JPH0564589A - 複合プラスミドベクターおよび形質転換微生物 - Google Patents
複合プラスミドベクターおよび形質転換微生物Info
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- JPH0564589A JPH0564589A JP4539392A JP4539392A JPH0564589A JP H0564589 A JPH0564589 A JP H0564589A JP 4539392 A JP4539392 A JP 4539392A JP 4539392 A JP4539392 A JP 4539392A JP H0564589 A JPH0564589 A JP H0564589A
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- rhodococcus
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- cell
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 Rhodococcus属細菌に属する菌株細胞内で複
製増殖可能なＤＮＡ領域、大腸菌細胞内で複製増殖可能
なプラスミドＤＮＡ領域および薬剤耐性遺伝子を含むＤ
ＮＡ領域を有してなる複合プラスミドベクターならびに
それらによる形質転換体。 【効果】 このプラスミドベクターはRhodococcus属ま
たはEscherichia属に属する細菌において工業的に利用
しうる微生物を育種、改良するために有用である。
製増殖可能なＤＮＡ領域、大腸菌細胞内で複製増殖可能
なプラスミドＤＮＡ領域および薬剤耐性遺伝子を含むＤ
ＮＡ領域を有してなる複合プラスミドベクターならびに
それらによる形質転換体。 【効果】 このプラスミドベクターはRhodococcus属ま
たはEscherichia属に属する細菌において工業的に利用
しうる微生物を育種、改良するために有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規な複合プラスミド
ベクターに関し、更に詳しくは、プラスミドpRC001, pR
C002, pRC003およびpRC004から選ばれるプラスミド由来
の、Rhodococcus属細菌内で複製可能なＤＮＡ領域と、
大腸菌内で複製可能なプラスミドＤＮＡ領域と、薬剤耐
性遺伝子を含むＤＮＡ領域とを含有する新規な複合プラ
スミドベクターおよびそれにより形質転換された微生物
に関する。
ベクターに関し、更に詳しくは、プラスミドpRC001, pR
C002, pRC003およびpRC004から選ばれるプラスミド由来
の、Rhodococcus属細菌内で複製可能なＤＮＡ領域と、
大腸菌内で複製可能なプラスミドＤＮＡ領域と、薬剤耐
性遺伝子を含むＤＮＡ領域とを含有する新規な複合プラ
スミドベクターおよびそれにより形質転換された微生物
に関する。
【０００２】
【従来の技術】Rhodococcus属に属する微生物は、ニト
リル類を水和または加水分解して対応するアミドまたは
酸を生産するための微生物触媒として知られており（欧
州特許出願公開第188316号明細書、同第204555号明細
書、同第348901号明細書）、またRhodococcus rhodochr
ous に属する微生物が極めて高性能なニトリル水和活性
を有することが知られている（欧州特許出願公開第3079
26号明細書）。このような状況下、Rhodococcus属の宿
主ベクター系の開発が以前から期待されていた。しかし
ながら、Rhodococcus属に属する菌株についてはこれら
の微生物を宿主とするに適したベクターの開発は遅れて
おり、Rhodococcus属においてプラスミドの見い出され
た株はRhodococcus sp. H13-A 株 (J.Bacteriol., 170,
638-645(1988))、Rhodococcus erythropolis (rhodoch
rous) ATCC 12674株 (Mol. Gen. Genet., 211, 148-154
(1988))および本発明者らがさきに特許出願したRhodoco
ccusrhodochrous ATCC 4276 等（特願平2-270377号）を
はじめわずか数株にすぎない。そのため、更にRhodococ
cus属に属する菌株から工業的に利用し得る微生物を育
種、改良するための新しいベクターの開発が強く要望さ
れる。
リル類を水和または加水分解して対応するアミドまたは
酸を生産するための微生物触媒として知られており（欧
州特許出願公開第188316号明細書、同第204555号明細
書、同第348901号明細書）、またRhodococcus rhodochr
ous に属する微生物が極めて高性能なニトリル水和活性
を有することが知られている（欧州特許出願公開第3079
26号明細書）。このような状況下、Rhodococcus属の宿
主ベクター系の開発が以前から期待されていた。しかし
ながら、Rhodococcus属に属する菌株についてはこれら
の微生物を宿主とするに適したベクターの開発は遅れて
おり、Rhodococcus属においてプラスミドの見い出され
た株はRhodococcus sp. H13-A 株 (J.Bacteriol., 170,
638-645(1988))、Rhodococcus erythropolis (rhodoch
rous) ATCC 12674株 (Mol. Gen. Genet., 211, 148-154
(1988))および本発明者らがさきに特許出願したRhodoco
ccusrhodochrous ATCC 4276 等（特願平2-270377号）を
はじめわずか数株にすぎない。そのため、更にRhodococ
cus属に属する菌株から工業的に利用し得る微生物を育
種、改良するための新しいベクターの開発が強く要望さ
れる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】工業的に有用なRhodoc
occus属細菌から得られる環状プラスミドは本菌属を遺
伝的に改良するにたる可能性は秘めているもののほとん
どがプラスミドのマーカーとなり得るような薬剤耐性遺
伝子を持っていない潜在性プラスミドである。そこで、
このような潜在性プラスミドにマーカーとなりうる遺伝
子を導入することによりベクタープラスミドの構築が可
能となるが、そのような例はまだ一例あるに過ぎない
(J. Bacteriol., 170, 638-645(1988)) 。本発明者ら
は、環状プラスミドpRC001, pRC002, pRC003およびpRC0
04にマーカーとなり得る薬剤耐性遺伝子、クローニング
サイトおよび大腸菌内で複製するのに必要な遺伝子領域
を導入することにより、工業的に有用なプラスミドベク
ターを創成することができることを見いだし、本発明を
完成した。
occus属細菌から得られる環状プラスミドは本菌属を遺
伝的に改良するにたる可能性は秘めているもののほとん
どがプラスミドのマーカーとなり得るような薬剤耐性遺
伝子を持っていない潜在性プラスミドである。そこで、
このような潜在性プラスミドにマーカーとなりうる遺伝
子を導入することによりベクタープラスミドの構築が可
能となるが、そのような例はまだ一例あるに過ぎない
(J. Bacteriol., 170, 638-645(1988)) 。本発明者ら
は、環状プラスミドpRC001, pRC002, pRC003およびpRC0
04にマーカーとなり得る薬剤耐性遺伝子、クローニング
サイトおよび大腸菌内で複製するのに必要な遺伝子領域
を導入することにより、工業的に有用なプラスミドベク
ターを創成することができることを見いだし、本発明を
完成した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、（Ａ）プラス
ミドpRC001, pRC002, pRC003およびpRC004から選ばれる
プラスミド由来の、Rhodococcus属細菌に属する菌株細
胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域と、（Ｂ）大腸菌細胞
内で複製増殖可能なプラスミドＤＮＡ領域と、（Ｃ）薬
剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域とを含むことを特徴とす
る複合プラスミドベクターである。
ミドpRC001, pRC002, pRC003およびpRC004から選ばれる
プラスミド由来の、Rhodococcus属細菌に属する菌株細
胞内で複製増殖可能なＤＮＡ領域と、（Ｂ）大腸菌細胞
内で複製増殖可能なプラスミドＤＮＡ領域と、（Ｃ）薬
剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域とを含むことを特徴とす
る複合プラスミドベクターである。
【０００５】プラスミドpRC001, pRC002, pRC003および
pRC004の複製増殖可能なＤＮＡ領域としてはRhodococcu
s属細菌内で複製が可能であれば、該プラスミドの全体
であってもよく、或いは一断片であってもよい。なお、
上記プラスミドpRC001, pRC002, pRC003およびpRC004は
それぞれ Rhodococcus rhodochrous ATCC 4276、ATCC14
349、ATCC 14348およびIFO 3338株由来であり、その制
限酵素切断地図を図１に示す。
pRC004の複製増殖可能なＤＮＡ領域としてはRhodococcu
s属細菌内で複製が可能であれば、該プラスミドの全体
であってもよく、或いは一断片であってもよい。なお、
上記プラスミドpRC001, pRC002, pRC003およびpRC004は
それぞれ Rhodococcus rhodochrous ATCC 4276、ATCC14
349、ATCC 14348およびIFO 3338株由来であり、その制
限酵素切断地図を図１に示す。
【０００６】また、大腸菌細胞内で複製増殖し得るプラ
スミドとしては、例えば、pHSG299,pHSG298, pUC19, pU
C18 等を用いることが可能であり、これらのプラスミド
のＤＮＡ領域も、大腸菌細胞内で複製増殖可能であれ
ば、プラスミド全体であってもよく、或いは一断片であ
ってもよい。更に薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシ
ン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などが好適に用
いられるが、宿主とするRhodococcus属細菌および大腸
菌内で発現し、宿主に薬剤耐性を与えることができ、両
菌属間で、薬剤耐性能によりプラスミドの存在が示唆さ
れる限り薬剤の種類は限られるものではなく、また一種
類でも複数存在してもよい。
スミドとしては、例えば、pHSG299,pHSG298, pUC19, pU
C18 等を用いることが可能であり、これらのプラスミド
のＤＮＡ領域も、大腸菌細胞内で複製増殖可能であれ
ば、プラスミド全体であってもよく、或いは一断片であ
ってもよい。更に薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシ
ン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などが好適に用
いられるが、宿主とするRhodococcus属細菌および大腸
菌内で発現し、宿主に薬剤耐性を与えることができ、両
菌属間で、薬剤耐性能によりプラスミドの存在が示唆さ
れる限り薬剤の種類は限られるものではなく、また一種
類でも複数存在してもよい。
【０００７】以上のような特性を持つ本発明の複合プラ
スミドベクターは、Rhodococcus属細菌としては、Rhodo
coccus rhodochrous ATCC 12674由来菌株を宿主とする
事が可能であり、また、大腸菌としてはK-12系統株を宿
主とすることが可能である。従って、上記複合プラスミ
ドベクターによるそれら微生物の形質転換体を得ること
ができる。
スミドベクターは、Rhodococcus属細菌としては、Rhodo
coccus rhodochrous ATCC 12674由来菌株を宿主とする
事が可能であり、また、大腸菌としてはK-12系統株を宿
主とすることが可能である。従って、上記複合プラスミ
ドベクターによるそれら微生物の形質転換体を得ること
ができる。
【０００８】
【実施例】次に、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、下記の実施例は本発明の技術的範囲を限定す
るものではない。
明するが、下記の実施例は本発明の技術的範囲を限定す
るものではない。
【０００９】
【実施例１】 （１） プラスミドpRC001, pRC002, pRC003またはpRC0
04とプラスミドpHSG299とからなる複合プラスミドベク
ターpK1, pK2, pK3およびpK4の作成 図２に示したようにして複合プラスミドベクターpK１,
pK２,pK３およびpK４を作成した。プラスミドpRC001, p
RC002, pRC003およびpRC004（１μg)にそれぞれ制限酵
素ClaI（５units)を加え37℃，１時間反応させプラスミ
ドＤＮＡを切断した。
04とプラスミドpHSG299とからなる複合プラスミドベク
ターpK1, pK2, pK3およびpK4の作成 図２に示したようにして複合プラスミドベクターpK１,
pK２,pK３およびpK４を作成した。プラスミドpRC001, p
RC002, pRC003およびpRC004（１μg)にそれぞれ制限酵
素ClaI（５units)を加え37℃，１時間反応させプラスミ
ドＤＮＡを切断した。
【００１０】一方、プラスミドpHSG299（カナマイシン
耐性を発現する2.7kbのプラスミドであり、市販品とし
て宝酒造より購入が可能）0.5μgを制限酵素AccI (5uni
ts) を加え37℃，１時間反応させプラスミドＤＮＡを切
断した。反応液に1M-Tris-HCl(pH9.0) を1/10量加え、
アルカリホスファターゼ(1unit）と65℃、１時間反応さ
せた。
耐性を発現する2.7kbのプラスミドであり、市販品とし
て宝酒造より購入が可能）0.5μgを制限酵素AccI (5uni
ts) を加え37℃，１時間反応させプラスミドＤＮＡを切
断した。反応液に1M-Tris-HCl(pH9.0) を1/10量加え、
アルカリホスファターゼ(1unit）と65℃、１時間反応さ
せた。
【００１１】上記の処理を行ったプラスミド液を 0.7%
アガロースゲル電気泳動に供し、プラスミドpRC001, pR
C002, pRC003およびpRC004からは2.6kb、プラスミドpHS
G299からは2.7kbのＤＮＡの画分を切り出した。この
際、サイズマーカーとしてラムダファージＤＮＡのHind
III消化物を用い、ＤＮＡのサイズを算出した。Gene cl
ean kit（フナコシ（株))を用いてアガロースゲルより
ＤＮＡを回収しＴＥ緩衝液（10mMTris-HCl, １mMEDTA,
(pH8.0))に溶解した。それぞれのＤＮＡ断片を含む液を
等量ずつ混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ1unit, １mM ATP,
10mM ジチオスレイトール, 10mM MgCl2となるように各
成分を加えて４℃、１夜反応させた。
アガロースゲル電気泳動に供し、プラスミドpRC001, pR
C002, pRC003およびpRC004からは2.6kb、プラスミドpHS
G299からは2.7kbのＤＮＡの画分を切り出した。この
際、サイズマーカーとしてラムダファージＤＮＡのHind
III消化物を用い、ＤＮＡのサイズを算出した。Gene cl
ean kit（フナコシ（株))を用いてアガロースゲルより
ＤＮＡを回収しＴＥ緩衝液（10mMTris-HCl, １mMEDTA,
(pH8.0))に溶解した。それぞれのＤＮＡ断片を含む液を
等量ずつ混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ1unit, １mM ATP,
10mM ジチオスレイトール, 10mM MgCl2となるように各
成分を加えて４℃、１夜反応させた。
【００１２】大腸菌JM105株のコンピテントセル（宝酒
造製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、42
℃、２分間の熱処理を行い、２xYT培地（0.5％NaCl，１
％イーストエキス、1.6％トリプトン）を加えて37℃、
１時間振とうした。 25μｇ／mlカナマイシン、１mM IP
TG（イソプロピル−β−ガラクトピラノシド）、および
0.02％ X-gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含む２xYT寒天培
地に塗布し、37℃、１夜静置培養した。出現したコロニ
ーより白色のコロニーを選択し、50μｇ／mlカナマイシ
ン入りの２xYT培地（３ml）で37℃にて８時間振とう培
養した。
造製）に上記反応液を加え、０℃、１時間静置後、42
℃、２分間の熱処理を行い、２xYT培地（0.5％NaCl，１
％イーストエキス、1.6％トリプトン）を加えて37℃、
１時間振とうした。 25μｇ／mlカナマイシン、１mM IP
TG（イソプロピル−β−ガラクトピラノシド）、および
0.02％ X-gal（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含む２xYT寒天培
地に塗布し、37℃、１夜静置培養した。出現したコロニ
ーより白色のコロニーを選択し、50μｇ／mlカナマイシ
ン入りの２xYT培地（３ml）で37℃にて８時間振とう培
養した。
【００１３】15,000rpm、５分間の遠心分離により菌体
を回収し、0.35ml STET溶液（８％シュークロース、0.
５％ TritonX-100, 50mM EDTA, 10mM Tris-HCl(pH8.0))
に懸濁した。リゾチーム液（10mg／ml）25μｌを加え、
Vortexで３秒間攪拌後、沸騰している湯に50秒間浸し
た。15,000rpm、15分間の遠心分離により沈澱を取り除
き上清を得た。これにＴＥ飽和フェノール：クロロホル
ム（１：１）液を0.５ml加え攪拌後、15,000rpm、５分
遠心分離を行い、上層を得た。ジエチルエーテル0.５ml
を加えて混合後、遠心分離を行い上層を除去した。イソ
プロパノール0.５ml、2.5M酢酸ソーダ液 (pH4.5) 5０μ
ｌを加え、−80℃、30分静置後15,000rpm、10分遠心分
離を行い沈澱を得た。70％エタノールで洗浄し、減圧乾
燥させ、0.１mlのＴＥ緩衝液に溶解させた。
を回収し、0.35ml STET溶液（８％シュークロース、0.
５％ TritonX-100, 50mM EDTA, 10mM Tris-HCl(pH8.0))
に懸濁した。リゾチーム液（10mg／ml）25μｌを加え、
Vortexで３秒間攪拌後、沸騰している湯に50秒間浸し
た。15,000rpm、15分間の遠心分離により沈澱を取り除
き上清を得た。これにＴＥ飽和フェノール：クロロホル
ム（１：１）液を0.５ml加え攪拌後、15,000rpm、５分
遠心分離を行い、上層を得た。ジエチルエーテル0.５ml
を加えて混合後、遠心分離を行い上層を除去した。イソ
プロパノール0.５ml、2.5M酢酸ソーダ液 (pH4.5) 5０μ
ｌを加え、−80℃、30分静置後15,000rpm、10分遠心分
離を行い沈澱を得た。70％エタノールで洗浄し、減圧乾
燥させ、0.１mlのＴＥ緩衝液に溶解させた。
【００１４】このようにして調製した上記プラスミド溶
液を用いて、制限酵素HindIII, BamHI, SphI, EcoRI, X
hoIを用いた制限酵素切断パターンを調べた。プラスミ
ドpRC001, pRC002, pRC003またはpRC004から得られた複
合プラスミドはいずれも同じ制限酵素切断部位を持ちそ
れぞれpK1, pK2, pK3およびpK4と命名した（表１）。
液を用いて、制限酵素HindIII, BamHI, SphI, EcoRI, X
hoIを用いた制限酵素切断パターンを調べた。プラスミ
ドpRC001, pRC002, pRC003またはpRC004から得られた複
合プラスミドはいずれも同じ制限酵素切断部位を持ちそ
れぞれpK1, pK2, pK3およびpK4と命名した（表１）。
【００１５】
【表１】
【００１６】（２）大腸菌からの複合プラスミドpK1, p
K2, pK3およびpK4の分離精製 上記の大腸菌形質転換体（カナマイシン耐性株）を２xY
T培地２00mlを用いて培養し、遠心により菌体を回収し
た。菌体を40mlの TES (10mM Tris-HCl (pH8.0),10mM N
aCl, 1mM EDTA）緩衝液で洗浄後、８mlのSTET溶液(50mM
Tris-HCl(pH8.0), 5mM EDTA, 35mM シュークロース）
を加え、リゾチームを10mg添加した。０℃、５分間振と
う後４ml 0.25M EDTA (pH8.0）を加え、時々緩やかに混
合しながら０℃に５分間保った。室温に戻して、２mlの
10％ SDS（ラウリル硫酸ナトリウム）溶液、５mlの5M N
aCl溶液を加えて４℃、３−12時間静置した。４℃にて6
5,000xgで１時間遠心し上清を得、これに50％ポリエチ
レングリコール6000を4.６ml加えた。氷上で３時間静置
し、1000xgで５分遠心した。沈澱物を7.5ml TES緩衝液
に溶解し、CsClを8.2g, 15mg／ml臭化エチジウム溶液を
0.２ml加え混合した。この溶液を42時間130,000xgの密
度勾配遠心分離にかけた。紫外線照射により検出された
プラスミド画分を分取した後、ｎ−ブタノールで処理し
臭化エチジウムを除いた。ＴＥ緩衝液に対して透析後、
エタノール沈澱により精製プラスミド画分を得た。これ
を0.７％アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルを臭化エ
チジウムで染色することによりプラスミドの存在を確認
した。 （３）複合プラスミドのRhodococcus属細菌への導入 Rhodococcus rhodochrous ATCC 12674株の対数増殖期の
細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回
洗浄し、15％ PEG6000（ポリエチレングリコール6000）
溶液に懸濁した（菌体濃度109cell／ml以上）。上記の
シャトルプラスミドベクターpK1, pK2, pK3またはpK4Ｄ
ＮＡ10-2μｇと菌体懸濁液10μｌを混合し、氷冷した。
島津細胞融合装置SSH-1用のチャンバー11にＤＮＡと菌
体の混合液を入れ、氷冷した後、パルス幅500μｓ，電
場強度14kv／cmで電気パルス処理を行った。
K2, pK3およびpK4の分離精製 上記の大腸菌形質転換体（カナマイシン耐性株）を２xY
T培地２00mlを用いて培養し、遠心により菌体を回収し
た。菌体を40mlの TES (10mM Tris-HCl (pH8.0),10mM N
aCl, 1mM EDTA）緩衝液で洗浄後、８mlのSTET溶液(50mM
Tris-HCl(pH8.0), 5mM EDTA, 35mM シュークロース）
を加え、リゾチームを10mg添加した。０℃、５分間振と
う後４ml 0.25M EDTA (pH8.0）を加え、時々緩やかに混
合しながら０℃に５分間保った。室温に戻して、２mlの
10％ SDS（ラウリル硫酸ナトリウム）溶液、５mlの5M N
aCl溶液を加えて４℃、３−12時間静置した。４℃にて6
5,000xgで１時間遠心し上清を得、これに50％ポリエチ
レングリコール6000を4.６ml加えた。氷上で３時間静置
し、1000xgで５分遠心した。沈澱物を7.5ml TES緩衝液
に溶解し、CsClを8.2g, 15mg／ml臭化エチジウム溶液を
0.２ml加え混合した。この溶液を42時間130,000xgの密
度勾配遠心分離にかけた。紫外線照射により検出された
プラスミド画分を分取した後、ｎ−ブタノールで処理し
臭化エチジウムを除いた。ＴＥ緩衝液に対して透析後、
エタノール沈澱により精製プラスミド画分を得た。これ
を0.７％アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルを臭化エ
チジウムで染色することによりプラスミドの存在を確認
した。 （３）複合プラスミドのRhodococcus属細菌への導入 Rhodococcus rhodochrous ATCC 12674株の対数増殖期の
細胞を遠心分離により集菌し、氷冷した滅菌水にて３回
洗浄し、15％ PEG6000（ポリエチレングリコール6000）
溶液に懸濁した（菌体濃度109cell／ml以上）。上記の
シャトルプラスミドベクターpK1, pK2, pK3またはpK4Ｄ
ＮＡ10-2μｇと菌体懸濁液10μｌを混合し、氷冷した。
島津細胞融合装置SSH-1用のチャンバー11にＤＮＡと菌
体の混合液を入れ、氷冷した後、パルス幅500μｓ，電
場強度14kv／cmで電気パルス処理を行った。
【００１７】電気パルス処理液を氷冷下10分間静置し、
37℃、５分間熱処理後、ＭＹ培地 1mlを加え、25℃、３
時間振とうした。50μｇ／mlカナマイシン入りＭＹ寒天
培地に塗布し25℃、３−６日間培養した。出現したコロ
ニーが明らかにカナマイシン耐性であることを別に作成
したカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布することによ
り確認した。
37℃、５分間熱処理後、ＭＹ培地 1mlを加え、25℃、３
時間振とうした。50μｇ／mlカナマイシン入りＭＹ寒天
培地に塗布し25℃、３−６日間培養した。出現したコロ
ニーが明らかにカナマイシン耐性であることを別に作成
したカナマイシン入りＭＹ寒天培地に塗布することによ
り確認した。
【００１８】ここで得られたプラスミドベクターpK1, p
K2, pK3またはpK4を含む組換えベクターで形質転換され
た形質転換微生物はそれぞれ次の通り工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。 R.rhodochrous ATCC 12674/pK1 微工研条寄第3728
号 R.rhodochrous ATCC 12674/pK2 微工研条寄第3729
号 R.rhodochrous ATCC 12674/pK3 微工研条寄第3730
号 R.rhodochrous ATCC 12674/pK4 微工研条寄第3731
号 以下、pK4について更に検討した。 （４）Rhodococcusからの複合プラスミドベクターの回
収、精製 Rhodococcus rhodochrous ATCC 12674／pK4株を、４00m
lのＭＹ培地（50μｇ／mlカナマイシンを含む）にて培
養を行った。ＯＤ660＝0.15〜0.2の頃にペニシリンＧ
0.5Ｕ／mlを加え、ＯＤ660＝1.０まで培養後、遠心によ
り菌体を回収した。菌体を40mlのＴＥＳ緩衝液で洗浄
後、11mlの50mM Tris-HCl (pH8)-12.5％ sucrose-100mM
NaCl-１mg／mlリゾチームに懸濁し、37℃にて３時間振
盪した。これに0.６mlの0.５M EDTA溶液、2.４mlの5M N
aCl 溶液、4.４mlの４％ SDS-0.7M NaClを順次加え、緩
やかに混合し氷上で18時間静置した。４℃にて65,000xg
１時間遠心し上清を得、これに50％ポリエチレングリコ
ール6000を4.６ml加えた。氷上で３時間静置し、1,000x
g５分遠心した。沈澱物を５mlのＴＥＳ緩衝液に溶解
し、CsClを7.５ｇ、1.５mg／ml臭化エチジュウム−ＴＥ
Ｓ緩衝液を２ml加え混合した。この溶液を42時間130,00
0xgの密度勾配遠心分離にかけた。
K2, pK3またはpK4を含む組換えベクターで形質転換され
た形質転換微生物はそれぞれ次の通り工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。 R.rhodochrous ATCC 12674/pK1 微工研条寄第3728
号 R.rhodochrous ATCC 12674/pK2 微工研条寄第3729
号 R.rhodochrous ATCC 12674/pK3 微工研条寄第3730
号 R.rhodochrous ATCC 12674/pK4 微工研条寄第3731
号 以下、pK4について更に検討した。 （４）Rhodococcusからの複合プラスミドベクターの回
収、精製 Rhodococcus rhodochrous ATCC 12674／pK4株を、４00m
lのＭＹ培地（50μｇ／mlカナマイシンを含む）にて培
養を行った。ＯＤ660＝0.15〜0.2の頃にペニシリンＧ
0.5Ｕ／mlを加え、ＯＤ660＝1.０まで培養後、遠心によ
り菌体を回収した。菌体を40mlのＴＥＳ緩衝液で洗浄
後、11mlの50mM Tris-HCl (pH8)-12.5％ sucrose-100mM
NaCl-１mg／mlリゾチームに懸濁し、37℃にて３時間振
盪した。これに0.６mlの0.５M EDTA溶液、2.４mlの5M N
aCl 溶液、4.４mlの４％ SDS-0.7M NaClを順次加え、緩
やかに混合し氷上で18時間静置した。４℃にて65,000xg
１時間遠心し上清を得、これに50％ポリエチレングリコ
ール6000を4.６ml加えた。氷上で３時間静置し、1,000x
g５分遠心した。沈澱物を５mlのＴＥＳ緩衝液に溶解
し、CsClを7.５ｇ、1.５mg／ml臭化エチジュウム−ＴＥ
Ｓ緩衝液を２ml加え混合した。この溶液を42時間130,00
0xgの密度勾配遠心分離にかけた。
【００１９】紫外線照射により検出されたプラスミド画
分を分取した後、ｎ−ブタノールで処理し臭化エチジュ
ウムを除いた。ＴＥ緩衝液に対して透析後、エタノール
沈澱により精製プラスミド画分を得た。これを0.７％ア
ガロースゲル電気泳動に供し、ゲルを臭化エチジュウム
で染色することによりプラスミドの存在を確認した。 （５）大腸菌由来の複合プラスミドpK4とRhodococcus由
来の複合プラスミドpK４の比較 １）分子量測定 プラスミドの一部を0.７％アガロースゲル電気泳動に供
した。この際、サイズマーカーとして大腸菌プラスミド
pUC18, pUC118, pBR322（各々2.69kb, 3.16kb, 4.36k
b）を同時に泳動した。その結果、pK４プラスミドは、
大腸菌由来のものと、Rhodococcus由来のものは共に約
5.3kbであった。 ２）各種制限酵素による切断特異性 プラスミドの一部を各種制限酵素と反応させ、反応終了
後、反応液を0.７％アガロースゲル電気泳動および５％
アクリルアミドゲル電気泳動により分析した。サイズマ
ーカーとしてはラムダファージＤＮＡのHindIII消化物
およびPstＩ消化物を用い、プラスミドの各制限酵素断
片のサイズを算出した。その結果、pK４プラスミドは表
１と同様の制限酵素切断特性を示した。 （６）Rhodococcus由来の複合プラスミドpK４を用いた
大腸菌の形質転換 Rhodococcus rhodochrous ATCC 12674／pK４株より得た
プラスミドpK４を用いて大腸菌JM105株を形質転換し
た。カナマイシン50μｇ／mlを含む２xYT寒天プレート
で選択したところ高頻度でカナマイシン耐性能を示す株
が得られた。これらの形質転換株の内12株よりプラスミ
ドを分離し、制限酵素による切断パターンを調べたとこ
ろ、Rhodococcus の形質転換株から得られたプラスミド
pK４（表１）と同じであった。
分を分取した後、ｎ−ブタノールで処理し臭化エチジュ
ウムを除いた。ＴＥ緩衝液に対して透析後、エタノール
沈澱により精製プラスミド画分を得た。これを0.７％ア
ガロースゲル電気泳動に供し、ゲルを臭化エチジュウム
で染色することによりプラスミドの存在を確認した。 （５）大腸菌由来の複合プラスミドpK4とRhodococcus由
来の複合プラスミドpK４の比較 １）分子量測定 プラスミドの一部を0.７％アガロースゲル電気泳動に供
した。この際、サイズマーカーとして大腸菌プラスミド
pUC18, pUC118, pBR322（各々2.69kb, 3.16kb, 4.36k
b）を同時に泳動した。その結果、pK４プラスミドは、
大腸菌由来のものと、Rhodococcus由来のものは共に約
5.3kbであった。 ２）各種制限酵素による切断特異性 プラスミドの一部を各種制限酵素と反応させ、反応終了
後、反応液を0.７％アガロースゲル電気泳動および５％
アクリルアミドゲル電気泳動により分析した。サイズマ
ーカーとしてはラムダファージＤＮＡのHindIII消化物
およびPstＩ消化物を用い、プラスミドの各制限酵素断
片のサイズを算出した。その結果、pK４プラスミドは表
１と同様の制限酵素切断特性を示した。 （６）Rhodococcus由来の複合プラスミドpK４を用いた
大腸菌の形質転換 Rhodococcus rhodochrous ATCC 12674／pK４株より得た
プラスミドpK４を用いて大腸菌JM105株を形質転換し
た。カナマイシン50μｇ／mlを含む２xYT寒天プレート
で選択したところ高頻度でカナマイシン耐性能を示す株
が得られた。これらの形質転換株の内12株よりプラスミ
ドを分離し、制限酵素による切断パターンを調べたとこ
ろ、Rhodococcus の形質転換株から得られたプラスミド
pK４（表１）と同じであった。
【００２０】
【実施例２】図３に示したようにしてプラスミドpA３を
作成した。プラスミドpRC003を制限酵素ClaIで切断し、
pUC19プラスミドのAccI部位に挿入した複合プラスミド
ベクターを作成しpA３と命名した。実施例１と同様に大
腸菌JM105株へ導入し、50μｇ／mlアンピシリン、1mM I
PTG,0.02％ Xgalを含む２xYT培地にて白色コロニーを選
別し、増幅させ、分離精製後、制限酵素による確認を行
った。このプラスミドについてRhodococcus rhodochrou
s ATCC 12674株の形質転換を試みた結果、このプラスミ
ドが本菌株に10μｇ／ml濃度のアンピシリンに対して耐
性を賦与することが明らかとなった。なお、ここで得ら
れた形質転換体微生物、R.rhodochrous ATCC 12674／pA
３は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第37
32号として寄託している。表２にプラスミドpA３の制限
酵素切断パターンを示す。
作成した。プラスミドpRC003を制限酵素ClaIで切断し、
pUC19プラスミドのAccI部位に挿入した複合プラスミド
ベクターを作成しpA３と命名した。実施例１と同様に大
腸菌JM105株へ導入し、50μｇ／mlアンピシリン、1mM I
PTG,0.02％ Xgalを含む２xYT培地にて白色コロニーを選
別し、増幅させ、分離精製後、制限酵素による確認を行
った。このプラスミドについてRhodococcus rhodochrou
s ATCC 12674株の形質転換を試みた結果、このプラスミ
ドが本菌株に10μｇ／ml濃度のアンピシリンに対して耐
性を賦与することが明らかとなった。なお、ここで得ら
れた形質転換体微生物、R.rhodochrous ATCC 12674／pA
３は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第37
32号として寄託している。表２にプラスミドpA３の制限
酵素切断パターンを示す。
【００２１】
【表２】
【００２２】
【発明の効果】本発明の複合プラスミドベクターはRhod
ococcus属またはEscherichia属に属する細菌において工
業的に利用しうる微生物を育種、改良するために有用で
ある。
ococcus属またはEscherichia属に属する細菌において工
業的に利用しうる微生物を育種、改良するために有用で
ある。
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpRC001, pRC002, pRC003およびpRC0
04の制限酵素切断地図。
04の制限酵素切断地図。
【図２】本発明のプラスミドpK1, pK2, pK３およびpK４
の作成方法を示す。
の作成方法を示す。
【図３】本発明のプラスミドpA３の作成方法を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 橋本 好弘 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 日 東化学工業株式会社中央研究所内 (72)発明者 湯 不二夫 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 日 東化学工業株式会社中央研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】（Ａ）プラスミドpRC001, pRC002, pRC003
およびpRC004から選ばれるプラスミド由来の、Rhodococ
cus属細菌に属する菌株細胞内で複製増殖可能なＤＮＡ
領域と、 （Ｂ）大腸菌細胞内で複製増殖可能なプラスミドＤＮＡ
領域と、 （Ｃ）薬剤耐性遺伝子を含むＤＮＡ領域 とを含むことを特徴とする複合プラスミドベクター。 - 【請求項２】 プラスミドＤＮＡ複製領域（Ｂ）がpHSG
299, pHSG298, pUC19およびpUC18から選ばれる請求項１
記載の複合プラスミドベクター。 - 【請求項３】 pK1, pK2, pK3, pK4またはpA3である請
求項１記載の複合プラスミドベクター。 - 【請求項４】 請求項１〜請求項３のいずれか１項に記
載の複合プラスミドベクターにより形質転換されたRhod
ococcus属またはEscherichia属に属する細菌の形質転換
微生物。 - 【請求項５】 Rhodococcus属細菌がRhodococcusrhodoc
hrous ATCC 12674株である請求項４記載の形質転換微生
物。 - 【請求項６】 Escherichia属細菌が大腸菌（Escherich
ia coli）K-12株である請求項４記載の形質転換微生
物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3-37545 | 1991-03-04 | ||
| JP3754591 | 1991-03-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0564589A true JPH0564589A (ja) | 1993-03-19 |
| JP3142349B2 JP3142349B2 (ja) | 2001-03-07 |
Family
ID=12500499
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4539392A Expired - Lifetime JP3142349B2 (ja) | 1991-03-04 | 1992-03-03 | 複合プラスミドベクターおよび形質転換微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3142349B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0704530A2 (en) | 1994-08-04 | 1996-04-03 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | A kanamycin resistance gene derived from microorganisms of the genus rhodococcus |
| WO2003004639A1 (fr) * | 2001-07-05 | 2003-01-16 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Fragments d'adn contenant un gene qui possede une fonction associee a la proliferation autonome d'un plasmide |
| JP2005348674A (ja) * | 2004-06-11 | 2005-12-22 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | ロドコッカス属細菌由来トリメトプリム耐性ジヒドロ葉酸還元酵素及びその遺伝子 |
| JP2006050967A (ja) * | 2004-08-12 | 2006-02-23 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のプラスミドおよびその誘導体、並びに大腸菌−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌シャトルベクター |
| WO2014038216A1 (ja) | 2012-09-10 | 2014-03-13 | 三菱レイヨン株式会社 | メタクリル酸及び／又はそのエステルの製造方法 |
| WO2014038214A1 (ja) | 2012-09-10 | 2014-03-13 | 三菱レイヨン株式会社 | メタクリル酸エステルの製造方法 |
| KR20160108546A (ko) | 2014-03-07 | 2016-09-19 | 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 | 메타크릴산에스테르의 제조 방법 및 신규 메타크릴산에스테르 합성 효소 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7459713B2 (en) | 2003-08-14 | 2008-12-02 | Microptix Technologies, Llc | Integrated sensing system approach for handheld spectral measurements having a disposable sample handling apparatus |
-
1992
- 1992-03-03 JP JP4539392A patent/JP3142349B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0704530A2 (en) | 1994-08-04 | 1996-04-03 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | A kanamycin resistance gene derived from microorganisms of the genus rhodococcus |
| WO2003004639A1 (fr) * | 2001-07-05 | 2003-01-16 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Fragments d'adn contenant un gene qui possede une fonction associee a la proliferation autonome d'un plasmide |
| US7557202B2 (en) | 2001-07-05 | 2009-07-07 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | DNA fragments containing gene having function relating to autonomous proliferation of plasmid |
| JP4733298B2 (ja) * | 2001-07-05 | 2011-07-27 | 三菱レイヨン株式会社 | プラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含むｄｎａ断片 |
| JP2005348674A (ja) * | 2004-06-11 | 2005-12-22 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | ロドコッカス属細菌由来トリメトプリム耐性ジヒドロ葉酸還元酵素及びその遺伝子 |
| JP2006050967A (ja) * | 2004-08-12 | 2006-02-23 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のプラスミドおよびその誘導体、並びに大腸菌−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌シャトルベクター |
| JP4570075B2 (ja) * | 2004-08-12 | 2010-10-27 | 三菱レイヨン株式会社 | ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来のプラスミドおよびその誘導体、並びに大腸菌−ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌シャトルベクター |
| WO2014038214A1 (ja) | 2012-09-10 | 2014-03-13 | 三菱レイヨン株式会社 | メタクリル酸エステルの製造方法 |
| WO2014038216A1 (ja) | 2012-09-10 | 2014-03-13 | 三菱レイヨン株式会社 | メタクリル酸及び／又はそのエステルの製造方法 |
| KR20140092386A (ko) | 2012-09-10 | 2014-07-23 | 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 | 메타크릴산 및/또는 그의 에스테르의 제조 방법 |
| KR20170018099A (ko) | 2012-09-10 | 2017-02-15 | 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 | 메타크릴산 및/또는 그의 에스테르의 제조 방법 |
| EP3395951A2 (en) | 2012-09-10 | 2018-10-31 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing methacrylic acid ester |
| US10294500B2 (en) | 2012-09-10 | 2019-05-21 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing methacrylic acid and/or ester thereof |
| US10851392B2 (en) | 2012-09-10 | 2020-12-01 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing methacrylic acid ester |
| KR20160108546A (ko) | 2014-03-07 | 2016-09-19 | 미쯔비시 레이온 가부시끼가이샤 | 메타크릴산에스테르의 제조 방법 및 신규 메타크릴산에스테르 합성 효소 |
| US10570426B2 (en) | 2014-03-07 | 2020-02-25 | Mitsubishi Chemical Corporation | Method for producing methacrylic acid ester and novel methacrylic acid ester synthetase |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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