DE3689993T2

DE3689993T2 - Vektor für Expression und Sekretion von Produkten von heterologen Genen in Bacillus Subtilis.

Info

Publication number: DE3689993T2
Application number: DE3689993T
Authority: DE
Inventors: Bue Marina Del; Guido Grandi; Antonio Mele; Salvatore Toma
Original assignee: Eniricerche SpA
Current assignee: Eni Tecnologie SpA
Priority date: 1985-07-10
Filing date: 1986-06-30
Publication date: 1994-11-24
Anticipated expiration: 2006-07-01
Also published as: EP0213085A3; EP0213085A2; IT1186750B; JP2540031B2; DE3689993D1; JPS62151185A; EP0213085B1; IT8521507A0; US5021340A; ATE109203T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Molekularbiologie und insbesondere auf einen Klonierungsvektor in Bacillus subtilis, auf rekombinante DNA-Moleküle, auf Bacillus subtilis-Stämme, die mit den genannten Molekülen transformiert worden sind, und auf Verfahren zur Expression von Sequenzen von heterologer DNA und zur Bildung und Sekretion von Proteinen, die durch die genannten Sequenzen von heterologer DNA codiert werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Verwendung eines Klonierungsvektors für die Expression von Sequenzen von heterologer DNA und die Bildung und Sekretion der Proteine, die codiert werden durch die genannten Sequenzen in Bacillus subtilis, auf Moleküle von rekombinanter DNA, die gebildet werden durch den Klonierungsvektor und sofort an einer Restriktionsstelle, die innerhalb des neutralen Protease-Gens vorliegt, geschnitten werden, und durch die Sequenz der heterologen DNA, die für das interessierende Protein codiert, auf die Bacillus subtilis-Stämme, die mit den genannten rekombinanten DNA- Molekülen transformiert worden sind und in der Lage sind, die Sequenz der heterologen DNA zu exprimieren und das durch die genannte Sequenz codierte Protein zu bilden und zu sekretieren, sowie auf Verfahren zur Expression, Bildung und Sekretion der interessierenden heterologen Proteine.
Der Klonierungsvektor, die rekombinanten DNA-Moleküle, die mit den genannten Molekülen transformierten Bacillus subtilis-Stämme und die erfindungsgemäßen Verfahren erlauben die Expression von Sequenzen von heterologer DNA und die Bildung und Sekretion von Proteinen, die durch die genannten Sequenzen codiert werden, in hohen Ausbeuten. Die auf diese Weise erhaltenen Proteine sind verwendbar auf dem Gebiet der Pharmazeutika und der Lebensmittel oder für die Herstellung von Produkten, die normalerweise durch chemische Synthese erhalten werden.
Die Fähigkeit Gram-negativer Bakterien, wie z. B. von Echerichia coli (E. coli), heterologe Gene zu exprimieren, ist bekannt.
Die Verwendung von E. coli als Wirt für die Bildung von heterologen Proteinen bringt jedoch zahlreiche Nachteile mit sich. E. coli ist ein pathogenes, Gram-negatives Bakterium, das normalerweise im menschlichen oder tierischen intestinal-Trakt lebt, und darüber hinaus bilden einige der genannten Stämme Endotoxine.
Die Fermentationsverfahren zur Herstellung von heterologen Proteinen, in denen transformierte E. coli-Zellen verwendet werden, muß in geschlossenen Systemen durchgeführt werden, um Kontaminationen und Infektionen zu vermeiden. Dadurch werden die Produktionskosten erhöht.
Darüber hinaus werden die durch E. coli synthetisierten Produkte innerhalb der Zelle zurückgehalten.
Daher ist es am Ende des Fermentationsverfahrens erforderlich, die Zellen zu zerbrechen oder zu lysieren, um die synthetisierten Produkte daraus zu gewinnen.
Eine solche Behandlung umfaßt nicht nur die Extraktion des gewünschten Produkts, sondern auch die Extraktion von unerwünschten Substanzen. Daher ist es erforderlich, Nachfolgeverfahren zur Trennung und Reinigung durchzuführen, um das interessierende Produkt in einer Form zu erhalten, die für Menschen oder Tiere verwendet werden kann.
Alle diese Nachteile, die E. coli aufweist, machen das Bacillus subtilis zu einem Wirt, der besonders geeignet ist für die Herstellung (Bildung) von heterologen Proteinen.
Bacillus subtilis ist nämlich ein nicht-pathogenes, Grampositives Bakterium und bildet keine Endotoxine.
Darüber hinaus können im Hinblick darauf, daß seine Zellen keinen periplasmatischen Hohlraum aufweisen, die synthetisierten Produkte direkt in das Kulturmedium sekretiert werden, aus dem sie mit geringeren Problemen der Kontamination und Reinigung gewonnen werden können.
Dennoch erfolgt trotz der zahlreichen Vorteile, die Bacillus subtilis aufweist, seine Verwendung als Wirt für die Bildung von heterologen Proteinen nur selten wegen des niedrigen Wirkungsgrades bei der Expression von heterologen Genen und auch wegen der geringen Ausbeuten, in denen die durch die genannten Gene codierten Proteine erhalten werden.
Obgleich die von anderen Species von Bacillus stammenden Gene in Bacillus subtilis exprimiert werden (vgl. A. Sloma et al., "Molecular cloning and nucleotide sequence of the type I β-lactamase gene from B.cereus" in "Nucl. Acids Res." II (1983), 4997-5004, und O. Gray et al. "Molecular cloning and expression of B. licheniformis β-lactamase gene in E. coli and Bacillus subtilis" in "J. Bacteriol", 145 (1981), 422-428) wird in der Tat nur über wenige Beispiele der Klonierung und Expression von heterologen Genen in der technischen Literatur berichtet (K. Hardy et al., "Production in Bacillus subtilis of Hepatitis B Core antigene and of major antigene of foot and mouth disease virus" in "Nature" 293 (1981), 481-483).
Einer der Gründe für diese beschränkte Verwendung ist vor allem das Fehlen von Klonierungsvektoren, welche die wirksame Expression von heterologen Genen und die hohe Produktivität von Proteinen, die durch die genannten heterologen Gene codiert werden, erlauben.
In EP-A-0 070 675 ist die Konstruktion von rekombinanten Plasmiden beschrieben, die Human-Calcitonin cDNA-Sequenzen enthalten.
In WO 83/04028 sind die Herstellung und Expression von Genen für Calcitonin beschrieben.
In dem Dokument Henner et al. "Mol. Biol. Microb. Differ., Proc. Int. Spore Conf.", September 1984 (Publikation 1985), ist die Verwendung eines neutralen Protease-Promotors nprR2 für die Expression des homologen Gens beschrieben, das für Protein in B. subtilis codiert.
In der italienischen Patentanmeldung Nr. 23 190-A/84, die der EP-A-0 179 025 entspricht, die ein Dokument gemäß Stand der Technik nach Artikel 54(3) EPC darstellt, ist das Hybrid-Plasmid pSM127 beschrieben, das in der Lage ist, bei der Einführung in Zellen von Bacillus subtilis SMS108 NRRL B-15898 die Expression und Sekretion von neutraler Protease in Konzentrationen, die 200 mg/l übersteigen, zu stimulieren.
Das genannte Hybrid-Plasmid, dessen Struktur (Kartierung) in der Fig. 1 dargestellt ist, wird gebildet durch das neutrale Protease-Gen und durch das Plasmid puB110, das die Replikation von pSM127 in Bacillus subtilis gewährleistet und das Gen enthält, das für die Resistenz gegenüber Kanamycin codiert.
Zellen von Bacillus subtilis SMS108, die das Hybrid-Plasmid pSM127 enthalten, wurden bei dem Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, USA, unter der Nr. NRRL B-15900 hinterlegt. In dem BcLI-Hind III-Fragment von pSM127 wurden nun 811 Basenpaare (bp) eines DNA-Abschnitts, der als nprR2 bezeichnet wird, identifiziert, der für die hohe Produktion von neutraler Protease verantwortlich ist und an dem 5'-Ende des neutralen Protease-Gens angeordnet ist.
Dementsprechend betrifft die Erfindung die Verwendung des Hybrid-Plasmids pSM127 als Klonierungsvektor von Bacillus subtilis für die Expression von Sequenzen von heterologer DNA und die Bildung und Sekretion von Proteinen, die durch die genannten Sequenzen der heterologen DNA codiert werden, in hohen Ausbeuten.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist in den Ansprüchen 1 bis 9 definiert.
Erfindungsgemäß werden rekombinante DNA-Moleküle gebildet durch den Klonierungsvektor pSM127 (der das Replikon von puB110, das mit Bacillus subtilis kompatibel ist, und das Gen, das für die Resistenz gegenüber Kanamycin codiert, enthält) und durch die Sequenz von heterologer DNA, die für Human-Calcitonin codiert, und wobei die genannte Sequenz von heterologer DNA an einer Restriktionsstelle, die an dem neutralen Protease-Gen pSM127 vorhanden ist, inseriert wird und unter der Kontrolle der Promotorbereiche, einer Erkennungsstelle der Ribosomen, nprR2 und einer Signalsequenz der neutralen Protease, steht. Erfindungsgemäß sind die Bacillus subtilis-Stämme mit den genannten rekombinanten DNA-Molekülen transformiert worden und sie sind in der Lage, die genannte Sequenz von heterologer DNA zu exprimieren und das Protein, das durch die genannten Sequenzen codiert wird, zu bilden und zu sekretieren. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des genannten heterologen Proteins, das umfaßt das Kultivieren eines mit den genannten rekombinanten DNA- Molekülen transformierten Bacillus subtilis-Stammes in einem geeigneten Kulturmedium.

Beschreibung der Figuren

Die Fig. 1 zeigt den Restriktions-Aufbau (Kartierung) des Plasmids pSM127, das durch pUB110 und durch das neutrale Protease-Gen gebildet wird.
Die Fig. 2A und 2B zeigen die Nucleotid-Sequenz des nprR2-Bereiches, der für die Überproduktion der neutralen Protease verantwortlich ist (Fig. 2A), und des gleichen Bereiches, der vor dem neutralen Protease-Gen in dem Bacillus subtilis-Stamm BGSC 1A1 vorhanden ist (Fig. 2B).
Die Fig. 3 zeigt die Konstruktion des Plasmids pSM153, das durch das CAT-Gen von pC194 und das Plasmid pSM127 gebildet wird.
Die Fig. 4 zeigt die zwei möglichen Rekombinationen zwischen dem Bakterien-Chromosom vom Bacillus subtilis BGSC 1A1 und dem Fragment von pSM153 mit 4700 Basenpaaren, welche das CAT-Gen und den nprR2-Bereich enthalten.
Die Fig. 5 zeigt die Struktur eines rekombinanten DNA-Moleküls, in welches das heterologe Gen an der BGL II-Restriktionsstelle von pSM127 inseriert ist.
Die Fig. 6 zeigt die Struktur eines rekombinanten DNA-Moleküls, in welches das heterologe Gen an der HindIII-Restriktionsstelle von pSM127 inseriert ist.
Die Fig. 7 zeigt die Struktur und den Restriktions-Aufbau (Kartierung) von pSM174, welches die synthetische DNA zusammen mit dem Calcitonin-Gen enthält.
Nachstehend sind die Definitionen der hier verwendeten Ausdrücke angegeben.
Die Expression - ist das Verfahren, nach dem ein Fragment der DNA oder ein Gen ein Protein bildet. Sie erfolgt nach einem Transkriptionsverfahren, d. h. durch Bildung von mRNA aus dem DNA-Fragment und durch ein Translationsverfahren, d. h. durch Bildung des Proteins aus mRNA.
Der Klonierungsvektor von Bacillus subtilis - ist ein Plasmid, das ein Replikon trägt, das die Replikation des Vektors innerhalb von Wirtszellen von Bacillus subtilis erlaubt und das eine oder mehr Restriktionsstellen aufweist, an denen der Vektor geschnitten werden kann, ohne seine wesentlichen biologischen Funktionen zu beeinträchtigen.
Der Vektor weist vorzugsweise einen Marker auf, der geeignet ist zur Identifizierung von Transformanden-Zellen, wie z. B. der Kanamycin-Resistenz oder der Chloramphenicol- Resistenz.
Das rekombinante DNA-Molekül - ist ein DNA-Molekül, das durch verschiedene Genome gebildet wird, die außerhalb der Zelle miteinander verbunden worden sind, und das die Fähigkeit hat, innerhalb der Wirtszellen aufrechterhalten zu werden.
Die Anwesenheit eines Bereiches, der für die Überproduktion der neutrale Protease verantwortlich ist, in dem Hybrid-Plasmid pSM127 und seine Anordnung innerhalb des BclI- Hind III-Fragments aus 811 Basenpaaren wurden durch Arbeiten auf die folgende Weise bestimmt.
Das Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Gen, das für die Resistenz gegenüber Chloramphenicol codiert, das in dem HpaII-MboI-Fragment von 1031 bp des Plasmids pC194 (BGSC 1E17) enthalten ist, wurde isoliert durch Behandeln des Plasmids pC194 mit dem HpaII-Restriktionsenzym und nachfolgendes Binden des auf diese Weise linearisierten Plasmids an das Fragment von 587bp von pE194, das erhalten wurde nach der Digestion des Plasmids pE194 (BGSC1E7) mit den TaqI- und MboI-Restriktionsenzymen.
Das lineare Molekül von pC194 kann an das TaqI-MboI-Fragment von pE194 in der Weise gebunden werden, daß ein lineares Molekül von 3497 bp gebildet wird, vorausgesetzt, daß das HpaII-kohäsive Ende von pC194 und das TaqI-kohäsive Ende von pE194 miteinander verbunden werden können.
Das genannte Molekül von 3497 bp wird auf diese Weise mit dem MboI-Restriktionsenzym behandelt und darauf folgt die Isolierung eines linearen MboI-MboI-Fragments von DNA von 1618 bp, das gebildet wird durch das MboI-Fragment von 1031 bp von pC194 und durch das TaqI-MboI-Fragment von 587 bp von pE194.
Das auf diese Weise erhaltene lineare Fragment von 1618 bp wird dann an das Hybrid-Plasmid pSM127 gebunden nach dem Schneiden des pSM127 mit dem BclI-Restriktionsenzym.
Man erhält auf diese Weise das Plasmid pSM153, das durch die DNA des pSM127 und durch diejenige des MboI-MboI-Fragments von 1618 bp gebildet wird. Das Plasmid pSM153 wird dann mit dem BamHI-Enzym geschnitten, welches zwei Fragmente erzeugt, eines von etwa 5000 bp, das die gesamte Sequenz von puB110 trägt, und ein anderes von etwa 4700 bp, welches das Gen, das für die neutrale Protease codiert, und das CAT-Gen, das für die Chloramphenicol-Resistenz codiert, enthält.
Das Fragment von 4700 bp wird dann verwendet zum Transformieren von Zellen von Bacillus subtilis BGSC 1A1, einem schlechten Produzenten für neutrale Protease, der gegenüber Chloramphenicol empfindlich ist, und Auswahl der erhaltenen transformierten Produkte in bezug auf die Resistenz gegenüber Chloramphenicol (Cm®).
Die Transformation von Bacillus subtilis BGSC1A1 findet nur statt, wenn eine Integration des genannten Fragments in dem Bakterien-Chromosom stattfindet.
Die Integration kann stattfinden, wenn in dem BamHI-Fragment von pSM153 der Bereich vorhanden ist, der homolog zu der Chromosomen-DNA ist, die aus dem neutralen Protease- Gen besteht.
Wie in Fig. 4 dargestellt, kann ein Doppel-"Crossing over" stattfinden zwischen der Chromosomen-DNA und der Plasmid- DNA in den Bereichen, die unterhalb und oberhalb des CAT- Gens angeordnet sind. Dies führt zu einer Insertion des CAT-Gens, das für die Resistenz gegenüber Cm codiert, in dem Chromosomen-Bereich und infolgedessen zur Gewinnung von Cm-resistenten Zellen von Bacillus subtilis BGSC1A1 (Cm®).
Zusätzlich zur Integration des CAT-Gens kann das Doppel-"Crossing over" zur Integration des nprR2-Bereiches führen, der die Überproduktion der neutralen Protease reguliert, wenn letztere überhaupt in dem Plasmid pSM127 vorhanden ist.
Aus diesem Grund ist der Bacillus subtilis-Stamm BGSC1A1 ein schwacher Produzent für neutrale Protease und die Integration in dem Chromosomen-Bereich des nprR2-Bereiches sollte die proteolytische Aktivität des genannten Stammes beträchtlich steigern.
Es wurde nämlich gefunden, daß 80% der genannten Cm® Bacillus subtilis-Stämme eine proteolytische enzymatische Aktivität aufwiesen, die 100-mal größer war als diejenige des Elternstammes BGSC1A1, wodurch die Anwesenheit des nprR2-Bereiches an dem pSM127 und die Korrelation zwischen dem genannten Bereich und der Überproduktion von neutraler Protease bestätigt wurde.
Die Fig. 2A zeigt die DNA-Sequenz des nprR2-Bereiches und die Fig. 2B zeigt diejenige des gleichen Bereiches der DNA, der vor dem neutralen Protease-Gen in dem BGSC1A1 Bacillus subtilis-Stamm vorhanden ist. Wie festgestellt werden kann, unterscheidet sich der nprR2-Bereich von demjenigen des Bacillus subtilis BGSC 1A1 darin, daß eine Deletion von 66 Basenpaaren in einem Abstand von 124 bp von dem Ursprung des Gens vorliegt.
Dementsprechend wird erfindungsgemäß das Hybrid-Plasmid pSM127 als Klonierungsvektor für die Expression von Sequenzen von heterologer DNA und für die Bildung von Proteinen, die durch die genannten Sequenzen in Bacillus subtilis codiert werden, in hohen Ausbeuten verwendet.
Das Hybrid-Plasmid pSM127 (Fig. 1) weist Restriktionsstellen innerhalb des neutralen Protease-Gens auf, an denen es geschnitten werden kann, ohne die nprR2-Kontrollsequenzen, den Promotor, die Erkennungsstelle für die Ribosomen (RBS) und die Signalsequenz (PRE), die für die Sekretion der neutralen Protease verantwortlich ist, zu beeinträchtigen.
Insbesondere sind die Restriktionsstellen, an denen der Klonierungsvektor geschnitten werden kann, HindIII, das in dem PRO-Bereich angeordnet ist, der oberhalb der Sequenz liegt, die für die reife neutrale Protease codiert, und die BglII- und EcoRI-Stellen, die in dem DNA-Bereich vorliegen, der für die reife neutrale Protease codiert.
Der auf diese Weise geschnittene Klonierungsvektor wird dann an die geeigneten Sequenzen der heterologen DNA in der Weise gebunden, daß ein fusioniertes Gen entsteht, d. h. ein Gen, das z. T. aus dem neutralen Protease-Gen und aus der Sequenz der heterologen DNA besteht, die in den Klonierungsvektor inseriert worden ist (Fig. 5 und Fig. 6).
Die rekombinanten DNA-Moleküle, die auf diese Weise erhalten werden, werden gebildet durch den Klonierungsvektor pSM127, der das Replikon von pUB110, das mit Bacillus subtilis kompatibel ist, und das Gen, das für die Resistenz gegenüber Kanamycin codiert, enthält, und durch das fusionierte Gen, dessen Expression durch die Anwesenheit des Promotors und der RDS-Sequenzen gewährleistet ist und wobei die Überproduktion und die Sekretion desselben gewährleistet werden durch die Anwesenheit der nprR2- bzw. PRE-Bereiche.
Die mit den genannten rekombinanten Molekülen transformierten Bacillus subtilis-Stämme sind in der Lage, die Sequenz von heterologer DNA zu exprimieren und die Proteine, die durch die genannten Sequenzen codiert werden, in hohen Ausbeuten zu bilden und zu sekretieren.
Der Klonierungsvektor, die rekombinanten DNA-Moleküle, die Bacillus subtilis-Wirtszellen und die erfindungsgemäßen Verfahren erlauben die Expression von Sequenzen von heterologer DNA und die Bildung und Sekretion der durch die genannten Sequenzen codierten Proteine, nämlich von Human- Calcitonin.
Erfindungsgemäß wird das Plasmid pSM127 zum Klonieren des Gens verwendet, das für Human-Calcitonin codiert.
Das Human-Calcitonin ist ein Hormon, das den Calciumgehalt im Blut kontrolliert (steuert). Dieses Hormon wird derzeit durch chemische Synthese hergestellt.
Erfindungsgemäß wird ein DNA-Fragment mit den folgenden Eigenschaften synthetisiert:
es enthält die Nucleotid-Sequenz, die für die 32 Aminosäuren codiert, die das Human-Hormon aufbauen,
es weist die Endgruppe auf, die seine Insertion in die BglII-Restriktionsstelle erlaubt, die in dem neutralen Protease-Gen auf dem Plasmid pSM127 vorhanden ist,
sie weist ein Unsinn-Triplett nach demjenigen, das für die terminale Aminosäure von Calcitonin codiert, auf,
die Nucleotid-Sequenz ist eine solche, daß dann, wenn einmal das DNA-Fragment in die BglII-Restriktionsstelle inseriert worden ist, die Calcitonin-Sequenz in der gleichen Leserichtung angeordnet ist wie die neutrale Protease.
Dies erlaubt die Erzielung der Synthese von Calcitonin, wobei kein Stopp-Codon vor dem Start-Triplett des Calcitonins selbst vorhanden ist.
Das synthetische DNA-Fragment wurde in das Plasmid pSM131 kloniert, dessen Struktur in der italienischen Patentanmeldung Nr. 19 960-A/85 angegeben ist, die charakterisiert ist durch die Anwesenheit einer einzelnen BglII-Restriktionsstelle, die dem Zweck dient, sie konservieren, sequenzieren und verstärken zu können.
Das Hybrid-Plasmid pSM110, das aufgebaut ist aus dem pSM131 und dem synthetischen DNA-Fragment, wurde dann gereinigt und die Sequenz des klonierten Fragments wurde nach dem Maxam und Gilbert-Verfahren ("Methods in Enzymology" (1980), Band 65, 499-560) verifiziert.
Das aus dem Plasmid pSM170 isolierte synthetische DNA- Fragment wurde anschließend an den Klonierungsvektor pSM127 gebunden nach einer partiellen Digestion des genannten Vektors mit dem BglII-Restriktions-Enzym in Gegenwart der Enzym T&sub4;-Ligase bei einer Temperatur von 14ºC und für einen Zeitraum von 16 h. Die auf diese Weise erhaltene Ligase-Mischung wurde zum Transformieren von Zellen von Bacillus subtilis SMS108 (NRRL B-15898) verwendet, die nach dem Verfahren von Contente und Dubnau ("Mol. Gen. Genet." 167 (1979), 251-258) kompetent gemacht wurden.
Die Transformanden wurden ausgewählt in bezug auf ihre Kanamycin-Resistenz (Km®) und das Fehlen einer caseinolytischen Aktivität, wobei die Zellen auf einem NB-Kulturmedium ausgebreitet wurden.
Die Plasmide wurden unter Anwendung des Schnellextraktionsverfahrens aus Kolonien von Bacillus subtilis SMS108(NRRL B-15898), Km® und solchen, die keinen Ring aufwiesen, extrahiert und analysiert zur Identifizierung derjenigen Plasmide, die das synthetische DNA-Fragment enthielten.
Die Analyse wurde durchgeführt durch Digestieren der Plasmide mit dem BglII-Restriktionsenzym und Abtrennen der bei der Digestions-Reaktion erhaltenen Fragmente auf einem 7,5 %igen Acrylamid-Gel.
Unter den Plasmiden, die untersucht wurden, wurde das Plasmid pSM174 identifiziert, das aus pSM127 und aus dem synthetischen DNA-Fragment von Calcitonin gebildet wurde, das so orientiert war, daß es die korrekte Leserichtung der Sequenz aufwies (Fig. 7).
Der Bacillus subtilis-Stamm SMS108 (pSM174) wurde bei der Hinterlegungsstelle "American Type Culture Center" am 26. Juni 1985 unter der Hinterlegungsnummer ATCC 53168 hinterlegt.
Die Fähigkeit des Bacillus subtilis-Stammes SMS108 (pSM174), das Human-Calcitonin zu exprimieren und zu sekretieren, wurde verifiziert durch Kultivieren des Stammes in einem VY-Kulturmedium (DIFCO) bei 37ºC und Analysieren eines Aliquots der überstehenden Flüssigkeit in verschiedenen Zeitabständen durch Anwendung einer radioimmunologischen Analyse (RIA).
Die folgenden Versuchsbeispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

Beispiel 1

A. Isolierung eines MboI-Fragments, welches das Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Gen von pC194 trägt

5 ug des Plasmids pC194 (BGSC 1E17) werden in 50 ul Reaktionsvolumen mit 5 Einheiten (U) HpaII-Restriktionsenzym (Boehringer-Mannheim) unter den vom Lieferanten vorgeschlagenen Bedingungen linearisiert.
Die Lösung wird dann mit dem gleichen Volumen an Phenol, das mit TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) gesättigt ist, behandelt und die Plasmid-DNA wird mit 1/10 Volumenteil 3M Natriumacetat und 2,5 Volumenteilen 95%igem Ethanol ausgefällt.
Die Reaktionsmischung wird bei 10 000 UpM 10 min lang zentrifugiert, die DNA wird entfernt, unter Vakuum getrocknet und dann in 100 ul einer Lösung, die 66 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit, 1 mM Adenosintriphosphat (ATP), 5 ug des Taql-MboI-Fragments von 587 Basenpaaren (bp) des Plasmids pE194 (BGSC 1E7) und 10 U T&sub4;-DNA-Ligase enthält, erneut suspendiert.
Die Ligase-Reaktion wird durchgeführt, indem man die Lösung 18 h lang bei einer Temperatur von 14ºC hält.
Das Fragment von 587 bp von pE194 (BGSC 1E7) wurde erhalten durch Digestieren von 20 ug des Plasmids mit 20 U der TaqI- und MboI-Enzyme, wobei entsprechend den Spezifikationen des Lieferanten (Boehringer-Mannheim) gearbeitet wurde, und anschließend gereinigt durch ein 5%iges Acrylamid-Gel, wie von Maxam und Gilber in "Methods in Enzymology", Band 65 (1980), 499-560, beschrieben.
Das lineare Molekül vom pC194 wird an das TaqI-MboI-Fragment von pE194 gebunden, wodurch ein lineares Molekül von 3497 bp gebildet wird, in dem die HpaII- und TaqI-kohäsiven Enden aneinander gebunden sein können.
Nach Beendigung der Ligase-Reaktion wird die Mischung mit Phenol behandelt und die DNA wird ausgefällt und entfernt wie vorstehend angegeben.
Die DNA wird dann erneut suspendiert in 50 ul einer Lösung, die 75 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl&sub2; und 1 mM Dithiothreit enthält, und mit 2 U des MboI-Restriktionsenzyms 1 h lang bei 37ºC behandelt.
Danach wird die DNA auf ein 5%iges Acrylamid-Gel aufgegeben und das lineare Fragment von 1618 bp wird eluiert, das gebildet wird aus dem MboI-Hpall-Fragment von 1031 bp von pC194 und dem TaqI-MboI-Fragment von 587 bp von pE194 (Fig. 3).

B. Insertion des linearen DNA-Fragments von 1618 bp in die BclI-Stelle des Plasmids pSM127 und Isolierung des Plasmids pSM153

0,5 ug des Plasmids pSM127, digestiert mit 1 U BclI- Restriktionsenzym nach den Vorschriften des Lieferanten (Boehringer-Mannheim) werden in 10 ul einer Lösung suspendiert, die 66 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit, 1 mM EDTA, 1 ug des DNA-Fragments, wie es in dem Abschnitt (A) erhalten worden war, und 1 u T&sub4;-DNA-Ligase enthält.
Die Reaktion wird 18 h lang bei 14ºC durchgeführt und nach der Inaktivierung des Enzyms für 10 min bei 65ºC wird die Mischung verwendet zum Transformieren von Zellen von Bacillus subtilis SMS108 (NRLLB 15 898), die gegenüber Chloramphenicol und Kanamycin empfindlich sind, die nach dem Verfahren von Contente und Dubnau in "Mol. Gen. Genet." 167 (1978), 251-258, kompetent gemacht worden sind.
Die Auswahl der Transformanden wird auf NB-Platten durchgeführt, deren Zusammensetzung in Beispiel 2 beschrieben ist, die 1% Casein und 5 ug Kanamycin bzw. Chloramphenicol enthalten.
Das Plasmid pSM153, dessen Struktur (Kartierung) in der Fig. 3 dargestellt ist, wird aus einer der Kolonien, die gegenüber Kanamycin resistent sind (Km®) und gegenüber Chloramphenicol resistent sind (Cm®), isoliert.
Das Plasmid pSM153 wird aus der DNA von pSM127 und aus dem MboI-MboI-Fragment von 1618 bp, welches das CAT-Gen enthält, gebildet.
Die Insertion des MboI-MboI-Fragments in der in pSM153 gefundenen Orientierung erlaubt die Rekonstruktion einer BclI-Stelle aus dem Teil, der benachbart zu dem neutralen Protease-Gen ist.
Auf die vier kohäsiven Basen der MboI-Stelle von pE194, GATC, folgt nämlich ein Adenin (A), wobei als Folge davon, wenn die BclI-kohäsiven Enden von pSM127 und MboI untereinander gepaart werden, daraus die Sequenz TGATCA stammt, die erkannt und geschnitten wird durch das BclI-Enzym: MboI-MboI-Fragment
Dies tritt nicht ein, wenn eine Verbindung zwischen der MboI-Stelle, die aus dem pC194 stammt, und der BclI-Stelle von pSM127 vorliegt.

C. Nachweis der Anwesenheit des nprR2-Bereiches an dem pSM153

1 ug des Plasmids pSM153 werden mit 1 U des BamHI-Restriktionsenzyms in 10 ul Reaktionsvolumen nach den Vorschriften des Lieferanten (Boehringer-Mannheim) digestiert.
Beim Schneiden mit BamHI erhält man zwei Fragmente, eines von etwa 5000 bp, welches die gesamte Sequenz von pUB110 trägt, und ein anderes von etwa 4700 bp, welches das neutrale Protease-Gen und das Fragment von 1618 bp, das für CAT codiert, aufweist.
Die auf diese Weise digestierte DNA wird verwendet zum Transformieren von Zellen von Bacillus subtilis BGSC 1A1, die wie von S. Contente und D. Dubnau beschrieben kompetent gemacht worden sind, und es werden die Transformanden für die Resistenz gegenüber Chloramphenicol (3 ug/ml NB- Medium) ausgewählt.
Die linearen DNA-Moleküle transformieren nicht die Bacillus subtilis-Zellen, wenn sie nicht in das Bakterien-Chromosom integriert sind.
Daher werden nur die Cm®-Kolonien selektioniert, in denen die Rekombination des BamHI-Fragments von 2350 bp, welches dem CAT-Gen vorausgeht und welches das neutrale Protease- Gen enthält, mit dem Fragment von etwa 750 bp, das dem CAT-Gen folgt (Fig. 4) mit den jeweiligen homologen Bereichen des Bakterien-Chromosoms stattgefunden hat.
Von den auf diese Weise erhaltenen Cm®-Kolonien weisen etwa 80% eine caseinolytische Aktivität auf, die größer ist als diejenige, die in dem Elternstamm Bacillus subtilis BGSC 1A1 zu finden ist.
Die caseinolytische Aktivität wird nachgewiesen auf NB- Platten, die Casein enthalten, durch Überprüfung der Größen der Ringe. Die Zunahme der enzymatischen Aktivität bestätigt die Anwesenheit des nprR2-Bereiches auf dem DNA- Fragment, das auf dem pSM153 und infolgedessen auf pSM127 vorhanden ist.

Beispiel 2

Klonierung des Human-Calcitonin-Gens und Herstellung von pSM174

0,1 ug des Plasmids pSM131 werden 1 h lang bei einer Temperatur von 37ºC digestiert in 20 ul einer Lösung von 20 mM Glycin-NaOH, 10 mM MgCl&sub2;, 7 mM β-Mercaptoethanol (pH 9,5) mit 0,1 Einheiten (U) BglII-Enzym (Boehringer-Mannheim).
Nach dem Inaktivierendes Enzyms für 10 min bei 65ºC werden 2 ul der Digestions-Mischung (10 ng der Plasmid-DNA) zu 18 ul einer Lösung von 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit und 1 mM ATP, die 10 ng des synthetischen Fragments von Calcitonin und 0,1 U der Enzym- T&sub4;-DNA-Ligase (Boehringer-Mannheim) enthält, zugegeben. Die Ligase-Reaktion wird 16 h lang bei 14ºC durchgeführt.
Nach dem Inaktivierung des Enzyms für 10 min bei 65ºC werden 10 ul der Ligase-Mischung verwendet zum Transformieren von Zellen von E. coli HB101, die nach dem von Mandel und Higa in "J. Mol. Biol.", 53, (1970), 159-162, beschriebenen Verfahren kompetent gemacht worden sind. Die Selektionierung der Transformanden wird auf Platten aus L-Agar (DIFCO) durchgeführt, die 15 ug/ml Tetracyclin (Tc) enthalten.
Aus einer Tc®-Kolonie erhält man das gereinigte Plasmid pSM170, welches das synthetische Calcitonin-Fragment enthält.
Die Sequenz des klonierten Fragments wird nachgewiesen durch Anwendung des Verfahrens von Maxam und Gilbert ("Methods in Enzymology", Band 65 (1980), 499-560).
30 ug des Plasmids pSMl70 werden mit 30 U des BglII-Enzyms in 150 ul einer Lösung, die enthält 20 mM Glycin-NaOH, 10 mM MgCl&sub2; und 7 mM β-Mercaptoethanol (pH 0,5), 1 h lang bei 37ºC digestiert. Die auf diese Weise erhaltenen Plasmid- DNA-Fragmente werden auf einem 7,5%igen Acrylamid-Gel getrennt und das DNA-Fragment aus 134 Basenpaaren, welches das synthetische Calcitonin-Fragment enthält, wird nach dem von Maxam und Gilbert ("Methods in Enzymology", Band 65 (1980), 526-527) beschriebenen Verfahren eluiert.
1 ug pSM127 werden mit 1 U BglII-Enzym in 50 ul einer Lösung, die 20 mM Glycin-NaOH, 10 mM MgCl&sub2;, 7 mM β-Mercaptoethanol (pH 9,5) enthält, 1 h lang bei 37ºC digestiert.
Nach der Zugabe von 120 ng des DNA-Fragments von 134 bp zu der Digestions-Mischung wird die DNA 20 min lang bei -80ºC durch Zugabe von 6 ul 3 M Natriumacetat, pH 5,5, und 150 ul 98%igem Ethanol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wird aus der Reaktionsmischung abgetrennt durch Zentrifugieren mit 10 000 UpM für 10 min, getrocknet und in 10 ul einer Lösung von 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 46,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit und 7 mM ATP, die 1 U T&sub4;-DNA-Ligase enthält, wieder suspendiert.
Nach 16-stündiger Inkubation der genannten Mischung bei 14ºC und Inaktivierung des Enzyms für 10 min bei 65ºC werden 5 ul der Ligase-Mischung verwendet zum Transformieren von Zellen von Bacillus subtilis SMS108 (NRRLB 15898), die nach dem Verfahren von Contente und Dubnau ("Mol. Gen. Genet." 167 (1979), 251-258) kompetent gemacht worden sind.
Die transformierten Zellen werden dann selektioniert in bezug auf ihre Kanamycin-Resistenz und das Fehlen einer caseinolytischen Aktivität auf Platten aus einem NB-Medium mit der folgenden Zusammensetzung:
DIFCO-Nährbrühe 8,00 g
MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,25 g
KCl 1,00 g
DIFCO-Agar 15,00 g
FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,28 g
MnCl&sub2; 1,25 mg
Ca(NO&sub3;)&sub2; 164,00 mg
Casein 10,00 g
Kanamycin 5 mg
H&sub2;O 1 l
Die Plasmide werden aus den Km®-Kolonien, die keinen Ring aufweisen, nach dem von Rodriguez und Tait (in "Recombinant DNA Techniques: an introduction" (1983), Addison-Wesley Publishing Company) beschriebenen Verfahren extrahiert. Die das synthetische Fragment enthaltenden Plasmide werden dann durch Digestieren mit dem BlgII-Enzym und Trennung der auf diese Weise erhaltenen Plasmid-DNA- Fragmente auf einem 7,5% Acrylamid-Gel identifiziert.
Die Orientierung des synthetischen Calcitonin-Fragments in pSM127 wird nachgewiesen durch Digestieren der Plasmide mit dem BstEII-Enzym, dessen Restriktionsstelle innerhalb des synthetischen Fragments angeordnet ist, und dem neutralen Protease-Gen.
Eine korrekte Orientierung sollte zwei Fragmente ergeben von etwa 7900 bp bzw. 560 bp, während die andere Orientierung ein Fragment von etwa 7900 bp und ein solches von 650 bp ergeben sollte.
Die Digestion der durch Schnellextraktion erhaltenen Plasmide wurde mit 1 U BstEII-Enzym in 30 ul Reaktionsvolumen und unter den vom Lieferanten (Boehringer-Mannheim) angegebenen Bedingungen durchgeführt. Die Plasmid-DNA-Fragmente werden auf einem 7,5%igen Acrylamid-Gel getrennt.
Es war somit möglich, das Plasmid pSM174 (Fig. 7) zu isolieren, welches das synthetische Calcitonin-Fragment enthält, das in pSM127 mit einer korrekten Orientierung inseriert worden ist.
Die Sequenzanalyse unter Anwendung des Verfahrens von Maxam und Gilbert bestätigt die Richtigkeit der erhaltenen Struktur.
Die Fähigkeit des Bacillus subtilis SMS108 (pSM174), Human-Calcitonin zu exprimieren und zu sekretieren, wurde nachgewiesen durch eine radioimmunologische Analyse (RIA) der überstehenden Flüssigkeit.
Stämme von Bacillus subtilis SMS108 (pSM174) und Bacillus subtilis SMS108 (NRRLB 15898) wurden in 250 ml-Erlenmeyer- Kolben, die jeweils 50 ml VY (DIFCO-Kalbs-Infusions-Brühe 25 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, H&sub2;O 1 l) enthielten, bei einer Temperatur von 37ºC kultiviert.
In Zeitabständen von 1 h wurden 1 ml Aliquote aus der Kulturbrühe entnommen und 10 min lang in einer Eppendorf-Zentrifuge, Modell 5414, bei 4ºC zentrifugiert.
Zu den auf diese Weise erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten wurden die Protease-Inhibitoren Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in einer Endkonzentration von 1 mM bzw. 5 mM zugegeben.
Für die RIA-Untersuchung des Calcitonins wurden aliquote Anteile der auf diese Weise behandelten überstehenden Flüssigkeiten verwendet, wobei das Kit und das Arbeitsverfahren des Lieferanten (Eiken Chemical Company, Ltd.) verwendet wurden.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Radioimmunologische Analyse, durchgeführt mit Antikörpern gegen Human-Calcitonin bei Kultur-Überständen, die zu verschiedenen Zeitpunkten aus den Bacillus subtilis-Stämmen SMS108 (pSM174) und SMS108 entnommen wurden Zeit

Claims

1. Rekombinantes DNA-Molekül, das verwendbar ist zum Exprimieren und Sekretieren von Human-Calcitonin als ein heterologes Protein in Bacillus subtilis, das umfaßt:

a) eine DNA-Sequenz, umfassend einen nprR2 regulierenden Bereich, einen Promotor, eine Ribosom-Bindungsstelle und eine Signal-Sekretions-Sequenz eines neutralen Protease- Gens, das aus dem in B. subtilis SMS-108 (HRRL-B-15900) vorhandenen Plasmid pSM127 isoliert wurde, wobei der genannte Bereich die in Fig. 2a angegebene Nucleotid-Sequenz aufweist; und

b) ein heterologes Gen, das für Human-Calcitonin codiert, wobei die Expression des genannten heterologen Gens unter der Kontrolle der genannten DNA-Sequenz steht.

2. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das heterologe Gen an der Restriktionsstelle BglII inseriert ist.

3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 2, das in Bacillus subtilis SMS108 (pSM174) mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 53168 vorliegt.

4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, das erhalten wurde nach einem Verfahren, das umfaßt

a') die Linearisierung eines in Bacillus subtilis mit der NRRL-Hinterlegungsnummer NRRL-B-15900 vorliegenden Plasmids pSM127 durch Digestion mit einem Restriktionsenzym, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus HindIII, BglII und EcoRI, und

b') das Binden des linearisierten Plasmids gemäß Stufe (a') in Gegenwart von T4 DNA-Ligase an das genannte heterologe Gen, das für Human-Calcitonin codiert, wobei das genannte heterologe Gen kohäsive Enden gegenüber denjenigen des linearisierten Plasmids, wie es in der Stufe (a') erhalten worden ist, aufweist.

5. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 4, wobei in der Stufe (a') das Plasmid pSM127 mit dem Restriktionsenzym BglII digestiert worden ist.

6. Bacillus subtilis-Mikroorganismus, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3 transformiert worden ist.

7. Mikroorganismus nach Anspruch 6, bei dem es sich um Bacillus subtilis SMS108 mit der NPRL-Hinterlegungsnummer NRRL-B-15898 handelt.

8. Verfahren zum Exprimieren und Sekretieren von Human- Calcitonin, das umfaßt:

a'') das Kultivieren eines transformierten Bacillus subtilis-Mikroorganismus nach Anspruch 6 in einem geeigneten Kulturmedium bei einer Temperatur von 10 bis 51ºC und

b'') das Isolieren des heterologen Proteins aus dem Kulturmedium und das Reinigen desselben.

9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Mikroorganismus in der Stufe (a'') Bacillus subtilis SMS108 (pSM174) mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 53168 ist.