DE2645548B2

DE2645548B2 - Endonucleasen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2645548B2
Application number: DE2645548A
Authority: DE
Inventors: Tadahiko Tokio Ando; Takehiko Wako Saitama Shibata
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1975-10-08
Filing date: 1976-10-08
Publication date: 1978-08-24
Also published as: US4080261A; DK454976A; DK145700B; DK145700C; DE2645548C3; JPS5247980A; DE2645548A1; JPS5444756B2

Description

Desoxyribonucleinsäure (DNA) zersetzende Enzyme (DNasen) sind an wichtigen Lebensvorgängen beteiligt, beispielsweise am Stoffwechsel, an der Zersetzung, Synthese und Substitution von DNA. Sie werden je nach ihrer Funktion grob in Exonucleasen und Endonucleasen eingeteilt Enzyme der erstgenannten Art wirken auf das Ende der Polynucleotidkette des DNA-Moleküls ein und bewirken nach und nach eine Freisetzung von Nucleotiden. Enzyme der letztgenannten Art bilden DNA-Bruchstücke oder Oligonucleotide, indem sie die Phosphodiesterbildung im DNA-Molekül spalten.

In den letzten Jahren wurden bei der Untersuchung jj von Endonucleasen große Fortschritte erzielt. Neben zahlreichen Enzymen mit biologisch wichtigen Funktionen wurde einer speziellen Gruppe auf Grund ihrer enzymatisch-chemischen Eigenschaften besondere Aufmerksamkeit geschenkt. Diese Enzyme, sogenannte »Restriktionsnucleasen« weisen eine hohe Spezifität für bestimmte Nucleotidfolgen in der DNA auf und sind in ihrer Wirksamkeit von natürlichen oder künstlichen strukturellen Veränderungen (Modifikationen) an der DNA abhängig. Die Restriktionsnucleasen spielen eine wichtige Rolle bei der Untersuchung der Struktur und Funktion von DNA, wie auch beim molekularen Klonieren vonJDNA-Sequenzen unterschiedlicher Herkunft.

Aufgrund umfangreicher Untersuchungen wurden Verfahren zur Herstellung von Enzymen aus Kulturen von Aspergillus oryzae entwickelt. Diese Enzyme wirken nicht auf doppelstrangige DNA, sondern zersetzen spezifisch einstrangige DNA; vgl. JA-PS 5 93 368. Aus der JA-PS 6 21 205 ist ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen aus dem Pilz Aspergillus oryzae bekannt, die bevorzugt Purin-Purin-Bindungen zersetzen. Die JA-PS 7 64 919 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen, die eine begrenzte Anzahl von einstrangigen Unterbrechungsstellen in bo doppelstrangige DNA einführen. Diese Enzyme werden aus mit Bakteriophagen infizierten Escherichia coli erhalten. Ferner ist ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das RNA zu Nucleosid-2,3-cylo-phosphat hydrolysiert, aus Escherichia coli, das durch Bakterio- t>5 phagen infiziert oder induziert ist, bekannt (vgl. japanische Patentanmeldung 78 869/1972 und japanische Patentveröffentlichung 35 577/1974). Aus der japanischen Patentanmeldung 114 131/1973, der japanischen Patentveröffentlichung 64 484/1975 und der DE-OS 24 48 343 ist ein Verfahren zur Hersteilung von Enzymen bekannt, die bevorzugte Guanin-Guanin-Bindungen im DNA-Molekül spalten.

Diese Enzyme werden aus Kulturflüssigkeiten von alkalophilen Bakterien gewonnen. Schließlich ist ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen bekannt, die spezifisch die RNA-Anteile von DNA-RNA-Hybriden zersetzen. Dieses Enzym wird aus Zellen von Bacillus subtilis gewonnen (vgl. japanische Patentanmeldung 1 27 276/1974).

Im Verlauf der Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung führten, wurde eine Reihe von durch verschiedene Mikroorganismen gebildeten neuen Enzymen untersucht. Dabei wurden Enzyme isoliert, die das DNA-Molekül an spezifischen Stellen erkennen und — in Abhängigkeit von der vorhandenen Modifikation — spalten, sogenannte »Restriktionsnucleasen« (Endonucleasen R). Diese Enzyme werden aus Zellen von aeroben, Sporen bildenden Mikroorganismen der Gattung Bacillus, wie Bacillus amyloliquefaciens und Bacillus subtilis, gewonnen. Diese Enzyme sind in der Lage, DNA-Fragmente von bestimmter Größe zu bilden.

Gegenstand der Erfindung sind somit die Endonucleasen R Bam N I₁ Bam N II und Bam N III, die Desoxyribonucleinsäuren an spezifischen Stellen erkennen und die Phosphodiesterbindung unter Bildung von Nucleinsäurebruchstücken mit einem bestimmten Molekulargewicht spalten, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem zellfreien Extrakt der Mikroorganismen der Gattung Bacillus IAM 1522 (Endo. R Bam NI, N II, NIII), oder ATCC 23 845 (Endo. R Bam N I, N II) erhalten worden sind.

Die Zeichnung zeigt eine Photographie mit den Ergebnissen einer Agarose-Gelelektrophorese von DNA, die mit den erfindungsgemäßen Enzymen, Endo. R Bam N I, Endo. R Bam N II und Endo. R Bam N III erhalten worden sind.

Die einzelnen Bezugszeichen in der Figur haben folgende Bedeutung:

1 Phagen-A-DNA, behandelt mit Endo. R EcoRl (Kontrolle),

2 unbehandelte Phagen-A-DNA,

3 Phagen-A-DNA, behandelt mit Endo. R Bam N I,

4 Λ · H I, behandelt mit Endo. R Bam N I,

5 unbehandelte Phage Φ 105C. 168DN A (Kontrolle),

6 Phage Φ 105C.N DNA, behandelt mit Endo. R Bam. N II+ N III,

7 Phage Φ 105C. HDNA (die durch Endo. R Bam. N II nicht gespalten werden kann), behandelt mit Endo. R Bam N II + N III,

8 Phage ΦΐΟ5ϋ. 168 DNA, behandelt mit Endo. R Bam N II+ N III,

9 Phagen-A-DNA, behandelt mit .Endo. R Eco Rl (Kontrolle),

IO unbehandelte Phagen-A-DNA,
11,12 Phagen-Ä-DNA, behandelt mit Endo. R BamNII + NIII,

13 Phagen-A-DNA, behandelt mit Endo. R Eco Rl (Kontrolle),

14 unbehandelte λ dv 1 DNA,

15 Advl DNA, behandelt mit Endo. R BamNII + NIII,

16 unbehandelte CoI EI DNA,

17 CoIEIDNA, behandelt mit Endo.R Bam N II- + NIII,

18 unbehandelte SV40 DNA,

19 SV40DNA, behandelt mit Endo.R Bam N II+ N III,

20 Phagen-A-DNA, behandelt mit Endo. R Eco R 1 (Kontrolle),

21 unbehandelte Phagen-SPPI. 168-DNA,

22 Phagen-SPPI. 168-DNA, behandelt mit Endo. R BamNII + NIII,

23 Phag.3n-A-DNA, behandelt mit Endo. R Eco Rl (Kontrolle).

Bacillus subtilis ist ohne Einschränkungen beim Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo (1-1, Yagoi, Bunkyoko, Tokyo, Japan) unter der Hinterlegungsnummer IAM 1522 hinterlegt worden; vgl. JPCC Catalogue of Culture (1966), S. 41. Dieser Mikroorganismenstamm ist Dritten jederzeit frei zugänglich. Bacillus amyloliquefaciens ist bei der American Type Culture Collection (ATTCC, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852) mit der Hinterlegungsnummer 23 845 hinterlegt worden. Aus diesem Stamm können die Endonucleasen R Bam N I und R Bam N II isoliert werden. Die Hinterlegung bei der ATCC erfolgte ohne Einschränkungen. Der hinterlegte Stamm ist für das Publikum frei zugänglich. Die Freigabe erfolgte am 8. September 1976.

Die Anmelderin wird die Hinterlegung der Stämme IAM 1522 und ATCC 23 845 in dieser uneingeschränkten Form bis zum Ende der Dauer eines auf diese Anmeldung eventuell erteilten Patents aufrechterhalten.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen lassen sich nach allgemein üblichen Verfahren züchten, beispielsweise durch Überimpfen der Stämme auf ein Nährmedium mit einem Gehalt an Aminosäuren, Caseinhydrolysat, Glucose, Phosphat, Sulfat und dergl. Die Züchtung kann bei etwa 30 bis 37° C unter Belüften und Rühren durchgeführt werden.

Nachstehend sind spezielle Beispiele für derartige Nährmedien angegeben:

CI-Medium	pro 10 Liter
KH₂PO₄	60 g
K₂HPO₄	140 g
Na-Citrat · 2 H₂O	10g
(NHt)₂SO₄	20 g
Arginin	2g
Casaminosäure	2g
Glucose	50 g
MgSO₄	2g
Tryptophan	0,25 g
Nährmedium
Rindfleischextrakt	1,5 g
Hefeextrakt	1,5 g
Pepton	5g
Dextrose	ig
Natriumchlorid	3,5 g
Dikaliumphosphat	3,68 g

len gesammelt, vorzugsweise während ihrer logarithmischen Phase und zu Beginn der stationären Phase. Die Zellen selbst oder der durch Behandeln der Zellen mit Lysozym erhaltene Protoplast wird mit Ultraschall zerkleinert. Durch Zentrifugieren wird ein zellfreier Extrakt gewonnen. Der erhaltene zellfreie Extrakt wird mit Streptomycinsulfat und zur Fällung mit Ammoniumsulfat behandelt, der Gelfiltration unter Verwendung von Ultragel ACA 44 oder Sephadex G-100, der

iü lonenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose oder Phosphocellulose unterworfen oder nach einem kombinierten Verfahren behandelt Man erhält schließlich drei Arten von neuen Endonucleasen, die DNA zersetzen. Diese Enzyme werden mit »Endo. R Bam N I«, »Endo. R Bam N II« und »Endo. R Bam N III« abgekürzt Demgemäß lassen sich die erfindungsgemäßen Enzyme herstellen, indem man einen nach Züchtung der Mikroorganismen während ihrer logarithmischen und stationären Phase erhaltenen zellfreien Extrakt der Behandlung mit Streptomycin, der Fällung mit Ammoniumsulfat, der lonenaustauschchromatographie, der Gelfiltration bzw. einer Kombination dieser Verfahren unterwirft
Die aktivsten Enzyme erhält man, wenn die Mikroorganismen während der logarithmischen Phase und zu Beginn der stationären Phase gewonnen werden. Die auf diese Weise erhaltenen Enzyme weisen die folgenden physikochemischen Eigenschaften auf:

(1) Aktivität und Substratspezifität

DNA von folgenden Phagen wird hergestellt und als Substrat-DNA für enzymatische Reaktionen verwendet:

Monokaliumphosphat 1,32 g

Zur Herstellung des Nährmediums werden 17,5 g des Gemisches in 1 I destilliertem Wasser gelöst.

Das Wachstum der Mikroorganismen wird gemessen, indem man die Gärflüssigkeit in eine Küvette bringt und die Durchlässigkeit bei 660 ΐημ ermittelt

Erfindungsgemäß werden die Mikroroganismenzel-

35	DNA	Vermehrung in: (Träger des
		Modifikationsmusters von:)
	a) Bakteriophagen
	Φ 105 CN.	Bacillus subtilis (JAM 1522)
40	Φ 105 CH.	Bacillus subtilis (JAM 1521,
		ATCC 23 845) auch als Bacillus
		amyloliquefaciens H bezeichnet
	Φ 105 Cl 68	Bacillus subtilis Marburg 168
		(ATCC 6051)
45	SPPI. 168	Bacillus subtilis Marburg 168
		(ATCC 6051)
	Φ 29	HICC 6051 oder JAM 1521
	Μ2	ATCC 6051
	Φ NR₂	Bacillus megaterium 203
50	Τ7	Escherichia coli B
	λ	Escherichia coli K 12
	λ ■ HI	Modifikationsmuster von
		ATCC 23 845
	b) Plasmide \
55	Adv I [	Escherichia coli
	Col EI I
	c) Tumorvirus
	Ternocer Simian
bO	Virus 40
	(SV 40)

Der Ausdruck Endo. R ist eine Abkürzung für b5 Endonuclease R.

Nach der enzymatischen Reaktion werden die Größe der gespaltenen Substrat-DNA und die Anzahl der Spaltungsstellen durch Agarose Gelelektrophorese

bestimmt. Wie sich aus den Abbildungen ergibt, wird das DNA-Substratmolekül durch Endo. R Bam N I, Endo. R Bam N II und Endo. R Bam N III in Bruchstücke

Tabelle I

bestimmter Größe gespalten. Wie sich aus Tabelle 1 ergibt, weisen die vorerwähnten drei Enzyme eine ausgeprägte Substratspezfität auf.

Substrat-DNA	Anzahl der	gespaltenen Stellen	N II	Endo. R Bam
	Endo. R Bam Endo. R Barn	0	N III
	N I	9	0
Bacillus-Phage Φ 105 CN.	0	0	etwa 7
Bacillus-Phage Φ 105 C-168	0	0	etwa 7
Bacillus-Phage Φ 105 CH.	0	0	0
Bacillus-Phage Φ 29	0	—	0
Bacillus-Phage M2	0	etwa 15	—
Bacillus-Phage Φ NR₂	0	etwa 10-15
Coli-Phage λ	5	3
Coli-Phage T7	0	2 (oder 3)
Bacillus-Phage SPPI	0	3
λ dv I·)	1	>4
CoI EI*)	0
SV 40·*)	1

λ dv I, CoI EI = Plasmid (zellulärer »intrinsic factor« von Escherichia coli) SV 40=Tumorvirus (Simian Virus 40)

Endo. R Barn N I wirkt nicht auf Φ 105 C N., Φ 105 H, Φ 105-168, Φ 29, M₂, SPPI, T 7, Col E I, während es die DNA des Coli-Phagen λ spaltet, wobei pro DNA-Molekül 5 Spaltstellen auftreten. Ferner spaltet Endo. R Barn N I auch λ dv I und SV 40 jeweils in einer Stellung.

Endo. R Barn N II wirkt nicht auf DNA von Φ 105 C. N. und Φ 105 C. H., spaltet aber D'NA von Φ 105 C. 168 an 9 Stellen und DNA von T 7, λ, SPPI und Adv I an mehreren Stellen.

Endo. R Barn N III wirkt nicht auf DNA von Φ 105 CN, spaltet aber DNA von Φ 105 C. 168 und Φ 105 C. H. an etwa 7 Stellen. Ferner spaltet dieses Enzym die DNA von T 7, λ, SPPI, λ dv I₁ CoI EI und SV 40 an mehreren Stellen unter Bildung von speziellen DNA-Bruchstücken.

(2) pH-Optimum

Sämtliche drei Enzyme, nämlich Endo. R Barn N I₁ Endo. R Barn N II und Endo. R Barn N III weisen ein pH-Optimum im Bereich von 7,2 bis 8,3 auf.

(3) Temperaturbereich

20 bis 40° C, Temperaturoptimum bei 35 bis 37° C. (4) Verfahren zur Messung der Enzymaktivität:

Die enzymatische Aktivität wird gemessen, indem man die Enzymprobe zu einem Gemisch aus folgenden Bestandteilen in den angegebenen Konzentrationer gibt:
50 millimolarTris-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 7,5

jo 5 millimolar MgCl₂, 0,2 millimolar EDTA, 5 Millimolai 0-Mercaptoäthanol und 3,3 μg/ml DNA. Es werden 3C bis 300 μΐ einer Enzylreaktionslösung hergestellt. Diesf Lösung wird 50 Minuten bei 37° C inkubiert Da sicr nach der Umsetzung keine Bildung von säurelöslicherr

j5 Nucleotid beobachten läßt, wird die Segmentierung de; DNA-Substrats elektrophoretisch unter Verwendung von Agarosegel oder durch Zentrifugation mit einerr neutralen Saccharosegradienten bestimmt.

(5) Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung

Endo. R Bam N I wird durch 0,3 bis 10 millimolai Mg²⁺ aktiviert und durch mehr als 20 millimolar Mg²·· und mehr als 0,2 m NaCl gehemmt. Endo. R Barn N I wird durch 10 bis 20 millimolar Mg²⁺ aktiviert und durcr mehr als 02 m NaCl gehemmt. Endo. R Barn N I, Endo. F Barn N II und Endo. R Barn N III werden durch i millimolar EDTA merklich gehemmt.

Kleines der drei Enzyme benötigt einen Cofaktor, wi( ATP oder S-Adenosylmethionin.

(6) Reinigungsverfahren

Die Reinigung wird nach folgendem Schema vorge nommen:

Zellen Behandlung mit Lysozym

Ultraschallbehandlung Streptomycin-Behandlung

Ammoniumsulfat-Fällung (40 Gewichtsprozent gesättigte Lösung)

Gelfiltration (LKB AcA 44)

niederes Molekulargewicht

Chromatographie mit DEAE-Cellulose (0,05-0,1 m NaCl)

hohes Molekulargewicht

Chromatographie mit DEAE-Cellulose
(0,05-0,1 m NaCl) · (0,12-0,25 m NaCl)

Endo. R Bam N I

Native DNA-Chromatographie mit Cellulose
(0,2-0,3 m NaCl)

Endo. R Bam N I

(7) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht der erfindungsgemäßen Enzyme wird mit Hilfe von Gelfiltration bestimmt:

Molekulargewicht von Endo. R Bam NI: etwa 10 000-100 000.

Molekulargewicht von Endo. R Bam N II und NIII: etwa 100 000.

Wie vorstehend erläutert, sind die Enzyme der Erfindung in der Lage, DNA von spezifischen Organismen, wie Bacillus-Stämmen und Bakteriophagen, zu erkennen und Bindungen an bestimmten Stellen unter Bildung von DNA-Bruchstücken bestimmter Größe zu spalten. Die Enzyme der Erfindung mit zersetzender Wirkung auf Nucleinsäuren weisen eine hohe, bisher nicht bekannte Substratspezifität auf.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Der Stamm Bacillus subtilis IAM 1522 wird in 500 ml eines Hirn-Herz-Infusionsmediums 13 bid 15 Stunden bei 30⁰C unter Belüften und Rühren vorgezüchtet. Die erhaltene Vorkulturlösung wird in 20 Liter Nährmedium der folgenden Zusammensetzung suspendiert:

K₂HPO₄	120 g
KH₂PO₄	280 g
Natriumeitrat	20 g
Ammoniumsulfat	40 g
Argininchlorid	4g
Glucose	100g
MgSO₄	4g
Tryptophan	0,5 g
Casaminosäure (vitaminfrei)	4g

Nach 4 bis 6stündiger Züchtung bei 35⁰C unter Belüften und Rühren werden die Zellen während ihrer frühen stationären Phase gewonnen. Dazu wird die Gärflüssigkeit in einer kontinuierlichen Kühlzentrifuge zentrifugiert Man erhält etwa 32 g Zellen.

Die Zellen werden in 1 Liter PES-Puffer (0,12 im Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,2, 5 millimolar MgCl₂,0,1 millimolar EDTA, 171g Rohrzucker) der mit 0,3 g Hühnereiweiß-Lysozym versetzt ist, suspendiert und 30 bis 60 Minuten bei 37° C stehengelassen. Man

Endo. R Bam N II und III

Native DNA-Chromatographie mit Cellulose (0,35 m NaCl)

Endo. R Bam N II und III

erhält einen kugelförmigen Protoplasten. Etwa 16 g Protoplast werden durch Zentrifugieren gewonnen. Nach dem Einfrieren mit Hilfe von flüssigem Stickstoff oder Trockeneis/Aceton wird das Produkt in einem Kühlbad niederer Temperatur bei - 80° C gelagert.

4 g Protoplast werden in 15 ml 50 millimolarem Tris-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 7,5, der 0,1 millimolar an EDTA, 5 millimolar an MgCl₂ und 2 millimolar an 0-Mercaptoäthanol ist, suspendiert. Der Protoplast wird durch Ultraschallbehandlung (20 kHz, 30 Sekunden, 3mal) zerkleinert. Die zerkleinerte Masse wird 60 Minuten bei 80 000 g in einer Kühlzentrifuge behandelt Der nach dem Zentrifugieren erhaltene flüssige Überstand wird unter Rühren mit einer Streptomycinsulfatlösung versetzt, so daß insgesamt eine lprozentige Lösung entsteht. Nach weiterem lOminütigem Rühren wird der flüssige Überstand bei niedrigen Temperaturen (0 bis 5° C) abzentrifugiert Dieser Überstand wird sodann innerhalb von 30 Minuten mit so viel Ammoniumsulfat versetzt, daß eine 40 Prozent gesättigte Lösung entsteht. Diese Lösung wird weitere 15 Minuten gerührt. Der gebildete Niederschlag wird bei niedrigen Temperaturen abzentrifugiert. Der erhaltene flüssige Überstand wird innerhalb von 30 Minuten mit so viel Ammoniumsulfat versetzt, daß eine zu 60 Prozent gesättigte Lösung entsteht. Diese Lösung wird weitere 15 Minuten gerührt. Der Niederschlag wird in der Kühlzentrifuge abzentrifugiert, in 3 ml Tris-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 7,5 (D 8) suspendiert und gelöst. Dieser Puffer ist 0,1 millimolar an EDTA₁ 2 millimolar an MgCl₂ und 2 millimolar an ß-Mercaptoäthanol (Ammoniumsulfatfraktion). In dieser Fraktion sind drei aktive, DNA-zersetzende

bo Enzyme enthalten, nämlich Endo. R Bam N I, Endo. R Bam N II und Endo. R Bam N II.

Beispiel 2 (Reinigungsverfahren 1)

Die Ammoniumsulfatfraktion wird gegen den im Beispiel 1 erwähnten D8-Puffer dialysiert und anschließend an einer mit DEAE-Cellulose beschickten Säule

der Abmessungen 15 χ 200 mm, die vorher mit D8-Puffer gewaschen worden ist, absorbiert. Bei der Elution mit einem linearen Natriumchloridgradienten von 0 bis 0,4 m im gleichen Puffer werden Endo. R Bam N I in der Fraktion mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,05 bis 0,1 sowie Endo. R Bam N II und Endo. R Bam N III in der Fraktion mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,09 bis 0,2 m eluiert.

Beispiel 3
(Reinigungsverfahren 2)

Die gemäß Beispiel 1 erhaltene Ammoniumsulfatfraktion wird gegen D8-Puffer dialysiert und anschließend an einer mit Phosphocellulose Pll beschickten Säule der Abmessungen 15 χ 200 mm, die vorher mit der gleichen Pufferlösung gewaschen worden ist, absorbiert. Durch Elution mit einem linearen Natriumchloridgradienten von 0 bis 0,7 m im gleichen Puffer erhält man Endo. R Bam N I als aktive Komponente, die innerhalb eines weiten Bereichs eluiert wird.

Ferner werden Endo. R Bam N II und Endo. R Bam N III, die in der Natriumchloridfraktion von 0,3 bis 0,5 m eluiert werden, erhalten.

Beispiel 4
(Reinigungsverfahren 3)

Die gemäß Beispiel 1 erhaltene Ammoniumsulfatfraktion wird der Gelfiltration an Ultragel ACA-44 (Säule der Abmessungen 20 χ 400 mm) unter Verwendung des D8-Puffers als Elutionsmittel unterzogen. Endo. R Bam N II und Endo. R Bam III werden zunächst eluiert. Nachdem das lV2-bis 2fache des Säulenvolumens an Elutionsmittel durchgelaufen ist, wird Endo. R Barn N I als getrennte Fraktion eluiert.

Beispiel 5
(Reinigungsverfahren 4)

Es wird ein kombiniertes Trenn- und Reinigungsverfahren gemäß den in den Beispielen 2, 3 und 4 angegebenen Reinigungsverfahren 1, 2 und 3 angewendet.

Zunächst wird die gemäß Beispiel 1 erhaltene Ammoniumsulfatfraktion durch Gelfiltration gemäß Beispiel 4 fraktioniert. Endo. R Barn N II und Endo. R Barn NIII erscheinen in der durchlaufenden Flüssigkeit. Diese Fraktionen werden abgetrennt und gemäß Reinigungsverfahren 1 mit Hilfe einer Chromatographie an DeAe-Cellulose getrennt und eingeengt. Diese

ίο Produkte werden sodann gemäß Beispiel 3 (Reinigungsverfahren 2) an einer mit Phosphocellulose beschickten Säule absorbiert und davon eluiert.

Bei der vorerwähnten Gelfiltration wird anschließend die Endo. R Barn NI enthaltende Fraktion eluiert.

r, Dieses Enzym wird gemäß Beispiel 2 (Reinigungsverfahren 1) an einer mit DEAE-Cellulose beschickten Säule absorbiert und mit einem Natriumchloridgradienten eluiert. Endo. R Barn N I wird in der Fraktion mit einer Natriumchloridkonzentration von 0,06 bis 0,90 m eluiert

Beispiel 6
(Reinigungsverfahren 5)

Durch Reinigung gemäß dem Reinigungsverfahren 1 der Endo. R. Barn N I-Fraktion und der im Reinigungsverfahren 3 erhaltenen Fraktion mit einem Gehalt an Endo. R Barn II und III werden Endo. R Barn N I aus der Endo. R Barn N I-Fraktion sowie Endo. R Barn II und III aus der Endo. R Barn II und HI-Fraktion erhalten. Endo. R Barn N I wird gemäß Reinigungsverfahren 2 oder durch native DNA-Cellulose-Chromatographie weiter gereinigt.

Andererseits wird die gewonnene Endo. R Barn N II und III-Fraktion, die eine geringe Menge an Endo. R Barn N I enthält, zu reinem Endo. R Barn N II und III gemäß dem Reinigungsverfahren 1 gereinigt, wobei das enthaltene Endo. R Barn NI beseitigt wird. Die erhaltenen Enzyme Endo. R Barn N II und III werden gemäß Reinigungsverfahren 2 oder durch native DNA-Cellulose-Chromatographie weiter gereinigt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Endonucleasen mit den Bezeichnungen Endonuclease R Bam N I, Endonuclease R Bam N II und Endonuclease R Bam N IH₁ die Desoxyribonucleinsäuren an spezifischen Stellen erkennen und die Phosphodiesterbindung unter Bildung von Nucleinsäurebruchstücken mit einem bestimmten Molekulargewicht spalten, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem zellfreien Extrakt des Bacillus IAM 1522 oder ATCC 23 845 erhalten worden sind.

2. Verfahren zur Herstellung der Endonucleasen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus IAM 1522 oder ATCC 23 845 in einem Nährmedium züchtet, die Zellen gewinnt, daraus einen zellfreien Extrakt herstellt, diesen Extrakt fraktioniert und den fraktionierten Extrakt reinigt

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