DE3512435C2 - - Google Patents
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- DE3512435C2 DE3512435C2 DE3512435A DE3512435A DE3512435C2 DE 3512435 C2 DE3512435 C2 DE 3512435C2 DE 3512435 A DE3512435 A DE 3512435A DE 3512435 A DE3512435 A DE 3512435A DE 3512435 C2 DE3512435 C2 DE 3512435C2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
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Description
Die Erfindung betrifft die neue Typ-II-Restriktionsendonuklease
Asp 718, ein Verfahren zu ihrer Gewinnung und
ihre Verwendung (vgl. die Patentansprüche).
Typ-II-Restriktionsendonukleasen sind Endodesoxyribonukleasen,
welche bestimmte DNA-Sequenzen zu erkennen und
an bestimmten Positionen zu spalten vermögen. Dabei
werden bestimmte Phosphodiesterbrücken in der Zielsequenz
hydrolysiert, und zwar in jedem Polynukleotidstrang
eine. Typ-II-Restriktionsendonukleasen sind daher
wertvoll für die Analyse von DNA-Molekülen.
Es sind zwar bereits für zahlreiche DNA-Sequenzen
spezifische Typ-II-Restriktionsendonukleasen bekannt,
jedoch besteht immer noch Bedarf an der Schaffung
weiterer Typ-II-Restriktionsendonukleasen, die DNA-Sequenzen
an solchen Positionen spalten, die bisher von
keiner der bekannten Restriktionsendonukleasen
gespalten werden. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe
zugrunde, eine neue Restriktionsendonuklease zur
Verfügung zu stellen, welche eine Sequenz spezifisch zu
erkennen und an einer neuen Position zu spalten vermag.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch eine
Restriktionsendonuklease, welche gekennzeichnet ist
durch die palindrome Erkennungssequenz
und die durch den Pfeil definierte Spaltungsstelle.
Die Spaltposition ist derart, daß 5′ überhängende
Einzelstrangenden entstehen. Dies ermöglicht eine
radioaktive Markierung der entstandenenen Fragmente am 5′-
Ende mit dem Enzym T4 Polynucleotidkinase als auch eine
am 3′-Ende mit Hilfe des Enzyms Klenow-Polymerase. Das
ist z. B. bei Sequenzierungsexperimenten von Vorteil.
Die erfindungsgemäße neue Typ-II-Restriktionsendonuklease,
die im folgenden als Asp 718 bezeichnet wird, besitzt
ein Temperaturoptimum zwischen 35 und 39°C und ein
pH-Optimum bei 8,5/37°C in Tris/HCl-Puffer. Weitere
optimale Reaktionsparameter sind 75 mmol/l NaCl,
6 mmol/l Mg2+, 6 mmol/l 2-Merkaptoethanol. Die Anwesenheit
von Mg2+ ist für die Aktivität des Enzyms notwendig.
Das Enzym wirkt, wie oben erwähnt, an palindromischen
Strukturen, es erkennt also eine selbstkomplementäre
Nukleinsäuresequenz, bei der der Komplementärstrang des
Doppelstranges die identische Sequenz in gegenläufiger
Richtung aufweist.
Die Erkennungssequenz und Schnittstelle läßt sich wie
folgt feststellen:
Die DNA des Virus SV40 (BRL) wird mit Hpa II durch
Spaltung an Position 282 linearisiert. Beide Stränge
dieser linearisierten DNA werden in zwei parallelen,
unterschiedlichen Reaktionen terminal markiert. Der (-)-
Strang wird am 5′-Ende an Position 284 mit gamma-[³²p]-
ATP und T4 Polynucleotidkinase phosphoryliert. In der
zweiten Reaktion wird der komplementäre (+)-Strang am
3′-Ende an Position 282 mit alpha-[³²p]-dCTP und
Klenow-Polymerase um ein Nucleotid verlängert. Der
markierte (+)-Strang endet daher an Position 283. Beide
unterschiedlich markierten DNA's werden anschließend
jeweils mit Bgl I an Position 5171 nachgespalten.
Aus den jeweils entstehenden 5′- und 3′-terminal
markierten Fragmenten (4892(5′)/4889(3′) und
351(5′)/354(3′); (Länge der Fragmente bezogen auf die
markierten Einzelstränge) wird das 351 bp (5′)- bzw. 354
bp (3′)-Fragment (Position 5176 bis 284(5′); Position
5172 bis 283(3′)) isoliert. Das 5′-markierte Fragment
wird sequenziert.
Zusätzlich wird jeweils ein Aliquot der isolierten 351
bp (5′)- bzw. 345 bp (3′)-Fragmente mit dem erfindungsgemäßen
Enzym gespalten und die Länge der 5′- bzw.
3′-markierten Einzelstränge in dem Sequenzgel durch
Vergleich mit der 5′-Sequenzleiter bestimmt. Dabei
ergibt sich auf dem 5′-terminal markierten (-)-Strang
die Spaltposition 234, auf dem 3′-terminal markierten
(+)-Strang die Spaltposition 230.
Die Längenbestimmung des 5′-markierten (-)-Einzelstranges
des Asp 718/Hpa-II-Fragments erfolgt folgendermaßen:
Der an Position 284 5′-markierte (-)-Einzelstrang läuft
identisch mit dem inneren, also 3′-ständigen "G" an
Position 234 der 5′-Sequenzleiter innerhalb der Erkennungssequenz
5′-GGTACC-3′. Der 5′-markierte Einzelstrang
endet deshalb mit dem Nucleotid G des (-)-Strangs an
Position 235 der Erkennungssequenz. Die Schnittstelle
von Asp 718 auf dem 5′-markierten (-)-Strang ist also
zwischen den Nucleotiden G an Position 234 und G an
Position 235.
Analog wird die Länge des komplementären 3′-markierten
(+)-Einzelstrangs des Asp 718/Hpa-II-Fragments bestimmt.
Der an Position 283 3′-markierte (+)-Einzelstrang läuft
identisch mit dem inneren, also 5′-ständigen "C" an
Position 231 der 5′-Sequenzleiter innerhalb der Erkennungssequenz
5′-GGTACC-3′. Der 3′-markierte Einzelstrang
endet deshalb mit dem Nucleotid G des (+)-Strangs an
Position 231 der Erkennungssequenz. Die Schnittstelle
von Asp 718 auf dem 3′-markierten (+)-Strang ist also
zwischen den Nucleotiden G an Position 230 und G an
Position 231.
Erfindungsgemäß wird Asp 718 gewonnen, indem man
Achromobacter species DSM 2969 züchtet und das Enzym
aus den Zellen gewinnt. Zur Gewinnung werden die
üblichen biochemischen Aufreinigungsmethoden verwendet,
wobei in den jeweils erhaltenen Fraktionen das
Vorhandensein des Enzyms anhand der Spaltung seiner
Erkennungssequenz leicht nachgewiesen werden kann. Als
Substrat eignet sich beispielsweise lambda-DNA. Die
erhaltenen DNA-Fragmente werden in Agarosegelen in den
für die Fragmentauftrennung üblichen Puffersystemen in
Gegenwart von Ethidiumbromid elektrophoretisch aufgetrennt.
Der für die Gewinnung des Enzyms verwendete Organismus
Achromobacter spec. DSM 2969 wächst aerob in Standardmedium
I, welches im Beispiel 1 näher beschrieben ist.
Der Organismus ist Gramm-negativ-Die Zellen sind kolloid
(0,5 bis 2,0 µm) und liegen gewöhnlich einzeln vor. Das
Temperaturoptimum ist zwischen 25 und 37°C. Die Verdoppelungszeit
beträgt ca. 1 Stunde.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens werden die Zellen aufgeschlossen, der
Extrakt wird mit Streptomycinsulfat bis zur vollständigen
Fällung versetzt, der Niederschlag wird abgetrennt
und der Überstand gewonnen.
Für den Aufschluß eignen sich die üblichen mechanischen
und chemischen Methoden, wie z. B. Hochdruckdispersion,
Ultraschall oder enzymatische Verdauung.
Die Feinreinigung des das neue Enzym enthaltenden
Streptomycinüberstandes kann zweckmäßig durch Affinitätschromatographie,
Molekularsiebfraktionierung und über
Kationenaustauscher erfolgen. Als Molekularsiebmaterial
hat sich das unter der Handelsbezeichnung Ultrogel ACA
34 handelsübliche Produkt, ein Acrylamid/Agarose-
Heteropolymerisat aus 3% Acrylamid und 4% Agarose,
bewährt.
Als Kationenaustauscher werden vorzugsweise Phosphatgruppen
enthaltende Substanzen, vorzugsweise Kohlehydrate,
beispielsweise Cellulosephosphat und dergleichen
verwendet. Für die Affinitätschromatographie hat sich
besonders trägerfixiertes Heparin bewährt, z. B.
Heparin-Sepharose CL 6 B.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Achromobacter species DSM 2969 wird in Standardmedium
I, welches unten näher beschrieben ist, bei 30°C 10
Stunden aerob wachsen gelassen und dann in spätlogarithmischer
Phase geerntet. 200 g so erhaltene Zellpaste
( 20 g Trockenmasse) werden in 500 ml Aufschlußpuffer
(40 mmol/l Tris/HCl, pH 7,6/4°C; 0,1 mmol/l
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure); 7 mmol/l 2-Merkaptoethanol
und 0,2 mmol/l PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid)
suspendiert.
Dann werden die Zellen durch Hochdruckdispersion in
einer vorgekühlten Druckzelle bei 1100 bar zweimal aufgeschlossen.
Die Aufschlußsuspension wird mit 10%iger Streptomycinsulfatlösung
bis zur vollständigen Fällung versetzt.
Nach 30 Minuten Stehenlassen bei 4°C wird der gebildete
Niederschlag 120 Minuten bei 27 300 g abzentrifugiert
und verworfen.
Das Standardmedium I hat folgende Zusammensetzung:
Medium: 1000 ml dest. H₂O
Spezialpepton15,6 g Hefeextrakt 2,8 g NaCl 5,6 g Glucose 1,0 g pH 7,4 bis 7,6.
Spezialpepton15,6 g Hefeextrakt 2,8 g NaCl 5,6 g Glucose 1,0 g pH 7,4 bis 7,6.
Fermentationsbedingungen:
150 l Chemak-Fermenter
100 l Arbeitsvolumen
Rührer 450 Upm
Luft 0,08 Vvm
Temperatur 30°C
Impfmenge 10%
150 l Chemak-Fermenter
100 l Arbeitsvolumen
Rührer 450 Upm
Luft 0,08 Vvm
Temperatur 30°C
Impfmenge 10%
Ausbeute 60 g Trockenmasse/100 l Kultur
Nach Beispiel 1 erhaltener Streptomycinüberstand wird
an einer mit TEMG-Puffer äqulibrierten Affinitäts-Chromatographiesäule
(Heparin-Sepharose CL 6 B/5 cm × 28 cm)
chromatographiert. Nach Waschen mit 4 Säulenvolumen
TEMG-Puffer wird das Enzym mit einem linearen TEMG-Gradienten
mit 0 bis 1 mol/NaCl eluiert. Das Enzym
eluiert in den Fraktionen 0,45 bis 0,6 mol/l NaCl. Die
aktiven Fraktionen werden vereinigt und mit festem
(NH₄)₂SO₄ auf eine Sättigung von 80% (w/v) ausgefällt.
Die Fällung bleibt für 70 Stunden bei 4°C stehen.
Der so erhaltene Niederschlag wird für 60 Minuten bei
27 300 g abzentrifugiert, mit TEMG-Puffer aufgenommen
und auf eine Ultragel AcA-34-Molekularsiebsäule von
2 × 100 cm gegeben. Diese Säule wird mit TEMG-Puffer +
0,5 mol/l NaCl eluiert und die Eluatfraktionen mit Asp
718 Aktivität werden vereint.
Die vereinten Fraktionen werden gegen TEMG-Puffer
dialysiert und an einer mit TEMG-Puffer equilibrierten
Kationaustauschersäule (Cellulosephosphat P11/3 × 10 cm)
chromatographiert. Nach Waschen mit 2 Säulenvolumen
TEMG-Puffer wird das Enzym mit einem linearen TEMG-Gradienten
von 0 bis 1 mol/l NaCl eluiert. Asp 718 eluiert
zwischen 0,4 und 0,6 mmol/l NaCl.
Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und gegen 20
mmol/l Tris/HCl-Puffer, pH 7,6/4°C; 0,1 mmol/l EDTA;
10 mmol/l 2-Merkaptoethanol; 100 mmol/l NaCl; 100 µg/l
RSA und 50% Glycerin dialysiert und bei -20°C aufbewahrt.
Aktivität etwa 5 MU Asp 718 (Aktivitätsdefinition: 1 U
= 1µg Lambda-DNA/Stunde bei 37°C vollständig gespalten).
Aktivitätsbestimmung:
In eine Mischung aus 5 µl Inkubationspuffer, enthaltend 0,03 mol/l Tris-HCl pH 8,5/37°C, 0,03 mol/l MgCl₂; 0,375 mol/l NaCl; 0,03 mol/l 2-Merkaptoethanol und 0,5 mg/ml RSA werden 14 µl H₂O und 5 µl Lambda-DNA (4 OD/ml sowie 1 µl Asp 718-Lösung (1 U/µl; Verdünnung mit Lagerpuffer) zugegeben.
Aktivitätsbestimmung:
In eine Mischung aus 5 µl Inkubationspuffer, enthaltend 0,03 mol/l Tris-HCl pH 8,5/37°C, 0,03 mol/l MgCl₂; 0,375 mol/l NaCl; 0,03 mol/l 2-Merkaptoethanol und 0,5 mg/ml RSA werden 14 µl H₂O und 5 µl Lambda-DNA (4 OD/ml sowie 1 µl Asp 718-Lösung (1 U/µl; Verdünnung mit Lagerpuffer) zugegeben.
Die Lösung wird 1 Stunde bei 37°C inkubiert, auf Eis
abgekühlt und mit 5 µl kalter Stoplösung, enthaltend 7
mol/l Harnstoff, 20 Gew.-/Vol.-% Saccharose, 0,06 mmol/l
EDTA und 0,01 Gew.-/Vol.-% Bromphenolblau versetzt. Von
dieser Mischung werden 10 µl entnommen und mit 20 µl
verdünnter Stop-Lösung (vorstehende Stoplösung 1 : 3 verdünnt
mit 0,02 mol/l EDTA) versetzt. Diese Lösung wird
für 20 Minuten bei 65°C erhitzt, auf Eis abgestoppt und
20 µl davon werden auf einem 0,6%igen Agorasegel in 16
Stunden bei 50 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die
erhaltenen Banden werden gegenüber geeigneten DNA-
Längenstandards identifiziert.
Claims (6)
1. Typ-II-Restriktionsendonuklease Asp 718,
gekennzeichnet durch
die palindrome Erkennungssequenz
und die durch den Pfeil definierte Spaltungsstelle.
2. Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsendonuklease
des Anspruchs 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Achromobacter species DSM 2969 züchtet und
das Enzym aus den Zellen durch übliche biochemische
Aufreinigungsmethoden gewinnt, wobei in den
jeweils erhaltenen Fraktionen das Vorhandensein
des Enzyms anhand der Spaltung seiner Erkennungssequenz
nachweisbar ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Zellen aufschließt, den Extrakt bis
zur Vollständigkeit der Fällung mit Streptomycinsulfat
versetzt, Unlösliches abtrennt und den
Überstand gewinnt.
4. Verfahren nach Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Feinreinigung des Streptomycinüberstand
einer Affinitätschromatographie, einer
Molekularsiebfraktionierung und einer Chromatographie
über schwach basischer Anionenaustauscher
unterzieht.
5. Verfahren nach Anspruch 4,
dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Affinitätschromatographie trägerfixiertes
Heparin verwendet.
6. Verwendung der Restriktionsendonuklease nach
Anspruch 1 zur Erkennung und Spaltung der DNA-Sequenz
- 5′-GGTACC-3′ - bei Anwesenheit von Mg2+.
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19853512435 DE3512435A1 (de) | 1984-06-13 | 1985-04-04 | Restriktionsendonuklease asp 718, ihre gewinnung und verwendung |
US06/742,800 US4746609A (en) | 1984-06-13 | 1985-06-10 | Restriction endonuclease cleaving palindromic DNA |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3421937 | 1984-06-13 | ||
DE19853512435 DE3512435A1 (de) | 1984-06-13 | 1985-04-04 | Restriktionsendonuklease asp 718, ihre gewinnung und verwendung |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE3512435A1 DE3512435A1 (de) | 1986-01-02 |
DE3512435C2 true DE3512435C2 (de) | 1987-06-04 |
Family
ID=25822078
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19853512435 Granted DE3512435A1 (de) | 1984-06-13 | 1985-04-04 | Restriktionsendonuklease asp 718, ihre gewinnung und verwendung |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4746609A (de) |
DE (1) | DE3512435A1 (de) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3826389A1 (de) * | 1987-09-09 | 1989-03-30 | Boehringer Mannheim Gmbh | Typ ii-restriktionsendonuklease ksp632i |
EP0336286A3 (de) * | 1988-04-02 | 1990-10-10 | Roche Diagnostics GmbH | Typ II-Restriktionsendonuklease Ksp I |
JPH02255086A (ja) * | 1989-03-29 | 1990-10-15 | Nisshin Seito Kk | 新規制限酵素及びその製造法 |
AU7145991A (en) * | 1989-12-22 | 1991-07-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Site-specific double stranded dna endonuclease |
US5391487A (en) * | 1993-08-13 | 1995-02-21 | Promega Corporation | Restriction endonuclease SgfI from Streptomyces griseoruber |
-
1985
- 1985-04-04 DE DE19853512435 patent/DE3512435A1/de active Granted
- 1985-06-10 US US06/742,800 patent/US4746609A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US4746609A (en) | 1988-05-24 |
DE3512435A1 (de) | 1986-01-02 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: ROCHE DIAGNOSTICS GMBH, 68305 MANNHEIM, DE |
|
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |