JPS61104785A - 酵素組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素、このような酵素を含有する細菌及びこの
ような酵素の２−ハロアルカノン酸製造への利用に関す
る。

２−ハロアルカノン酸、例えば２−クロロプロピオン酸
（以下では、便宜上「２−ＣＰＡＪと呼ぶ）は特にピリ
ジルオキシ−フェノキシ置換アルカノン酸（以下では便
宜）［ＰＰＡＡ’Ｊと呼ぶ）の製造における中間体とし
て有用である。成る種のＰ　Ｐ　Ａ　Ａ’Ｘ：ｓ、例え
ばＤ−２−（４−５−（）リフルオロメチル−２−ピリ
ジルオキシ）フェノキシ）プロピオン酸とその低級アル
キルエステルは。

我々のヨーロッパ特許出願明細書第０００３８９０Ａ号
にさらに詳しく述べるように％特にイネ科植物に対する
除草性化合物として有用である。

「２−ハロアルカノン酸」（以下では、便宜上「２−Ｈ
ＡＡ’ｇＪと呼ぶ）はここでは、カルボキシル基に隣接
する炭素原子に１個のフルオロ、クロロ、ブロムまたは
ヨード・ラジカルを有し、直鎖または分枝鎖であるアル
キル基が２〜６個の炭素原子を含むアルカノン酸を意味
する。このアルキル基が、以下で定義する酵素または細
菌と不利に反応しない極性置換基を有する可能性も除外
されるわけではない。

２−ｋｉＡＡ’ａ中及びＰ　Ｐ　Ａ　Ａ’　ａ　　に含
まれるアルカノン酸残基中の２−炭素原子が非対称性炭
素原子であり、このためこの化合物が２つの静像異性体
形で存在し得ることは理解されよう。これらの形態の１
つをＤ−絶対立体配置すなわち右旋性グリセルアルデヒ
ドと同じ絶対立体配置を有し、他の形態はＬ−絶対立体
配置を有する。これらの鏡像異性体は互いの鏡像であシ
、光学的に活性であシ、平明偏光を逆方向に回転させる
。

ヨーロッパ特許出願明細書第０００３８９０Ａ号では、
特定のＰＰＡＡのＤ鏡像異性体がＬ鏡像異性体よりも大
きい除草活性を有することを述べている。除草剤「ジク
ロルプロップ（ＤｔｃｈＬｏｒ−ｐｒｏｐ）」と「メコ
プロップＣＷｉｍａｏｐｒｏｐ月がＤｆ＋１異性体のみ
が除草活性を有するラセミ化合物として製造されること
は、英国作物保護会議（ｔｈａＢｒｉｔｉｓｈ　Ｃｒｏ
ｐ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　Ｃｏ５ｎｃｔｌ）によって
刊行された、シー・アール・ワーシングによる編集の［
殺虫剤マニュアル（ｔＡｇ　ＰｍａｉｔａｉｄｇｓＭａ
ｎｌｃａｌ）Ｊ第７版、１８４頁と３４５頁にも述べら
れている。

さらに、ＰＰＡＡ’ｇのＤ−鏡像異性体が対応する２−
ＨＡＡのＬ−鏡像異性体から製造され得ることもヨーロ
ッパ特許出願明細書第０００３８９０Ａ号に述べられて
いる。

ラセミ混合物の光学異性体分離に基づ〈従来の方法を用
いる２　−ＨＡ　Ａ’　ｓ　Ｌ−鏡像異性体の製造は′
、費用がかかる傾向がある。我々はこのような製造のた
めの生化学的方法を今回、開発した。この方法は２−Ｂ
ＡＡのＤ−鏡像異性体を選択的に脱ハロゲン化して２−
ヒト９０キシアルカノン酸を製造し、２−ヒドロキシア
ルカン酸混合物から２−ＨＡＡＬ−鏡像異性体を分離す
ることに基づくものである。さらに％２−ヒドロキシア
ルカノン酸がラクテートのＤ−鏡像異性体である場合に
は、この方法はＬ−鏡像異性体の営利的に魅力ある製造
方法になる。我々の同時係属英国特許出願第８４１３１
５５号にさら（詳細に述べるように、Ｄ−ラクテートは
ワルデン反転によって、例えば２−ＣＰＡの特にＬ−鏡
像異性体を製造するのに用いられる。

２−ＣＰＡのＤ−鏡像異性体及びＬ−鏡像異性体の両方
の立体配置の反転または保持のいずれかによるラクテー
トへの転化を触媒する酵素が公知である〔ウェイトマン
（Ｗｇｉｇｈｔｔｎ５Ｌｎ）等のジャーナル・オプ・ジ
ェネラル・マイクロバイオロジイにＪｏｕｒ％ａｌ　　
　ｏｆ　　Ｇａｎｍｒａｌ　　Ｗｉｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ）　　。

１９８２年、１８２巻、１７５５〜１７６２頁〕。

２−ＣＰＡのＬ−鏡像異性体のみの反転によるラクテー
トへの転化を触媒する酵素も公知である〔リットル（Ｌ
ｉ　ｔ　ｔ　ｌ　＃　）等、ヨーロピアン・ジャーナル
・オブ・バイオケミストリイ（ｈげａｐｅα外Ｊｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈａｔｎｉｓｔｒｙ）＋　１９
７１年。

２１巻、９９〜１０９頁〕。しかし、２−ＣＰＡのＤ−
鏡像異性体のみをラクテートに転化させる酵素は今まで
に知られていない。我々は今回、２−　ＨＡ　Ａ’　ｓ
もしくはその適当な誘導体の２−ヒト９０キシ化合物へ
の転化を触媒することはできるが。

２−　ＨＡ　Ａ’　ｓのＬ−鏡像異性体もしくはその適
当な誘導体の２−ヒドロキシ化合物への転化を触媒する
ことはできない酵素を発見した。

２−　ＨＡ　Ａ’　ｓのＤ−鏡像異性体もしくはその適
当な誘導体の２−ヒドロキシアルカノン酸もしくはその
適当な誘導体への転化を触媒することはできるが、２−
　ＨＡ　Ａ’　ｓのＬ−鏡像異性体もしくはその誘導体
からのハロゲン残基の放出を触媒することはできない酵
素を以下では便宜ｈｒＤ−２−ＨＨＡ−ハライド９ヒド
ロラーゼ」と呼ぶことにする。

本発明の第一態様では、細菌によって産生されるＤ−２
−ＨＡＡ−ハライドヒビロラーゼから成る細胞を含まな
い酵素組成物であって、Ｌ−２−ＨＡＡまたはその誘導
体を代謝し得る酵素活性を実質的に含まない酵素組成物
を提供する。

本発明の第二態様では、Ｄ−２−）ｉＡＡ−ハライドヒ
ドロラーゼから成り、Ｌ−２−ＨＡＡまたはその誘導体
を代謝し得る酵素を含まない細菌を提供する。

本発明の第三態様では、２−ＨＡＡのＤ−鏡像異性体と
Ｌ−鏡像異性体との混合物甲のＬ−Ｑ像異性体の濃度を
高める方法であって、Ｄ−ｉ像異性体の少なくとも一部
が２−ヒドロキシアルカノン酸またはその誘導体に転化
され得るような条件下で、この混合をＤ−２−ＨＡＡハ
ライビヒビロラーゼで処理する工程から成る方法を提供
する。

本発明の第四態様では１本発明の第一態様による細胞を
含まない酵素組成物の製造方法であって。

適当な細胞を培養し、細胞を溶解させ、それから可溶な
蛋白質フラクションを分離し、目的の酵素組成物を単離
することから成る方法を提供する。

本発明の第五態様では、２−ＨＡＡのＤ−鏡像異性体と
Ｌ−鏡像異性体の混合物中のＬ−鏡像異性体の濃度を高
める方法であって、Ｄ−鏡像異性体の少なくとも一部が
２−ヒドロキシアルカノン酸に転化されるような条件下
で、この混合物１Ｄ−２−ＨＡＡハライド９ヒドロラー
ゼで処理する段階を嫌気性条件下で実施することから成
る方法を提供する。

本発明に用いる２−ＨＡＡは２−ブロモまたは２−クロ
ロ−プロピオン酸であることが好ましい。

我々のヨーロッパ特許出願明細書第０００３８９０Ａ号
にさらに詳しく述べるように、カルボキシル基が適当な
誘導体の形態である可能性を排除するわけではないが、
カルボキシル基は遊離形または。

金属イオンが細胞もしくは酵素と不利に反応しないよう
な、遊離形の金属塩の形態であることが好ましい。金属
イオンは元素周期律表の第１Ａ族の金属から誘導される
ものであることが好ましいが。

ナトリウムまたはカリウムであることがより好ましい。

本発明′の細菌としては如何なる種属の細菌も用いられ
るが、シュート９モナス（Ｐｓｇｘｄｏｍｏｎａｓ）属
の菌株、特にシュードモナス・プチダ（Ｐｓｇｕｄｏ−
ｍｏ％ａａ　ｐ％ｔｉｄα）マタはシュードモナス・フ
ルオレッセンス（Ｐｔｔｍｕｄｏｍｏｎａ＋　ｆＬｓｏ
ｒｇｓｃｇｎｓ）　種属の菌株が適切である。

本発明の第二態様による細菌を突然変異または遺伝操作
によって誘導し、本発明の第一態様による酵素組成物を
単離するためのソースとして用いることのできる５種類
の菌株は、ザ　ナショナルコレクション　オプ　インダ
ストリアル　バクテリア（ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｆＬαｌ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｔｇｓ−ｔｒｉ
ａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）　（イギリス、スコツトラン
ド゛。

アバーディーン、アベイロート’１３５．郵便私書箱３
１〕に寄託されており、次の受入れ番号を与えられてい
る： １．　シュート９モナス・プチダ　ＮＣｌＢ１２０１８
２、　シュードモナス・フルオレッセンスＮＣより１２
１５９ ３、　　ＮＣより１２１６０ ４、ＮＣより１２１６１ ５、　シュードモナス・プチダ　ＮＣより１２１５８こ
れらの菌株及び、本発明の細菌のンースとなり得る、こ
れらから誘導される菌株も本発明の一部を構成する。

２−　ＨＡ　Ａ’　ｓのＬ−鏡像異性体とともにまたは
これの代りに２−ヒト″ロキシアル力ノン酸を製造する
の足用いた場合の本発明の第三及び第五実施態様の方法
も、特に２−ヒビロキシアルヵノン敵が乳酸であるなら
ば本発明の範囲に含まれる。

前記で定義したようなり−２−ＨＡＡ−ハライドヒドロ
ラーゼは例えばシュードモナス・プチダＮＣｌＢ１２０
１８のような細菌から、酵素技術で周知の方法、例えば
吸収、溶出及び沈降法によって単離することができる。

例えば、適当な有機体の細胞を例えば細胞のフレンチプ
レスで破壊する。ホモジネート懸濁液を例えば遠心分離
または濾過のような通常の生化学的分離方法によって、
固相と液相に分離して、適轟々緩衝溶液中の細胞を含ま
ない抽出物が得られる。適当な緩衝溶液には、特にリン
酸塩、トリスヒドロキシメチルアミンメタン（「Ｔｒｉ
ｓ　Ｊ入炭酸水素塩、グリシン、イミダゾール等がある
。緩衝溶碇の濃度は典型的には１ｍＭ〜２００　ｍＭ　
　の範囲であり１例えば約２５ｍＭである。

細胞を含まない抽出物は特に分子量及び／または荷重に
応じて分子を分離し得る分別方法１例えば限外濾過１例
えばポリアクリルアミドゲル上での電気泳動または例え
ばＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ａｐｈａｃａ１カラム上でのク
ロマトグラフィを用いて１分別することができる。適当
なフラクションの確認及び目的の酵素活性を有する酵素
のそれからの単離は当技術Ｅで公知の方法、例えばウェ
イトマン（Ｌｉｇｈｔｍａｎ）等がジャーナル　オブ　
ゼネラルマイクロバイオロジー（ＪｏｕｒｓａＬ　　ｏ
ｆ　ＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｌｌ）　１
９８０年、１２１巻、１８７〜１９３頁に述べている方
法を用いて行うことができる。

本発明の第一態様による酵素はＤ−２−ＣＰＡに対する
脱ハロゲン化に最適なｐＨ値、８．５〜９．５を有して
いる。これらの酵素は有機及び無機の緩衝溶液中で良好
な活性を有するが、適当にＰＨを調節した非緩衝化系に
おいても作用する。

２−ＣＰＡを用いる化学プラントに隣接する土壌から新
規な細菌を単離し、菌株選択法によって、２−ＨＡＡ’
ａまたはその誘導体の脱ハロゲン化に関してすぐれた効
能を有する純粋な形態になるように培養した。この培養
には、娘世代の増殖、単独細胞コロニーの選択及び公知
の発酵培地での増殖は標準方法を用いた。

本発明の第二態様の細菌のンースとして上記した、ＮＣ
よりに寄託の５種類の菌株が第二の酵素を含み、この第
二酵素がＬ　−２−ＨＡ　Ａ’　ａまだはその適当な誘
導体の対応２−ヒドロキシ化合物への転化を触媒し得る
ことが発見された。

本発明の第三または第五態様による方法は細胞内または
細胞外Ｄ−２−ＨＡＡ−ハライドヒドロラーゼを用いて
実施することができる。細胞外Ｄ−２−ＨＡＡ−ハライ
ド９ヒドロラーゼを用いる場合には、細胞は「固定化し
た」または「不溶化した」形態であシ得る。

適当な公知の処置、例えばフロキュレーションによって
、または本質的に不溶の不活性な担体物質に物理的また
は化学的に結合させることによって、酵素及び細胞を「
固定化」または「不溶化」して、酵素及び細胞を流通反
応器への使用を容易にする方法は、技術と公知である。

ここで用いるかぎり、「固定化酵素」または「不溶化酵
素」なる用語は、不溶性担体物質に物理的または化学的
に結合したまたは不溶性担体物質中に包まれた、あるい
は不溶性塊状物もしくは凝集塊を形成するように処理さ
れた酵素または細胞を意味する。固定化された酵素がこ
れを通常溶解させるような液体と接触しても、酵素は担
体物質に付着したままである。固定化された細胞がこれ
を通常容易に汁散させるような液体と接触しても、細胞
は担体物質に付着したままでまたは凝集塊として残留す
る。

担体としては種々な物質を用いることができる。

例えば、酵素及び細胞を例えば種々なセルロース誘導体
、ポリアミノスチレン床等のような種々な有機物質、ま
たは例えば孔質ガラス及びシリカゲルのような種々な無
機物質に結合させることができる。酵素を種々な石英質
物質に吸着させる方法は、米国特許第３５５６９４５号
に述べられている。無機物質、特にアルカリ耐性セラミ
ック、が好ましい。

酵素及び細胞を例えばポリアクリルアミドもしくはカラ
ジーナン等のゲルのような適当な不溶性担体物質中に酵
素もしくは細胞を含む方法まだはこれらを凝集させる方
法は技術と周知である〔パーク（Ｂｘｒｋｇ）ｓ　フイ
ロンフイカル　トランスアクションズ　オブ　ザ　ロー
ヤル　ンサイアティオブ　ロンドｙ　（Ｐｈｉｌｏｓｏ
ｐｈｉｃａｌ　Ｔｒａｎｓａａｔｉｏ％Ｓｏｆ　ｔｈｅ
　Ｒｏｙａｌ　Ｅ３ｏａｔｇｔｙ　ｏｆ　Ｌｏ％ｄｏｔ
＊）　１９８３年、３００巻、３６９〜３８９頁；モス
バッハ（Ｍｏｓｂａｃｈ）　　ｓストラフチャー　アン
ト９　オーダー　イン　ポリマーズ　レフチャー　イン
ターナショナル　シンポジウム（Ｅ３ｔｒｓａｔ１Ｌｒ
ｔｒ　ａｎｄ　０ｒｄｅｒｉｎ　　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　
　Ｌｅｃｔｕｒｅ　　工ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｙ
％ｐｏａｉｘｍ）　　１９８０　、　ｋルガモン１９８
１゜２３１〜２３８頁参照〕 固定化した酵素または細胞を用いる場合には、連続型反
応器よシ好ましくは流通反応器でこれらを使用すること
ができる。

本発明の第三及び第五実施態様による方法に細胞内酵素
を用いる場合には１例えば突然変異または遺伝工学によ
って適当な細胞ｔ−製造することかできる。例えば％Ｄ
−２−ＨＡＡハライドヒドロラーゼ及び％Ｌ−２−ＨＡ
Ａもしくはその誘導体の対応２−ヒドロキシ化合物への
転化を触媒し得る＃素を含む自然生成微生物の細胞に、
細胞がＬ−鏡像異性体に対して不利に反応する可能性を
失うような突然変異処理を行うことができる。この突然
変異処理は例えば紫外線のような適当な電磁線への畢露
等の物理的処理または例えばＮ−メチＡ／　−Ｎ’−二
）ｏ−１１−ニトロングアニジンのような適当な化学薬
品による化学的処理である。適当な化学処理にはオルン
ストン（０デ％ａｔｏ％）が述べている方法がある〔ジ
ャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣ五−ｍｉａ
ｔｒｙン　１　９　６　６年、　２４１巻、３８００〜
３８１０頁〕。

この代りに、Ｄ−２−ＨＡＡ−ハライドヒドロラーゼを
指定する遺伝情報をＤ−２ＨＡＡ−ハライドヒドロラー
ゼ 適当な異種有機体すなわちＤ−２−ＨＡＡ−ハライどヒ
ドロラーゼが自然に生成しない有機体に移すことができ
る。例えば、Ｄ−２−ＨＡＡ−ハライドヒドロラーゼ スミド゛〔カワサキ（ＫαＷαｓａｋｉ）等のアグリカ
ルテャー　アンド　バイオロジカル　ケミストリー（Ａ
ｇｒｉｃｘｌｔｘｒｇ　　ａｎｄ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９８１年，′４５巻，
２９〜３４頁〕は，例えば塩沈殿方法のような公知の方
法〔グエリイ（Ｇｗｅｒｒｔｔ）等，ジャーナル　オブ
　バクテリオロジ−（Ｊｏｓｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、　　　１　　９　　７　　３
年。

１１６巻，１０６４〜１０６６頁〕によって単離して，
例えば塩化セシウム−臭化エチジウム密度勾配遠心分離
法によるような公知の方法によって、さらに精製するこ
とができる。遺伝子は例えば形質転換のような公知の方
法によって異種有機体に導入することができる。この代
シに、例えば細胞抱合によって遺伝子を第二有機体に直
接移すこともできるが、この方法は移動を必要とする〔
ビーチング（Ｂ−αｔｈｉｎｇ）等，ジエイ・ゲン・マ
イクロバイオＡ／　にｆ．Ｇｇｓ．Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ
．　）　１　９　８　３年。

１２９巻，２０７１〜２０７８頁〕。

Ｄ−２−ＨＡＡ−ハライド９ヒドロラーゼの産生に不利
な影響を与えず、また２−ＨＡＡ’ｓＬ−鏡像異性体と
も不利に反応することがないと考えられる適当な異種有
機体の例としては、特に大腸菌。

メチロフィルス・メチロトロプル（％に、我々の英国特
許明細書画１，３　７　０，８　９　２号に記載する菌
株、ＮＣＩＢ４１０５０８〜魔１０５１５及びム１０５
９２〜腐１０５９６）及び枯草菌が挙げろれる。

本発明の第三及び第五態様による方法を細胞内Ｄ−２−
ＨＡＡ−ハライドヒドロラーゼで実施する場合には、適
当な有機体の細胞を通常の増殖培地中で連続法、回外法
または供給回分法によって増殖することかできる。増殖
培地は典型的には、無機塩水溶液と、例えばグルコース
、エタノール、酢酸または２−）ＩＡＡのような適当な
炭素源とから成る。炭素源の濃度は広範囲にわたって変
動し得るが，一般には１％（ｗ／ν）〜５チＣｗ／ｖ）
の範囲である。増殖期には酸素または酸素含有ガスが存
在しなければならない。増殖期中の培地温度はかなり変
化し得るが、通常は２５℃〜３５℃の範囲である。増殖
中の培地のｐＨは５、５〜８．０の範囲、好ましくは６
，５〜７．５の範囲に維持しなければならない。培養物
のサイズは例えば１．５１〜５０．００（ｌの範囲でか
なり変動し得る。

増殖期後に，細胞を本発明の第三及び第五態様の方法に
用いる。細胞は例えば遠心分離またはフロキュレーショ
ンによって回収できる、または前記方法に直接用いるこ
とができる。細胞を回収する場合には、例えばリン酸塩
，炭酸水素塩もしくはトリス（ヒビａキシメチル）アミ
ノメタン緩衝溶液または水のような、有意な細胞増殖を
支持しない緩衝溶液中に細胞を再懸濁させる。再懸濁し
た細胞の濃度は典型的には１〜３０Ｉ（乾燥重量）／Ｉ
である。細胞は２０℃〜４０℃の温度に維持し．ｐＨを
５．５〜９．５に維持する。

次に、培養物を２−Ｉ（ＡＡまたはその適当な誘導体，
例えばその低級アルキルエステルまたは好ましくは，例
えばナトリウム塩もしくはカリウム塩のようなその塩の
混合物と技術と周知の方法によって接触させる。この細
胞懸濁液の生産的な寿命は典型的に＆．１５〜１０００
時間である。この期間後に、細胞を遠心分離及び／また
はフロキュレーション及び／または沖過によって除去す
る。Ｅ清液に新たな細胞を加えて，プロセスをくり返す
ことができる。プロセスの最後に，酸性化した水性反応
混合物から適当な極性溶媒による溶媒抽出によって２−
ＨＡＡを抽出するのが好ましい。用いることのできる極
性溶媒の例は特にジエチル・エーテル、塩化メチレン及
びメチルイソブチルケトンである。連続抽出法を用いる
のが特に好ましいが、細胞分離後゛に （１＞　　水性培地を蒸発させ、残渣を例えばクロロホ
ルムまたは塩化メチレンのような適当な溶媒に溶解する
； （２）水性培地を適当な吸収剤で処理する，例えばイオ
ン交換カラムに通す；または （３）水性培地を目的化合物がその塩として．例えばカ
ルシウム塩として沈殿するように試薬によ□　って処理
する という可能性を排除するわけではない。

酸素圧を減少すると酵素の半減期が増大することを発見
したので，本発明の第五態様による方法は実質的に酸素
を含まない雰囲気下で実施する。

この第五態様の方法は窒素雰囲気で実施するのが好まし
い。

本発明の第三態様及び第五態様に用いる細胞を浸透性化
して、細胞の内外への基質及び生成物の移動を容易にす
る。適当な浸透性化処理方法はフエリツクス（Ｆｇｌｉ
ｚ）　　がアナリテイカル　バイオケミストリイ（Ａｎ
ａｌｙｔｔｅａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９８
２年，１２０巻，２１１〜２３４頁に述べている。

本発明の第三及び第五態様の方法で製造される２−ＨＡ
Ａ　　Ｌ−鏡像異性体は少なくとも８０チ、特に少なく
とも９５％及び特に好ましくは少なくとも９９チの光学
的純度を有する。

本発明を次の実施例に関連してさらに説明する。

実施例中では次の培地を用いた： クエン酸塩緩衝溶液 ０、１Ｍクエン酸（１４．９ｍＪ）と０．１Ｍクエン酸
三ナトリウム（３５．１ｔ／）に蒸留水を加えて５００
ｄにする。生成した緩衝溶液はｐＨ　　５、５を有した
。

（ｇ）　　塩溶液 酸化マグネシウム（ｘｏ．７ｓ，ｐ）、硫酸亜鉛・七水
和物（１，４４ｇ）、硫酸コバルト・七水和物（０，２
８，ｌ、炭酸カルシウム（２，０ＩＩ）、硫酸マンガン
・四水和物（１，１２，ｌ、ホウ酸（０，０６Ｉ）、硫
酸第一鉄・七水和物（４，ｓ、Ｓ＋）、硫酸銅五水和物
（０，２５，９）及び濃塩酸（５１，３ゴ）を別々に水
に溶解した。但し酸化マグネシウムと炭酸カルシウムは
別々に少量の濃塩酸に溶解した。

これらの溶液を混合し、蒸留水に加えて１１とした。

（ｂ）　　ストック溶液Ａ リン酸二水素カリウム（５００，９）、水酸化ナトリウ
ム（１１０１１）及びニトリロ三酢酸（５０ｇ）を蒸留
水に溶解して、２１とした。

硫酸アンモニウム（２００，！Ｆ）、硫酸マグネシウム
・七水和物（２０Ｉり、硫酸第一鉄・七水和物（ＩＩＩ
）及び前記塩溶液の一部（２００＋ｔｔ）に蒸留水を加
えて２１とした。

ストック溶液Ａの一部（１０ｄ）、ストック溶１Ｂｏ一
部（１０＄）及び蒸留水（４８ｍ／　）　全混合し、ｐ
Ｈ７，０〜７．２の水溶液とした。

（＃）Ｂ−１２寒天培地 Ｄｉｆｃｏ　Ｂａｃｔｏ寒天を２．０％　　ｗ／ｖ　　
の濃度になるようにＢ−Ｅ最少培地に加えた、この濃度
では固体化培地が得られた。

培地Ａ 培地Ａは硫酸アンモニウム（ｓ、９／ｌ）。

Ｍｇ５Ｏ，・７）１２０　（ｏ、８１　／ｌ　）　、硫
酸カリウム（０，４５，９／ｌ）、濃リン酸（ｘ、３ｍ
ｌ！／Ａり、１’、５ｏ４−５Ｈ２０（０，０４、？　
／　ｌ　）及び微量元素溶液（６０ｒｔｔｔ／　ｌ　）
から成る水浴液であった。

微量元素＃ＪｆｆＬは銅（５解）％Ｍｓ　（２５ｐＰり
　−ｚｓ（ｚ３ｐｐｍ）及びカルシウム（７２０ＰＩＩ
ＸＩ）を含むものであった。

培地Ｂ 培地Ｂは硫酸アンモニウムＣ１，８１／ｌ）、硫酸マグ
ネシウム（＃ＳＯ，・７Ｈ２０）　　（０，２１／ｌ　
）　。

塩化第二鉄（０，９７ｍｙ／ｌ　）、リン酸水素カリウ
ム（Ｋ２ＨＰＯ４）　（１，９！ｉ／ｌ　）、リン酸二
水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）　（１−５６＆　／
　ｌ　）及び培地Ａに用いたような微量元素溶液Ｃ１ｙ
ｄ／ｌ）から成る水溶液であった。

実施例１ この実施例では、本発明の第一態様による酵素製造を説
明する。

ＨＡ　Ａ’　８が自然に生成する場所（例えば針葉樹林
）及び合成ＨＡ　Ａ’　ｓの保管場所からの土壌サンプ
ル（１，！ｉｔ）を、ＤＬ−２−ＣＰＡのナトリウム塩
またはカリウム塩を２０　ｍＭの濃度で含むＢ。

Ｅ最少培地（１００ａｄ）中で３０℃において３日間イ
ンキュベートした。次に培養物を１．５％ｖｙ／ｖ寒天
で固化させた上記定義の培地サンプルとで連続的に希釈
し、３０℃においてさらに３〜７日間インキュベートし
た。２−ＣＰＡを分解し得る細菌のコロニー（この１つ
はシュードモナス・プチダＮＣ工Ｅ１２０１８であった
）を採取して、さらに羊青製した。

い酵素の検出 段階ｌで単離した１分離したコロニーのサンプルを、２
Ｍ水酸化カリウムの添加によってｐＨ７，０±０．１に
調節したＢ−Ｅ最少培地（２１）中、３０℃において別
々に増殖させた。培養物を１０００デｐｔｔ％で攪拌し
、空気を０．５１７分で供給した。ＤＬ−２−ＣＰＡの
カリウム塩を発酵器に３モル／時の速度で加えた。

１６時間後に、培養物を５０００Ｇ、２０分間の遠心分
離によって回収し、細胞を４℃、　ｐＨ７の２５ｍＭ’
）ン酸塩緩衝溶Ｈ（ＮａＨ２ＰＯ４）で洗浄し、同緩衝
溶液１０ｍｄ中に再懸濁させた。これらの細胞を１２０
００１ｓｉ　　のフレンチ細胞プレスに２回通すことに
よって破壊し、未破壊細胞と細胞破片を１２０．００’
ＯＧ、１時間の遠心分離によって除去して、細胞を含ま
ない抽出物を得た。。

細胞を含まない抽出物のサンプルにポリアクリルアミｈ
４Ｊゲル電気泳動を２通りに実施した〔ハート９マン（
Ｈａｒｄｍａｎ）等、ジャーナ／Ｉ／　　オフ　ゼネラ
ル　マイクロバイオロジー（ＪＯ％ｒｎａＬ　ｏｆＧｅ
ｎｅｒａｌ　　’ｋＡｔｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　　　
１　９　８　１年、　１２３巻、１１７〜１２８頁〕。

電気泳動後に、前記のハードマン等の参考文献に述べら
れているように。

各ゲル対の一方を５０惧ＭＤ−２−ＣＰＡ含有緩衝溶液
中でインキュハートし、他方を５０ｍＭＬ−２−ＣＰＡ
含有緩衝溶液中でインキュベートした。

この方法は、シュードモナス・プチダ　ＮＣより１２０
１８中に２種類のノーライドヒドロラーゼが存在するこ
とを明らかにした。一種類の酵素はＬ＋　２＋ＣＰＡに
対する活性を有するが、Ｄ−２−ＣＰＡに対する活性を
有さす、第二の酵素はＤ−２−ＣＰＡに対する活性を有
するが、Ｌ−２−ＣＰＡに対する活性を有さす、すなわ
ち、本発明の第一態様による酵素であった。

（Ｄ−２−ＣＰＡとＬ−２−ＣＰＡは７−（八）等がジ
ャーナル　オプ　ザ　アメリカン　ケミカル　ノサイア
テイ（Ｊｏｓデｓａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍげｉａａｎ
Ｃｈｇ惰１ｃａｌ　Ｅ３ｏｃｉａｔｙ）　１９５４年、
７６巻、　６０５４〜６０５８頁に述べられているよう
に製造することができる。） ３、デハロゲナーゼの単離 シュードモナス・プチダ　ＮＣＩＢＩ　２０１８から細
胞を含まない抽出物の一部（２５罰）を、ｐＨ７，５の
２５ｍＭ）リス／サルフェート緩衝溶液ト予備平衡させ
たＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−ＳｇｐｈａａｇＬカラム（直径４
５顛、高さ６０ｃｒｒＬ）Ｊ：に装入した。このカラム
を純粋なこの緩衝溶液及び次に連続的に０．１５Ｍ、０
．２Ｍ及び０．５Ｍ塩化カリウムを含有する緩衝溶液２
００ｄずつでＬｏｏｍ／時の流速度で溶出した。

これらの４フラクシヨンのハライドヒビロラーゼ活性を
１段階２に述べたように基質としてＬ−２−ＣＰＡ及び
Ｄ−２−ＣＰＡを用いて分析した。

Ｄ−２−ＣＰＡＫ対する活・性は０．１５Ｍフラクショ
ンのみにおいて検出された。Ｌ−２−ＣＰＡに対する活
性は０．５Ｍ７ラクシヨンにおいてのみ検出された。純
粋な緩衝溶液フラクション及び０、２　Ｍ　７ラクシヨ
ンには、ノ・ライドヒドロラーゼ活性は検出されなかっ
た。

０、１５Ｍ７ラクシヨンのノーライドヒドロラーゼはＤ
−２−ＣＰＡに対する活性に最適なＪＩＨ８．８〜９．
０を有する。これは有機緩衝溶液（トリス／サルフェー
ト）及び無機緩衝溶液（炭酸水素塩／炭酸塩）中で良好
な活性を有し、、Ｈを８．８〜９、０に調節した非緩衝
化培地（例えば蒸留水）中で活性を示す。

この酵素は、０．１Ｍ）リス／サルフェート、ｐＨ９緩
衝溶液中、４℃で貯蔵した場合に１約１０日間の半減期
を有する。

この酵素活性はＩＭまでのＤＬ−２−ＣＰＡによって阻
害されず、１Ｍ９度までの反応生成物すなわち塩化物イ
オン及びラクテートによって阻害されなかった。

実施例２ 、この実施例では％Ｄー２ーＨＡＡノ為ライト１ヒト９
ラーゼの使用を説明する。

シュードモナス・プチダ　ＮＣＩＢ１２０１８からのＤ
−２−ＨＡＡハライドヒドロラーゼを含む、実施例１１
段階３で得た０．１５Ｍ溶出フラクションの一部（１５
０ｍ／）と００５Ｍ炭酸水素塩緩衝溶液（Ｎ　ａＨＣＯ
　３／’に’　ａ　２　ＣＯ３　）の混合物に，３０℃
においで攪拌しながら、ＤＬ−２−ＣＰＡカリウム塩を
加え，２Ｍ水酸化カリウム水溶液を添加して，Ｈを９．
０に維持した。塩化物イオンの放出を監視することによ
って、反応をフォローアツプした。塩化物イオン放出が
終了した後，さらにＤＬ−２−ＣＰＡの追加量を加えた
。５時間後に、塩化物イオンの濃度は８　７　ｍ　Ｍで
あった。これにさらにＤＬ−２−ＣＰＡ１６，！ｉ’　
（　１　５０ｍｏＬｍ）を加えた。

反応混合物をｐＨ４に酸性化し．沈殿した蛋白質を１０
，ＯＯＯＧ，３０分間の述心分離によって除去した。透
明な上＃液をさらにｐＨ２．ｏに敵性化し、塩化メチレ
ンで連続的に抽出した，、塩化．メチレンを蒸発させて
粗２−ＣＰＡ　　７．３．！ｉ’を得。

これを蒸留して無色油５．０６，９の生フラクションを
得た。この油は〔α）３０４　　（→１２．５°　（Ｃ
＝　　　　　　□１、７７　、　ＣＣｌ４）　　の旋光
度を有し、Ｌ：Ｄ比９２：８の２−ＣＰＡに相当した（
すなわち８４チ鏡像異性体過剰）。生成物は工ＲとＮＭ
Ｒスペクトルによって同定した。

実施例３ この実施例はＬ−２−ＣＰＡを脱ハロゲン化できない突
然変異菌株の製造を説明する。

Ｌｓｂｒｉα　液体培地中のシュードモナス・プチダＮ
ＣｌＢ１２０１８を振とう水浴上で３０℃において一晩
増殖させた。これを新たなＬｕｒｉａ　　Ｗ体培地に継
代培養し、上記条件で増殖させて、５５０ｎｍで測定し
た光学密度（以下では便宜上０Ｄ−５５０と呼ぶ）０．
５を得た。

この培養物の２通りのサンプル（１５ｄ）を遠心外離し
、細胞にレットをクエン酸緩衝溶液（１５ｄ）中Ｎ−メ
チルーＮ′−二トロングワアニジン（０，７５■）の溶
液に別々に再懸濁させた。

混合物を往復励振と５機上で３０１：において４５分間
インキュベートした。

細胞を遠心外離によって回収し、Ｂ−Ｅ最少培地への再
懸濁及び遠心分離によって２回洗浄した。

はレットをＥ−Ｅ最少培地（５１ｄｌ）に懸濁させ、ア
リコート（１ｄ）を振とう機フラスコ中のＢ−Ｅ最少培
地（２ｄ）と０．３％ピルビン酸ナトリウムに接種した
。

増殖後に、培養物の０Ｄ−５５０を測定し、培養物を希
釈し、約１０００細胞／ｒｄ（！：Ｌ、　Ｂ　−Ｅ寒天
培地とピルビン酸ナトリウム（１０ｔｈｍ、ｏｌｇ）か
ら成るプレート上にアリコート（０，１ｍＡりを展げ、
コロニーが出現するまで、３０℃でインキュベートした
。コロニーのサンプルを１０　倶Ｍ　Ｄ　−２−ＣＰＡ
と１０ｍＭＬ−２−ＣＰＡを含有するＢ−Ｅ寒天培地プ
レート上にレプリカ培養した。

レプリカ・プレート対を比較し、コロニーを単離　。

Ｌ７’ｃ。コロニーはＬ−２−ＣＰＡＪ：では増殖した
が、Ｄ−２−ＣＰＡｐでは増殖しなかった。これらのコ
ロニーをＬ−１１）−２−Ｃｆ’Ａ及びピルビン酸塩上
での増殖に関して比較し、好ましい表現型を偏れ、殆ん
ど逆もどりを示さないコロニーを次のテスト用に選択し
た（表１）。

表１ 単離物ノサンプルをＤＬ　−２−ＣＰＡ　（２０ｍＭ）
含有ｏＢ−Ｅ最少培地（２０ｄ）中、３０℃において振
とうさせながら一晩増殖させた。培養物を１０，０ＯＯ
Ｇにおいて２０分間遠心５）離し、細胞をトリス／サル
フェート緩＠溶液（，０，１Ｍ。

ｐｕ　ｓ、ｓ　）　（１０ＭＪり中に再懸濁させた。各
細胞懸濁液を２アリコー）Ｋ分割した。

各アリコート対の１つにｆ）−２−ＣＰＡを４０ｍＭま
で加え、他方はＬ−２−ＣＰＡを４０ｍＭまで加えた。

次に各アリコートを３０℃において振とうしながら２４
時間インキユベートシ、塩化物イオンの放出をフォロー
アツプした。

一種類の突然変異体（以下では便宜］、ＡＪＩ−２３と
呼ぶ）はＤ−２−ＣＰＡから細胞乾燥重量１１１につき
塩化物８．５　ｍｔｎｏ　Ｌ　ａ／時の速朋で、塩化物
を放出したが、Ｉ、−２−ＣＰＡからは放出しなかった
。

実施例４ この実施例はＤ−２−ＣＰＡから塩化物イオンを放出す
るがＬ−２−ＣＰＡからは放出することのできない突然
変異菌株の使用を説明する。

突然変異株、実施例３で製造したＡ、Ｔｌ−２３のサン
プルを、炭素源として０．３　％　ｗ／ｖ　　ピルビン
酸す）　ＩＪウムを含有するＢ−Ｅｉ１体培地とで、０
．１／時の希釈率によるケモスタット培養（５０〇−）
として、３０℃においてＬｖ／υ／分　で通気しながら
増殖させた。ケモスタット反染Ｉビットか　　　−らの
使用済み培養物５１を遠心分離によって回収した。

２−ＣＰＡラセミ体のカリウムｆｉ２００　ｔｎｍｏ　
ｌを含有する０、１Ｍ炭酸水素す）　ＩＪウム／′炭酸
塩緩衝溶液（１８０ｄ）ｐＨ中の細胞を再懸濁させた。

反応混合物を３０℃において５００　ｒｐｍ　　で攪拌
し、４Ｍ水酸化カリウム水溶液を添加して、Ｈを８．８
に維持した。２２時間後に、廃棄ポットからの細胞をさ
らに加え１反応をさらに２０時間続けた。次に遠心分離
によって細胞を除去した。

上清液を濃硫酸によってｐＨ，４に酸性化し、生成する
沈殿を遠心分離によって除去した。透明な溶液を塩化メ
チレンで抽出し、２−ＣＰＡのＬ−鏡像異性体（３，５
１を単離した。これは光学純度８２％を有することがわ
かった（６４％鏡像異性体過剰）。

実施例５ この実施例は本発明の第五態様による突然変異菌株の鏡
像異性体純度の高いＬ−２−１１’Ａ製造への利用を説
明する。

実施例３で製造した突然変異菌株Ａ、Ｔｌ−２３のサン
プルを、実施例４で説明したように、ケモスタット培養
として増殖させた。

培養物の一部（４００ｄ）を用いて、培地Ａ（６１）に
接種し、混合物に０．７５１／／１３／時の率でグルコ
ースを連続的に加えた。混合物を５０゜ｆｐｍ　で攪拌
し、空気を４１７５）で通気し、２ＭＮαＯＨの添加に
よってｐ）１を７．０に維持し、温度を３０℃に維持し
た。２４時間後に、細胞密度が細胞乾燥重量的８ｇ／ｌ
になったときに、グルコースの添加を停止した。次にＤ
Ｌ−２−Ｃ）’Ａを２０ｍｔｎｏ１ｇ／時の速度で２０
時間加えた。細胞を遠心分離によって回収した。

回収した細胞の一部（乾ｆｉ富量８．ｌｉ’）を、ＤＬ
−２−ＣＰＡナトリウム塩（１０８＃）を含有する５０
ｍＭリン酸カリウム（９００，ｍＪ）　（ｐＨ７，４）
中に再懸濁させ、この混合物を２５　Ｏｒｐｍ　　で攪
拌し、温度を３０℃に維持し、混合物のとに２素を通過
させて、混合物の上方に本質的に酸素を含まないブラン
ケットを維持し、ｐＨを７．４出０．２に維持するため
に必要に応じて４Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加えた。

２０時間反応させた後に、塩化物イオンはもはや放出さ
れなくなってから、反応混合物を２つの部分に分割した
（部ｆ＋ＡとＢ）。部分Ａｔ−硫酸によってｐＨｌに酸
性化し、けいそう土を通して濾過し、塩化メチレンによ
って連続的に抽出し、塩化メチレン抽出物を油状物（２
５，５２ｆ）になるまで、蒸発乾燥させた。ショートパ
ス蒸留によって、０．８７％四塩化炭素溶液として〔α
〕ゎ−１３，３°を有するフラクションを得た。このフ
ラクションはＮＭＲによって２チ未満のＤ−）−ｃｐＡ
を含むＬ−２−ＣＰＡ（すなわち９６％鏡像異性体過剰
）であることが判明した。

実施例に の実施例は適当な担体に固定した、本発明第三態様によ
る細菌の存在下でのＤ−２−ＣＰＡからの塩化物イオン
の放出を説明する。

実施例４で述べたようにケモスタットで増殖させたＡＪ
エニー３（乾燥型ｉ０．４．９）、３（１？６／ν　ア
クリルアミド水溶１（６，１ｄ）、２％Ｗ／τビスアク
リルアミド水溶）［（１，２５ｄ）及びＩＭ）リス−サ
ルフェート緩衝溶液ｐＨ８，７（１ｏ、７ｓｙ）から成
る混合物を真空下で脱気し。

次に、Ｎ、　Ｎ、　Ｎ、ＩＮＩ、−テトラメチル−エチ
レンジアミン（３７μｌ）と１０チｗ／ｖ　過硫酸アン
モニウム（６０μｌ）を加えて、重合を開始させた。

３０分鋭に、生成した固定化細胞含有固体ゲルを１０ｍ
注射器のオリフィスから押し出し、１Ｍトリス／サルフ
ェート緩衝溶液で洗浄した。

前記固定化細胞をＤＬ−２−Ｃ：ＰＡナトリウム塩（５
ｎｃｍｏｌｅ）含有の０．５Ｍリン酸塩緩衝溶液（ｊｌ
Ｈ８）（１０ｍ／）中、３０℃において緩和に振とうし
ながらインキュイードした。塩化物イオン放出をフォロ
ーアツプすることによって、細胞活性を評価した。塩化
物イオン放出は少なくとも２００時間続き、このとぎに
塩化物イオン引戻は１３０溝Ｍになった。

実施例７ Ｄ−２−ＨＡＡハライド９ヒドロラーゼを含む環境から
の付加的微生物の単離　、 塩素化酸を汚染物として含む、イギリスの各地から集め
た土壌サンプル（２１）を、唯一の炭素源として２０ｍ
Ｍ　　ＤＬ−２−ＣＰＡナトリウム頃を含有する無機塩
培地（培地Ｂ）１００ｘｅ中で。

３０℃において振と５しながらインキュベートした。３
日後に、このようにして製造した、各濃縮培養物のアリ
コートを連続希釈後に上記の寒天同化培地上で培養した
。２〜５日後に出現した微生物コロニーを単離し、標準
の微生物学的方法によって純粋形になるように培養した
。

各有機体のサンプルを同培地２００ｄ中で１６時間増殖
させた陵、細胞を遠心分離によって回収し、２０ｍＭ）
リスサルフェート緩衝溶液（ｐＨ７，８）中に再懸濁さ
せて、乾燥重量的５０１７１の細胞密度を得た。Ｌ−２
−ＣＰＡ％Ｎａ”ｔｌＸとＤＬ−２−ＣＰＡ、Ｎｇ＋塩
の両方の各有機体による脱塩素化速度を実施例２に述べ
たように測定した。Ｌ−’２−ＣＰＡよりも１）Ｌ−２
−ＣＰＡに対して高い脱塩素化速度を示した有機体をさ
らに研究した（表２）。

このような有機体の細胞を含まなす抽出物を実施例１に
述べたように製造し、これらのデハロゲナーゼ補体を前
述したように電気泳動によって調べた。ゲルをＬ−２−
ＣＰＡ及びＤ−２−ＣＰＡに対する活性に関して調べた
。各デハロゲナーゼ蛋白質の基質特異性が注目された（
表３）。Ｄ−２−ＣＰＡＫ％異的なデハロゲナーゼがＬ
−２−ＣＰＡに対して活性を示さない仁とが発見された
。

表２ 表３ 実施例８ Ｘ／　ニート”モナス・プチダと突然変異体Ａ、Ｔｌ−
２３からのＤ−２−ＨＡＡ−ハライドヒドロラーゼの、
ラセミ体混合物としてのＤ−２−ブロモプロピオン酸（
Ｄ−２−ＢＰＡ）選択的脱臭素化への利用。

実施例１に述べたように製造した酵素製剤の１００μ！
アリコートを０．５Ｍリン酸カリウム緩衝溶液ｐｌｉ７
−３中で種々の濃度のＤＬ−２−ＢＰＡ。

Ｎ♂塩とともに３０℃において１６時間インキュイード
した（最終量５ゴ）−。

実施例３におけるように製造した突然変異体ＡＪｒ−２
３をと記と同様に処理した（最終細胞濃度、乾燥型［１
１／１１　）。１６時間後に１反応混合物中の臭化物イ
オン量をと記と同様にＭａデｉｏ１＆５Ｃｋｌｏデｏ−
０−カウンターで測定した。各場合に、ＤＬ−２−ＢＰ
Ａの５０チが脱臭素化され、異性体特異性であることを
示した（表４）。

実施例９ 突然変異有機体Ａ、Ｔｌ−２３に含まれるＤ−２−ＣＰ
Ａを用いた。手工業的規模での鏡像異性体高過剰のＬ−
２−ＣＰＡの製造。

突然変異体ＡＪエニー３を０．３％Ｗ／ν　ピルビン酸
ナトリウム及び１０ｍＭＤＬ−２−ＣＰＡ含有の、実施
例４で用いた無機塩培地の培養物２×６００ｄ中で３０
℃において増殖させた。２４時間後に１次の成分： ＭＪｉｌＳＯ４・７Ｈ２０ｔ□　ｔ　ｐ７．ｇ（ＮＨ４
）　２°５０４６．３ｇ／１ Ｋ２Ｓ０４　　　　　　　　　　　０．５７１／ＩＦ’
＊ＳＯａ°７Ｈ２００，０５！ｌ／／ＩＭｓＳＯ４−７
Ｈ２００，００７８１１／ＩＺ％ＳＯ４・７Ｈ２００，
００７８１／ＩＣｘｂＯ４・７Ｈ２００，００１５１／
ｌＣａ１ｌ　２　　、　　　　　　　　　　　　０．１
５１！／１Ｈ２Ｓｏ、（濃）　　　　　　　　　　　０
．１５　ｆ／／１グルコース　　　　　　　　　　　　
　８．０１７１リン酸（比重１．７５　）　　　　　　
　　　０．８８１１／ｌを含有する培地５００１中で両
培養物をインキュ（−トシた。

これを３０℃において８００　ｒｐｍ　　で攪拌し。

アンモニアの添加によってｐＨを７．０に維持した。

２０時間後に、さらに５０ｍＭＤＬ−２−ＣＰＡを含む
新しい培地を絶えず添加することによって（希釈率０．
１７時）、連続培養した。培養物を同じ率で取り出しく
細胞乾燥重量５９／ｌ）、遠心分離により濃縮して１０
％ｗ／ｗ　細胞スラリーを得た。

４５０１一温度調節ジャケット付き容器内の次の成分： 水１２８ｋｌ？ ＤＬ−２−ＣＰＡ　　２３ゆ　及び リン酸二水素ナトリウム　２時 を含有する溶液に、３２チ水酸化ナトリウム溶液を加え
てｐＨを６．０に高めた。次に２０　％　ＮｔＬＱＨ液
を徐々に加えることによってｈ　ｐｆｉをさらに７．２
に高めた。容器ジャケットを通して水を循環させて、温
度を３０℃に維持した。容器内容物を６０　ｒｐｍ　　
で攪拌した。

上述のように製造した、細胞２に９（乾燥電量）を含有
する細胞スラ１７−２０ｋｌ？をこの容器に装入し、内
容物と方に窒素ブランケットを供給した。

ＮａＯＨ液の添加によって判定して全てのＤ−２−ＣＰ
Ａが脱塩素化されるまで、ｐＨを７．２に制御して反応
を進行させた（７．５時間〕１次に硫酸（７８％）を加
えて、ｐＨを１．５に減じた。

Ｃ１ａｒｃ−げｌｏ　　１ｃ濾過助剤）（６ｋＮ）を加
え、１時間濾過した。次に、このパッチをフィルタープ
レスに通し、透明なＰ液を回収した。

Ｆ’１ｇ！ｃの一部（８００，１をメチルインブチルケ
トン（ＭよりＫ）（４００１１）に加え、室温で２０分
間攪拌した。次に内容物を沈降させて分離して、水性ラ
フィネートとＭよりＫ抽出物とを得た。水性ラフィネー
トを次にＭよりＫで抽出した。

Ｃ１ａｒｃａｌｆｌｎ　１　（１０１１）をＭよりＫ抽
出物に加え１次に濾過して１ＭよりＫ抽出物を一緒にし
た。

ＭよりＫ抽出物を反応器に装入し、Ｎα０）Ｉ（１３，
４７％　ｗ／ｗ　溶液、８６．７．９を加えた）。５分
間攪拌し、沈降分離させた後、透明な水層に硫酸を加え
て、ｐａ’ｙ、ｏに調節し％２−ＣＰＡ、ナトリウム塩
の２８〜３０チ　ｗ／ｗ溶液を得た。ＮＭＲによる分析
（実施例２はこれが９８％鏡像異性体過剰（Ｌ−２−Ｃ
ＰＡ　　９９．４％：　ｌ）　−２−ＣＰＡＯ，６１で
Ｌ−２−ＣＰＡナトリウム塩であることを示した。

実施例１０ 本発明の第五態様による細胞を含まない酵素の嫌気性使
用。

シュードモナス・プチト９菌株ＮＣより　　１２０１８
を増殖させ、これから実施例１に述べたようにＤ−２−
ＨＡＡ−ハライドヒドロラーゼ酵素を単離した。細胞を
含まない抽出物の０１１５Ｍフラクションの一部（１ｄ
）をＤＬ−２ＣＰＡナトリウム塩５ｍｍｏｌ−及びトリ
ス／サルフェート緩衝液（ｐａ９．ｏ）らｒｎｒｎｏ　
Ｌ　ｍ　　と混合して全体量を１０−とした。これを２
通りに実施した。この１つのサンプルを１００ｍ／−三
角フラスコに入れ、３０℃の振と５水浴（６０往復／分
）中でインキュベ−トシた。第二サンプルも同様にイン
キュベートしたが、この場合には窒素雰囲気を用いた。

両方の場合に、Ｄ−２−ＣＰＡかもの塩化物イオン放出
をフォローアツプした。結果は表５に示す。この表から
窒素雰囲気下では酵素が空気雰囲気下よりも高い率で長
期間にわたって塩化物イオンを放出することがわかる。

表５ 空気または窒素雰囲気下でインキュベートしたＤ−２−
ＢＡＡハライドヒドロラーゼによるＤ−２。

実施例１１ 本発明の第五態様による細胞結合酵素のｔＩ！気性使用 突然変異菌株ＡＪエニー３を実施例３に述べたように製
造し、実施例１のシュードモナス・プチダＮＣＩＢ　　
１２０１８の増殖に用いた条件下で増殖させた。

製造した培養物を遠心分離して、細胞スラリーを得た。

細胞乾燥重量３．２ＩＩに相当するスラＩＪ−の一部を
、ＤＬ−２−ＣＰＡナトリウム塩２５０ｍｍｏＬ−とリ
ン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ７，８）５０ｍｍｏ１ｇ　
　含有の水５００ｄ中に懸濁させた。

これをＩＡ！ガラス容器中で３０℃において攪拌しなが
ら（２５０ｒｐｍ）、インキュは一部した。２ＭＮａＯ
Ｈを添加して、ｐＨを７．４に維持することによって、
Ｉ）−２−ＨＡＡ−ハライド上１０ラーゼの活性をフォ
ローアツプした。第二の反応では。

窒素を反応混合物の表面とに通して、嫌気性雰囲気を維
持した。

結果を表６に示す。これらの結果は窒素雰囲気下の反応
が空気雰囲気下の反応に比べて高い率で長期間接続する
ことを示した。

表６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）細菌によつて産生されるＤ−２−ＨＡＡハライドヒ
   ドロラーゼから成る、細胞を含まない酵素組成物であつ
   て、Ｌ−２−ＨＡＡまたはその誘導体を代謝し得る酵素
   活性を実質的に有さない酵素組成物。 ２）Ｄ−２−ＨＡＡから成り、Ｌ−２−ＨＡＡまたはそ
   の誘導体を代謝し得る酵素を含まない細菌。 ３）２−ＨＡＡのＤ−鏡像異性体とＬ−鏡像異性体の混
   合物中のＬ−鏡像異性体の濃度を高める方法において、
   Ｄ−鏡像異性体の少なくとも一部が２−ヒドロオキシ−
   アルカノン酸またはその誘導体に転化するような条件下
   で、この混合物をＤ−２−ＨＡＡハライドヒドロラーゼ
   によつて処理する段階から成る方法。 ４）適当な細菌を培養し、細胞を溶解させ、可溶な蛋白
   質フラクションをそれから分離し、目的酵素組成物を単
   離することから成る細胞を含まない酵素組成物の製造方
   法。 ５）２−ＨＡＡのＤ−鏡像異性体とＬ−鏡像異性体の混
   合物のＬ−鏡像異性体の濃度を高める方法において、Ｄ
   −鏡像異性体の少なくとも一部が２−ヒドロオキシアル
   カノン酸に転化されるような条件下で、この混合物をＤ
   −２−ＨＡＡハライドヒドロラーゼで処理する段階を嫌
   気性条件下で実施することから成る方法。 ６）特許請求の範囲第２項記載の細菌の発生源として用
   いることのできる菌株ＮＣＩＢＮｏ．１２０１８、Ｎｏ
   ．１２１５８、Ｎｏ．１２１５９、Ｎｏ．１２１６０及
   びＮｏ．１２１６１ならびにこれらの誘導体。 ７）２−ＨＡＡが２−ブロモ−プロピオン酸または２−
   クロロ−プロピオン酸である特許請求の範囲第３項また
   は第５項記載の方法。 ８）２−ヒドロオキシアルカノン酸の製造に用いる特許
   請求の範囲第３項、第５項または第７項記載の方法。 ９）２−ヒドロオキシアルカノン酸が乳酸である特許請
   求の範囲第８項記載の方法。 １０）Ｄ−２−ＨＡＡハライドヒドロラーゼ処理段階を
   窒素雰囲気下で実施する特許請求の範囲第５項記載の方
   法。 １１）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の
   菌株である特許請求の範囲第２項記載の細菌。 １２）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、
   メチロフイルス・メチロトロプル（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈ
   ｉｌｕｓｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ）または枯草菌
   （Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｅｓ）の菌株から誘導
   される特許請求の範囲第２項または第１１項記載の細菌
   。