DE3401617C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die neue Typ II-Restriktionsendonuklease Mae I, ein Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung (vgl. die Patentansprüche 1, 2 und 6).

Typ II-Restriktionsendonukleasen sind Endodesoxiribonukleasen, welche bestimmte DNA-Sequenzen zu erkennen und zu spalten vermögen. Dabei werden Phosphodiesterbrücken in der Zielsequenz hydrolysiert, und zwar in jedem Polynukleotidstrang eine. Typ II-Restriktionsendonukleasen sind daher wertvoll für die Analyse von DNA-Molekülen.

Es sind zwar bereits für zahlreiche DNA-Sequenzen spezifische Typ II-Restriktionsendonukleasen bekannt, jedoch besteht immer noch Bedarf an der Schaffung weiterer Typ II-Restriktionsendonukleasen, die für DNA-Sequenzen spezifisch sind, die bisher von keiner der bekannten Restriktionsendonukleasen erkannt werden. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine neue Restriktionsendonuklease zur Verfügung zu stellen, welche eine bisher von keinem derartigen Enzym erkannte Sequenz spezifisch zu erkennen und zu spalten vermag.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch eine Restriktionsendonuklease, welche gekennzeichnet ist durch die palindrome Erkennungssequenz und die durch den Pfeil definierte Spaltungsstelle.

Die erfindungsgemäße neue Typ II-Restriktionsendonuklease, die im folgenden als Mae I bezeichnet wird, besitzt ein Temperaturoptimum zwischen 45 und 48°C und ein pH-Optimum bei 8,0/45°C in Tris/HCl-Puffer. Weitere optimale Reaktionsparameter sind 250 mM NaCl, 12 bis 18 mM Mg²⁺, 6 bis 12 mM 2-Merkaptoethanol. Die Anwesenheit von Mg²⁺ ist für die Aktivität des Enzyms notwendig.

Das Enzym wirkt, wie oben erwähnt, an palindromischen Strukturen, es erkennt also eine selbstkomplementäre Nukleinsäuresequenz, bei der der Komplementärstrang des Doppelstrangs die identische Sequenz in gegenläufiger Richtung aufweist.

Die Erkennungssequenz und Schnittstelle des Enzyms läßt sich wie folgt feststellen: das Plasmid pBR 322 wird mit Hinf I vollständig verdaut. Die Hinf I Fragmente B und C (517 bp bzw. 506 bp) werden isoliert, ihre 3′-Enden mit alpha-[³²P]-ATP und Klenow-Polymerase markiert und anschließend mit Alu I gespalten. Aus den hierbei entstehenden markierten Fragmenten wird das 330 bp-Fragment (pBR 322, Position 3036 bis 3366, Länge des Fragments einschließlich Einzelstrang-Enden) isoliert und sequenziert.

Ein Aliquot des 330 bp-Fragmentes wird mit dem erfindungsgemäßen Enzym gespalten, wobei sich die Schnittposition 3223 ergibt.

Die Länge des Hinf I/Mae I-Fragments wird in Sequenzgelen bestimmt. Dabei läuft das Hinf I/Mae I-Fragment im Gel wie das "C" der Sequenzleiter in der Erkennungssequenz 5′-CTAG-3′. Es endet deshalb mit den Nukleotid T der Erkennungssequenz. Die Schnittstelle von Mae I ist also zwischen dem Nucleotid C und T.

Erfindungsgemäß wird die neue Endonuklease Mae I gewonnen, indem man Methanococcus aeolicus DSM 2835 züchtet und das Enzym aus den Zellen gewinnt. Zur Gewinnung werden die üblichen biochemischen Aufreinigungsmethoden verwendet, wobei in den jeweils erhaltenen Fraktionen das Vorhandensein des Enzyms anhand der Spaltung seiner Erkennungssequenz nachweisbar ist. Als Substrat eignet sich beispielsweise pBR 322-DNA. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden in Agarosegelen in den für die Fragmentauftrennung üblichen Puffersystemen in Gegenwart von Ethidiumbromid elektrophoretisch aufgetrennt.

Der für die Gewinnung des Enzyms verwendete Mikroorganismus wächst anaerob in Medium III (Microbiol. Reviews 43, 260-296 (1979)) auf H₂/CO₂ oder auf Formiat. Er bildet reguläre bis irreguläre Coccen von etwa 2 µm Durchmesser, einzeln und zu zweit. Auf Agar werden runde konvexe hellockerfarbene Kolonien mit ca. 2 mm Durchmesser gebildet. Der Mikroorganismus ist Gramnegativ. Die Zellhülle besteht aus Proteinuntereinheiten. Wachstum ist zwischen 25 und 50°C mit Optimum bei 45°C (2 Stunden Verdoppelungszeit) gegeben. Wachstum tritt auf in Gegenwart von 1,5 bis 5%, optimal 4% NaCl. Die DNA-Basenzusammensetzung ist 28,6% G+C. Der Mikroorganismus unterscheidet sich daher von bekannten Methanococcen durch einen etwas niedrigeren GC-Gehalt der DNA, durch die optimale Wachstumstemperatur von 45°C, durch die deutlich größeren Zellen und durch das Vorhandensein neuer Restriktionsenzyme.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen aufgeschlossen, der Extrakt wird mit Polyethylenimin bis auf eine Konzentration von 0,65% versetzt, der Niederschlag wird abgetrennt und aus dem Überstand wird die bis 60% Ammoniumsulfatsättigung ausfallende Fraktion gewonnen.

Für den Aufschluß eigenen sich die üblichen mechanischen und chemischen Methoden, wie z. B. Hochdruckdispersion, Ultraschall oder enzymatische Verdauung.

Die Feinreinigung der das neue Enzym enthaltenden Ammonsulfatfraktion kann zweckmäßig durch Molekularsiebfraktionierung, Chromatographie über Anionenaustauscher und über Kationenaustauscher sowie abschließender Affinitätschromatographie erfolgen. Als Molekularsiebmaterial hat sich das unter der Handelsbezeichnung Ultrogel ACA 34 handelsübliche Produkt, ein Acrylamid/Agarose Heteropolymerisat aus 3% Acrylamid und 4% Agarose, bewährt. Als Anionenaustauscher eignen sich mit Diethylaminoethylgruppen modifizierte Trägermaterialien auf Basis Sepharose, Cellulose oder synthetischen Polymeren, z. B. das unter der Handelsbezeichnung DEAE-Sephacel® vertriebene Produkt.

Als Kationenaustauscher werden vorzugsweise Phosphatgruppen enthaltende Substanzen, vorzugsweise Kohlehydrate, beispielsweise Cellulosephosphat und dergleichen verwendet. Für die Affinitätschromatographie hat sich besonders trägerfixiertes Heparin bewährt, z. B. Heparin-Sepharose.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Methanococcus aeolicus DSM 2835 wird in Minimalformiatmedium, welches unten näher beschrieben ist, bei 45°C 3 Tage anaerob wachsen gelassen und dann in stationärer Phase geerntet. 35 g so erhaltener Zellpaste werden in 70 ml Aufschlußpuffer (40 mM Tris/HCl, pH 8,0/4°C; 0,1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure); 7 mM 2-Merkaptoethanol und 0,2 mM PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid) suspendiert.

Dann werden die Zellen durch Hochdruckdispersion in einer vorgekühlten Druckzelle bei 1100 bar zweimal aufgeschlossen.

Die Aufschlußsuspension wird mit 0,3 M NH₄Cl versetzt. Anschließend werden 7 ml 10%iger Polyethyleniminlösung bis zu einer Endkonzentration von 0,65% (V/V) zugesetzt. Nach 30 Minuten Stehenlassen bei 4°C wird der gebildete Niederschlag 60 Minuten bei 27 300 g abzentrifugiert und verworfen. Der Überstand wird mit festem (NH₄)₂SO₄ bis auf 60% Sättigung versetzt. Der Ammoniumsulfatniederschlag wird nach 16 Stunden bei 4°C 60 min bei 27 300 g abzentrifugiert.

Das Minimalmedium hat folgende Zusammensetzung:

g/Liter KCl0,32 g MgCl₂×6 H₂O2,75 g MgSO₄×7 H₂O3,45 g NH₄Cl0,25 g CaCl₂×2 H₂O0,15 g K₂HPO₄0,15 g NaCl18 g Mineralienelexier*)10 ml Fe(NH₄)₂(SO₄)₂×7 H₂O2 mg NaHCO₃ (am Schluß zugeben)5,5 g Resazurin 0,1%ig1 ml Na-Formiat15 g Na-Wolframat3,3 mg

lösen, 50 ml Reduktionsmittel bestehend aus:

g/Liter Na₂S12,5 g N₂ durchblubbern lassen 1 n NaOH frisch75 ml Resazurin 0,1%ig1 ml

zugeben, pH-Wert mit Ameisensäure auf 6,9 stellen und auf 1 Liter auffüllen, N₂ durchblubbern lassen.
*) Mineralienelixier:

g/Liter Titriplex I1,5 g HgSO₄×7 H₂O3,0 g MnSO₄×2 H₂O0,5 g pH-Wert langsam mit 5 n KOH auf 6,5 einstellen NaCl1,0 g FeSO₄×7 H₂O0,1 g CoSO₄ oder CoCl₂0,1 g CaCl₂×2 H₂O0,1 g ZnSO₄0,1 g CuSO₄×5 H₂O0,01 g K Al(SO₄)₂0,01 g H₃BO₃0,01 g Na₂MoO₄×2 H₂O0,01 g

Beispiel 2

Der nach Beispiel 1 erhaltene Ammoniumsulfatniederschlag wird mit TEMG-Puffer (40 mM Tris/HCl pH 8,0/4°C; 0,1 mM EDTA; 7 m 2-Mercaptoethanol; 10% V/V Glycerin) und 0,5 mM NaCl aufgenommen und auf eine Ultrogel AcA 34- Molekularsiebsäule von 3×100 cm gegeben. Diese Säule wird mit TEMG-Puffer + 0,5 M NaCl eluiert und die Eluatfraktionen mit Mae I Aktivität werden vereint.

Die vereinten Eluatfraktionen werden an einer mit TEMG-Puffer equilibrierten Anionenaustauschersäule (DEAE-Sephacel 2×10 cm) chromatographiert. Nach Waschen mit 2 Säulenvolumina TEMG-Puffer wird das Enzym mit einem linearen TEMG-Gradienten mit 0 bis 1 M NaCl eluiert. Das Enzym erscheint in den Fraktionen 0,1 bis 0,3 M NaCl. Die Fraktionen werden vereinigt und gegen TEMG-Puffer dialysiert. Das Dialysat wird an einer mit TEMG-Puffer equilibrierten Kationenaustauschersäule (Cellulosephosphat P 11/1×10 cm) chromatographiert. Waschen und Elution erfolgt wie bei der Anionenaustauschersäule. Mae I eluiert zwischen 0,4 und 0,6 M NaCl. Die vereinigten enzymhaltigen Fraktionen werden wieder gegen TEMG-Puffer dialysiert und das Dialysat an einer mit TEMG-Puffer equilibrierte Affinitätschromatographiesäule (Heparin-Sepharose CL6B/1×5 cm) chromatographiert. Waschen und Eluieren erfolgt wiederum, wie bei der Anionenaustauschersäule beschrieben. Mae I eluiert zwischen 0,4 und 0,6 M NaCl. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt, gegen 20 mM Tris/HCl- Puffer pH 8,0 bei 4°C, enthaltend 0,1 mM EDTA, 10 mM 2-Merkaptoethanol, 100 mM NaCl, 50 Vol.-% Glycerin, 0,01 Vol.-% Triton X 100®, dialysiert und bei -20°C aufbewahrt.

Aktivität etwa 10 000 U Mae I (Aktivitätsdefinition: 1 U=1 µg pBR 322-DNA/Stunde bei 45°C vollständig gespalten).

Aktivitätsbestimmung

In eine Mischung aus 5 µl Inkubationspuffer, enthaltend 0,03 M Tris HCl pH 8,0/45°C, 1,25 M NaCl, 0,07 M MgCL₂, 0,035 M 2-Merkaptoethanol und 0,05 Vol.-% Triton X 100, werden 14 µl H₂O und 5 µl pBR 322-DNA (4 oD/ml) sowie 1 µl Mae I Lösung (1 U/µl) gegeben. Die Lösung wird 1 Stunde bei 45°C gehalten, auf Eis abgekühlt und mit 5 µl kalter Stoplösung, enthaltend 7 M Harnstoff, 20 Gew.-/V-% Saccharose, 0,06 M EDTA und 0,01 Gew.-/Vol.-% Bromphenolblau, versetzt. Dann wird auf 1%igem Agarosegel 3 bis 4 Stunden bei 100 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die erhaltenen Banden werden gegenüber geeigneten DNA-Längenstandards identifiziert.

Claims (6)

1. Typ II-Restriktionsdonuklease, gekennzeichnet durch die palindrome Erkennungssequenz und die durch den Pfeil definierte Spaltungsstelle.

2. Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsendonuklease des Anspruchs 1, dadurch gekennmzeichnet, daß man Methanococcus aeolicus DSM 2835 züchtet und das Enzym aus den Zellen durch übliche biochemische Aufreinigungsmethoden gewinnt, wobei in den jeweils erhaltenen Fraktionen das Vorhandensein des Enzyms anhand der Spaltung seiner Erkennungssequenz nachweisbar ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen aufschließt, den Extrakt mit Polyethylenimim bis auf eine Konzentration von 0,65% versetzt, Unlösliches abtrennt und die aus dem Überstand bis 60% Ammoniumsulfatsättigung ausfallende Fraktion gewinnt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Feinreinigung die Ammoniumsulfatfraktion einer Molekularsiebfraktionierung, einer Chromatographie über schwach basischen Anionenaustauscher, einer Chromatographie über schwach sauren Kationenaustauscher und einer Affinitätschromatographie unterzieht.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Affinitätschromatographie trägerfixiertes Heparin verwendet.

6. Verwendung der Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1 zur Erkennung und Spaltung der DNA-Sequenz 5′-CTAG-3′ bei Anwesenheit von Mg²⁺.