird und die ausgetesteten aktiven Fraktionen über einen-Membran-schlauch
zu einer von hoher Reinheit konzentrierten ECo-RI-Restriktionsendonuklease eingeengt
werden. . - ~~~ Es wurde weiter ein Verfahren gefunden, welches dadurcn gekennzeichnet
ist, daß an der Außenmembran von Mikroorganismen gebundene Proteine in Mengen von
etwa 0,5 - 500 g Zellfeuchtmasse durch homogenisierenund in Mengen über 500 g mit
mechanisch bewegten harten Kügelchen aus Glas, Keramik oder Kunststoffen, von der
im wesentlichen unzerstörte Zellmasse, die einer weiteren Verwendung zugeführt wird,
abgelöst werden.
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Die Herstellung von Escherichia Coli SB 5 wird beispielsweise wie
folgt erläutert: Der Faktor Rldrdl6, der Resistenz gegen Kanamycin trägt, wurde
in einen Endonuklease I-negativen Stamm E.coli 1100 übertragen. Durch Mutation mit
N-Nitroso-N-methyl-N'-Ni-troguanidin (NNMG) wurden Antibiotikaresistenzfreie Kolonien
erhalten, Rtdrdl6 mut 1 genannt. Aus dem Stamm RY 13, bekannt nach In Methods in
molecular Biology l.c., wurde der Faktor, der "ECoRI" determindert, isoliert und
in den Stamm E.coli 1100 Rldrdl6 mut 1 übertragen. Es wurden weiter Kolonien isoliert,
welche keine Antibiotika-Resistenz tragen, jedoch 'tECoRI" produzierten.
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Das im Verfahren der Erfindung verwendete Bakterium SB 5 wurde bei
der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen mit der DSNr. j -zb t: h hinterlegt;/Der
Stamm zeigt Eigenschaften, wie für Escherichia coli K12-Stämme in Bergey's Manual
Determinative Bacteriology, 8th Edition beschrieben. Der Stamm ist sensitiv gegen
Chloramphenicol, Kanamycin, Streptomycin, Ampicillin und Sulfonamid, determiniert
jedoch die ECoRI-Restriktionsendonuklease.
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Das Verfahren der Erfindung wird beispielsweise wie folgt erläutert:
Der Stamm wurde in 300 ml Medium bei 370 C unter Schütteln ca. 6 h vorgezogen. Ein
20 1 Fermenter, 30 Min.
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bei 121 0C sterilisiert, wurde mit der Vorkultur angeimpft.
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Die Kultur wurde bei 37 0C, einer Belüftung von 1000 N ltr.
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und einer Drehzahl von 600 Upm eines Umwurf-Rührsystems 5-6 h wachsen
gelassen. Die 20 l Vorkultur wurde anschließend-in einen 200 1 Fermenter steril
übergepumpt;
Sterilisation 60 min bei 121°C, pH 6.8-7 wurde stabilisiert
durch Zutitrieren von 4 1 25 % NH4C1, Pausenzeit 20 sec., Dosagenzeit 2 sec, Temp.
37°C, Belüftung 1100 N ltr.
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Drehzahl 900 Upm. Anfangs-OD578=1,250; nach 8,5 h Wachstumszeit wurde
bei einer OD578=22,000 der Fermentationsprozess abgebrochen. Nach Abkühlen auf ca.
2OOC wurde abzentrifugiert. Gesamtbakterienfeuchtmasse 7.550 g mit ungefähr 80 %
Wasserqehal t.
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Die Zellen wurden in Aliquots von 1000 g bei - 20 OC eingefroren.
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Bei der Isolierung des Enzyms durch mechanisches Ablösen in kleinen
Mengen wurde o,5 g Zellfeuchtmasse, frisch oder nach Einfrieren aufgetaut, mit 3
ml PEM Puffer (PEM enthält: 10 mM KH2 PO4 - K2HPO4 pH 7.0 0,7 mM 2-Mercaptoäthanol
und 1 mM EDTA) und o,1 m NaCl und 0,1 mM PMSF und 0,2 X nichtionischem Detergens,(Triton
N101 - Handelsprodukt der Firma Rohm and Haas, Frankfurt) in einem Homogenisator
(Typ nachPotter-Elvehjen) ) 2x2,5 min unter Eiskühlung bei 2000 RPM gerührt. Nach
Zentrifugieren (Typ Beckmann JA10 10.000 RPM 20C 1 h) wurde im Oberstand die Aktivität
geprüft; in mittelgroßen Mengen wurden bis 500 g Zelifeuchttasse frisch oder nach
Einfrieren aufgetaut, mit 500 ml PEM Puffer und 0,1 mM PMSF und 0,2 m NaCl und 0,2
% nichtionischem -Detergens suspendiert. Nach mehrmaligem Durchlauf -im Homogenisatornach
sich. DY.9 Runtear( W 6iühlung wurde wie .oben abzentrifugiert und im Oberstand
die Aktivität bestimmt. In großen Mengen über 500 g Zellfeuchtmasse-, frisch oder
nach Einfrieren aufgetaut wurde die Enzymaktivität mit mechanisch bewegten Glasperlen
(Typ Dyno Mühle - Firma Bachofen, Basel/Schweiz) abgelöst.
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a) Mahlbehälter-Größe: 0,6 1 für kontinuierliche-n Betrieb. b) Mahikörper
Typ-Größe: Glaskugeln bleifrei 1-1,5 mm p
c) Mahlkörper-Menge: 520
ml, d) Kührwellen-Drehzahl: 200 RPM, e) Mantel/Scheiben-Werkstoff: Glas bleifrei/rostfreier
Stahl f) Durchflußmenge pro Stunde: 5-7 l/h, g) Durchläufe: 2, h) Reibspalt-Größe:
0,2 od. 0,3 0,3 mmi) Kühlmanteltemperatur: -4°C bis -3°C.) Danach wurde zentrifugiert
(Typ Beckmann Ja10 bei 1000 RPM; 2°C 1 h). Im Oberstand wurde Aktivität bestimmt.
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Zum klaren Oberstand wurde Phosphocellulose Pil (der Fa.
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-,Whatman) gerührt, welche mit PEM o,1 mM PMSF und 0,1 m'NaCl vor-her
äquilibriert wurde. Die Zellulose wurde auf einer Nutsche abgesaugt und mit dem
PEM-Puffer nachgerYaschen, "ECoRI" wurde mit dem PEM-Puffer und I M NaCl eluiert.
Das Eluat wurde mit Membranschläuchen (Typ Amicon Hollowfiber HlP10) konzentariert
und gegen PEM-Puffer in 0,f M NaCI dialiysiert.
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Die Aktivität von "ECoRI" wurde bestimmt.
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Das Dialysat wurde auf eine Säule von Phosphocellulose aufgepumpt,die
mit PEM-Puffer und 0,1 M NaCl gewaschen und mit einem linearen Gradienten 0,3-0,8
M NaCl eluiert wurde. Die Aktivität eluierte zwischen 0,45-0,8 M NaCI.
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Eine Hydroxylapatit-Säule wurde mit PEM-Puffer und 0,1 M NaCl äquilibriert.
Nach Auftrag der aktiven Fraktionen wurde mit demselben Puffer gewaschen und mit
einem linearen Gradienten 0,01 M-0,5 M KPO4 pH 7 eluiert. Die gewonnene ECoRI-Restriktionsendonuklease
ist hochaktiv und frei von unspezifischen Enzym-Aktivitäten.
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Die "ECoRI§ kann im Kühlschrank bei 40C unter Eiskühlung ohne und
mit 50 X Glycerin aufbewahrt werden; mit 50 % Glycerin kann sie bei -200C stabil
gelagert werden.
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Mit der Ablösestufe wurde eine ca. 5O obige Ausbeute an Enzymaktivität
erreicht; es besteht der technische Vorteil, daß einmal eine hohe spezifische Aktivität
erreicht iwird und zum anderen die unzerstörte Zellmasse einer weiteren Verwendung
z.B. für die Gewinnung von intracellulären Substanzen, zugeführt werden kann. Dem
Oberstand wurde unter ständigem Rühren eine 10 % Cethyltrimethylammoniumbromidlösung
bis 1 Vol % Endkonzentration zugegeben. Nach 30 min Rühren wurde wie oben zentrifugiert
und der Niederschlag ausgeführt.
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Die nach den Verfahren der Erfindung erzeugte ECoRI-Restriktionsendonuklease
wurde nach In Methods in mol.
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Biology l.c. in ihrer Aktivität geprüft. Es ergab folgende Werte,
Col EI-DNA wurde einmal, 7LDNA sechsmal gespalten. Eine modifizierte Aktivität von
"ECoRI" nach PNAS 72, 3310 - 3314 (1975) wurde gefun-den.