DE3512435C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die neue Typ-II-Restriktionsendonuklease Asp 718, ein Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung (vgl. die Patentansprüche).

Typ-II-Restriktionsendonukleasen sind Endodesoxyribonukleasen, welche bestimmte DNA-Sequenzen zu erkennen und an bestimmten Positionen zu spalten vermögen. Dabei werden bestimmte Phosphodiesterbrücken in der Zielsequenz hydrolysiert, und zwar in jedem Polynukleotidstrang eine. Typ-II-Restriktionsendonukleasen sind daher wertvoll für die Analyse von DNA-Molekülen.

Es sind zwar bereits für zahlreiche DNA-Sequenzen spezifische Typ-II-Restriktionsendonukleasen bekannt, jedoch besteht immer noch Bedarf an der Schaffung weiterer Typ-II-Restriktionsendonukleasen, die DNA-Sequenzen an solchen Positionen spalten, die bisher von keiner der bekannten Restriktionsendonukleasen gespalten werden. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine neue Restriktionsendonuklease zur Verfügung zu stellen, welche eine Sequenz spezifisch zu erkennen und an einer neuen Position zu spalten vermag.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch eine Restriktionsendonuklease, welche gekennzeichnet ist durch die palindrome Erkennungssequenz und die durch den Pfeil definierte Spaltungsstelle.

Die Spaltposition ist derart, daß 5′ überhängende Einzelstrangenden entstehen. Dies ermöglicht eine radioaktive Markierung der entstandenenen Fragmente am 5′- Ende mit dem Enzym T4 Polynucleotidkinase als auch eine am 3′-Ende mit Hilfe des Enzyms Klenow-Polymerase. Das ist z. B. bei Sequenzierungsexperimenten von Vorteil.

Die erfindungsgemäße neue Typ-II-Restriktionsendonuklease, die im folgenden als Asp 718 bezeichnet wird, besitzt ein Temperaturoptimum zwischen 35 und 39°C und ein pH-Optimum bei 8,5/37°C in Tris/HCl-Puffer. Weitere optimale Reaktionsparameter sind 75 mmol/l NaCl, 6 mmol/l Mg²⁺, 6 mmol/l 2-Merkaptoethanol. Die Anwesenheit von Mg²⁺ ist für die Aktivität des Enzyms notwendig.

Das Enzym wirkt, wie oben erwähnt, an palindromischen Strukturen, es erkennt also eine selbstkomplementäre Nukleinsäuresequenz, bei der der Komplementärstrang des Doppelstranges die identische Sequenz in gegenläufiger Richtung aufweist.

Die Erkennungssequenz und Schnittstelle läßt sich wie folgt feststellen:

Die DNA des Virus SV40 (BRL) wird mit Hpa II durch Spaltung an Position 282 linearisiert. Beide Stränge dieser linearisierten DNA werden in zwei parallelen, unterschiedlichen Reaktionen terminal markiert. Der (-)- Strang wird am 5′-Ende an Position 284 mit gamma-[³²p]- ATP und T4 Polynucleotidkinase phosphoryliert. In der zweiten Reaktion wird der komplementäre (+)-Strang am 3′-Ende an Position 282 mit alpha-[³²p]-dCTP und Klenow-Polymerase um ein Nucleotid verlängert. Der markierte (+)-Strang endet daher an Position 283. Beide unterschiedlich markierten DNA's werden anschließend jeweils mit Bgl I an Position 5171 nachgespalten.

Aus den jeweils entstehenden 5′- und 3′-terminal markierten Fragmenten (4892(5′)/4889(3′) und 351(5′)/354(3′); (Länge der Fragmente bezogen auf die markierten Einzelstränge) wird das 351 bp (5′)- bzw. 354 bp (3′)-Fragment (Position 5176 bis 284(5′); Position 5172 bis 283(3′)) isoliert. Das 5′-markierte Fragment wird sequenziert.

Zusätzlich wird jeweils ein Aliquot der isolierten 351 bp (5′)- bzw. 345 bp (3′)-Fragmente mit dem erfindungsgemäßen Enzym gespalten und die Länge der 5′- bzw. 3′-markierten Einzelstränge in dem Sequenzgel durch Vergleich mit der 5′-Sequenzleiter bestimmt. Dabei ergibt sich auf dem 5′-terminal markierten (-)-Strang die Spaltposition 234, auf dem 3′-terminal markierten (+)-Strang die Spaltposition 230.

Die Längenbestimmung des 5′-markierten (-)-Einzelstranges des Asp 718/Hpa-II-Fragments erfolgt folgendermaßen:

Der an Position 284 5′-markierte (-)-Einzelstrang läuft identisch mit dem inneren, also 3′-ständigen "G" an Position 234 der 5′-Sequenzleiter innerhalb der Erkennungssequenz 5′-GGTACC-3′. Der 5′-markierte Einzelstrang endet deshalb mit dem Nucleotid G des (-)-Strangs an Position 235 der Erkennungssequenz. Die Schnittstelle von Asp 718 auf dem 5′-markierten (-)-Strang ist also zwischen den Nucleotiden G an Position 234 und G an Position 235.

Analog wird die Länge des komplementären 3′-markierten (+)-Einzelstrangs des Asp 718/Hpa-II-Fragments bestimmt.

Der an Position 283 3′-markierte (+)-Einzelstrang läuft identisch mit dem inneren, also 5′-ständigen "C" an Position 231 der 5′-Sequenzleiter innerhalb der Erkennungssequenz 5′-GGTACC-3′. Der 3′-markierte Einzelstrang endet deshalb mit dem Nucleotid G des (+)-Strangs an Position 231 der Erkennungssequenz. Die Schnittstelle von Asp 718 auf dem 3′-markierten (+)-Strang ist also zwischen den Nucleotiden G an Position 230 und G an Position 231.

Erfindungsgemäß wird Asp 718 gewonnen, indem man Achromobacter species DSM 2969 züchtet und das Enzym aus den Zellen gewinnt. Zur Gewinnung werden die üblichen biochemischen Aufreinigungsmethoden verwendet, wobei in den jeweils erhaltenen Fraktionen das Vorhandensein des Enzyms anhand der Spaltung seiner Erkennungssequenz leicht nachgewiesen werden kann. Als Substrat eignet sich beispielsweise lambda-DNA. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden in Agarosegelen in den für die Fragmentauftrennung üblichen Puffersystemen in Gegenwart von Ethidiumbromid elektrophoretisch aufgetrennt.

Der für die Gewinnung des Enzyms verwendete Organismus Achromobacter spec. DSM 2969 wächst aerob in Standardmedium I, welches im Beispiel 1 näher beschrieben ist.

Der Organismus ist Gramm-negativ-Die Zellen sind kolloid (0,5 bis 2,0 µm) und liegen gewöhnlich einzeln vor. Das Temperaturoptimum ist zwischen 25 und 37°C. Die Verdoppelungszeit beträgt ca. 1 Stunde.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen aufgeschlossen, der Extrakt wird mit Streptomycinsulfat bis zur vollständigen Fällung versetzt, der Niederschlag wird abgetrennt und der Überstand gewonnen.

Für den Aufschluß eignen sich die üblichen mechanischen und chemischen Methoden, wie z. B. Hochdruckdispersion, Ultraschall oder enzymatische Verdauung.

Die Feinreinigung des das neue Enzym enthaltenden Streptomycinüberstandes kann zweckmäßig durch Affinitätschromatographie, Molekularsiebfraktionierung und über Kationenaustauscher erfolgen. Als Molekularsiebmaterial hat sich das unter der Handelsbezeichnung Ultrogel ACA 34 handelsübliche Produkt, ein Acrylamid/Agarose- Heteropolymerisat aus 3% Acrylamid und 4% Agarose, bewährt.

Als Kationenaustauscher werden vorzugsweise Phosphatgruppen enthaltende Substanzen, vorzugsweise Kohlehydrate, beispielsweise Cellulosephosphat und dergleichen verwendet. Für die Affinitätschromatographie hat sich besonders trägerfixiertes Heparin bewährt, z. B. Heparin-Sepharose CL 6 B.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Achromobacter species DSM 2969 wird in Standardmedium I, welches unten näher beschrieben ist, bei 30°C 10 Stunden aerob wachsen gelassen und dann in spätlogarithmischer Phase geerntet. 200 g so erhaltene Zellpaste ( 20 g Trockenmasse) werden in 500 ml Aufschlußpuffer (40 mmol/l Tris/HCl, pH 7,6/4°C; 0,1 mmol/l EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure); 7 mmol/l 2-Merkaptoethanol und 0,2 mmol/l PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid) suspendiert.

Dann werden die Zellen durch Hochdruckdispersion in einer vorgekühlten Druckzelle bei 1100 bar zweimal aufgeschlossen.

Die Aufschlußsuspension wird mit 10%iger Streptomycinsulfatlösung bis zur vollständigen Fällung versetzt. Nach 30 Minuten Stehenlassen bei 4°C wird der gebildete Niederschlag 120 Minuten bei 27 300 g abzentrifugiert und verworfen.

Das Standardmedium I hat folgende Zusammensetzung:

Medium:  1000 ml dest. H₂O
Spezialpepton15,6 g Hefeextrakt 2,8 g NaCl 5,6 g Glucose 1,0 g pH 7,4 bis 7,6.

Fermentationsbedingungen:
150 l Chemak-Fermenter
100 l Arbeitsvolumen
Rührer 450 Upm
Luft 0,08 Vvm
Temperatur 30°C
Impfmenge 10%

Ausbeute 60 g Trockenmasse/100 l Kultur

Beispiel 2

Nach Beispiel 1 erhaltener Streptomycinüberstand wird an einer mit TEMG-Puffer äqulibrierten Affinitäts-Chromatographiesäule (Heparin-Sepharose CL 6 B/5 cm × 28 cm) chromatographiert. Nach Waschen mit 4 Säulenvolumen TEMG-Puffer wird das Enzym mit einem linearen TEMG-Gradienten mit 0 bis 1 mol/NaCl eluiert. Das Enzym eluiert in den Fraktionen 0,45 bis 0,6 mol/l NaCl. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und mit festem (NH₄)₂SO₄ auf eine Sättigung von 80% (w/v) ausgefällt. Die Fällung bleibt für 70 Stunden bei 4°C stehen.

Der so erhaltene Niederschlag wird für 60 Minuten bei 27 300 g abzentrifugiert, mit TEMG-Puffer aufgenommen und auf eine Ultragel AcA-34-Molekularsiebsäule von 2 × 100 cm gegeben. Diese Säule wird mit TEMG-Puffer + 0,5 mol/l NaCl eluiert und die Eluatfraktionen mit Asp 718 Aktivität werden vereint.

Die vereinten Fraktionen werden gegen TEMG-Puffer dialysiert und an einer mit TEMG-Puffer equilibrierten Kationaustauschersäule (Cellulosephosphat P11/3 × 10 cm) chromatographiert. Nach Waschen mit 2 Säulenvolumen TEMG-Puffer wird das Enzym mit einem linearen TEMG-Gradienten von 0 bis 1 mol/l NaCl eluiert. Asp 718 eluiert zwischen 0,4 und 0,6 mmol/l NaCl.

Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und gegen 20 mmol/l Tris/HCl-Puffer, pH 7,6/4°C; 0,1 mmol/l EDTA; 10 mmol/l 2-Merkaptoethanol; 100 mmol/l NaCl; 100 µg/l RSA und 50% Glycerin dialysiert und bei -20°C aufbewahrt.

Aktivität etwa 5 MU Asp 718 (Aktivitätsdefinition: 1 U = 1µg Lambda-DNA/Stunde bei 37°C vollständig gespalten).
Aktivitätsbestimmung:
In eine Mischung aus 5 µl Inkubationspuffer, enthaltend 0,03 mol/l Tris-HCl pH 8,5/37°C, 0,03 mol/l MgCl₂; 0,375 mol/l NaCl; 0,03 mol/l 2-Merkaptoethanol und 0,5 mg/ml RSA werden 14 µl H₂O und 5 µl Lambda-DNA (4 OD/ml sowie 1 µl Asp 718-Lösung (1 U/µl; Verdünnung mit Lagerpuffer) zugegeben.

Die Lösung wird 1 Stunde bei 37°C inkubiert, auf Eis abgekühlt und mit 5 µl kalter Stoplösung, enthaltend 7 mol/l Harnstoff, 20 Gew.-/Vol.-% Saccharose, 0,06 mmol/l EDTA und 0,01 Gew.-/Vol.-% Bromphenolblau versetzt. Von dieser Mischung werden 10 µl entnommen und mit 20 µl verdünnter Stop-Lösung (vorstehende Stoplösung 1 : 3 verdünnt mit 0,02 mol/l EDTA) versetzt. Diese Lösung wird für 20 Minuten bei 65°C erhitzt, auf Eis abgestoppt und 20 µl davon werden auf einem 0,6%igen Agorasegel in 16 Stunden bei 50 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die erhaltenen Banden werden gegenüber geeigneten DNA- Längenstandards identifiziert.

Claims (6)

1. Typ-II-Restriktionsendonuklease Asp 718, gekennzeichnet durch die palindrome Erkennungssequenz und die durch den Pfeil definierte Spaltungsstelle.

2. Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsendonuklease des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Achromobacter species DSM 2969 züchtet und das Enzym aus den Zellen durch übliche biochemische Aufreinigungsmethoden gewinnt, wobei in den jeweils erhaltenen Fraktionen das Vorhandensein des Enzyms anhand der Spaltung seiner Erkennungssequenz nachweisbar ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen aufschließt, den Extrakt bis zur Vollständigkeit der Fällung mit Streptomycinsulfat versetzt, Unlösliches abtrennt und den Überstand gewinnt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Feinreinigung des Streptomycinüberstand einer Affinitätschromatographie, einer Molekularsiebfraktionierung und einer Chromatographie über schwach basischer Anionenaustauscher unterzieht.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Affinitätschromatographie trägerfixiertes Heparin verwendet.

6. Verwendung der Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1 zur Erkennung und Spaltung der DNA-Sequenz - 5′-GGTACC-3′ - bei Anwesenheit von Mg²⁺.