JP2842570B2 - クロロまたはブロモアルカン酸の鏡像異性体の混合物におけるｄ−鏡像異性体を選択的に加水分解する酵素によってｌ−クロロ又はブロモアルカン酸を製造する方法 - Google Patents
クロロまたはブロモアルカン酸の鏡像異性体の混合物におけるｄ−鏡像異性体を選択的に加水分解する酵素によってｌ−クロロ又はブロモアルカン酸を製造する方法Info
- Publication number
- JP2842570B2 JP2842570B2 JP60239246A JP23924685A JP2842570B2 JP 2842570 B2 JP2842570 B2 JP 2842570B2 JP 60239246 A JP60239246 A JP 60239246A JP 23924685 A JP23924685 A JP 23924685A JP 2842570 B2 JP2842570 B2 JP 2842570B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid
- cpa
- enzyme
- cells
- enantiomer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/56—Lactic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
- Y10S435/876—Pseudomonas fluorescens
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
- Y10S435/877—Pseudomonas putida
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は２−ハロアルカン酸製造における酵素の利用
に関する。 ２−ハロアルカン酸、例えば２−クロロプロピオン酸
（以下では、便宜上「２−CPA」と呼ぶ）は特にピリジ
ルオキシ−フエノキシ置換アルカン酸（以下では便宜上
「PPAA′ｓ」と呼ぶ）の製造における中間体として有用
である。或る種のPPAA′ｓ、例えばＤ−２−（４−５−
（トリフルオロメチル−２−ピリジルオキシ）フエノキ
シ）プロピオン酸とその低級アルキルエステルは、我々
のヨーロツパ特許出願明細書第0003890A号にさらに詳し
く述べるように、特にイネ科植物に対する除草性化合物
として有用である。 「２−ハロアルカン酸」（以下では、便宜上「２−HA
A′ｓ」と呼ぶ）はここでは、カルボキシル基に隣接す
る炭素原子に１個のフルオロ、クロロ、ブロムまたはヨ
ード・ラジカルを有し、直鎖または分枝鎖であるアルキ
ル基が２〜６個の炭素原子を含むアルカン酸を意味す
る。このアルキル基が、以下で定義する酵素または細菌
の不利に反応しない極性置換基を有する可能性も除外さ
れるわけではない。 ２−HAA′ｓ中及びPPAA′ｓに含まれるアルカン酸残
基中の２−炭素原子が非対称性炭素原子であり、このた
めこの化合物が２つの鏡像異性体形で存在し得ることは
理解されよう。これらの形体の１つをＤ−絶対立体配置
すなわち右旋性グリセリルアルデヒドと同じ絶対立体配
置を有し、他の形体はＬ−絶対立体配置を有する。これ
らの鏡像異性体は互いの鏡像であり、光学的に活性であ
り、平明偏光を逆方向に回転させる。 ヨーロッパ特許出願明細書0003890A号では、特定のPP
AAのＤ鏡像異性体がＬ鏡像異性体よりも大きい除草活性
を有することを述べている。除草剤「ジクロルプロツプ
（Dichlorprop）」と「メコプロツプ（Mecoprop）」が
Ｄ（＋）異性体のみ除草活性を有するラセミ化合物とし
て製造されることは、英国作物保護会議（the British
Crop Protection Council）によつて刊行された、シー
・アール・ワーシングによる編集の「殺虫剤マニユアル
（the Pesticides Mannual）」第７版,184頁と345頁に
も述べられている。 さらに、PPAA′ｓのＤ−鏡像異性体が対応する２−HA
AのＬ−鏡像異性体から製造され得ることもヨーロツパ
特許出願明細書第0003890A号に述べられている。 ラセミ混合物の光学異性体分離に基づく従来の方法を
用いる２−HAA′sL−鏡像異性体の製造は、費用がかか
る傾向がある。我々はこのような製造のための生化学的
方法を今回、開発した。この方法は２−HAAのＤ−鏡像
異性体を選択的に脱ハロゲン化して２−ヒドロキシアル
カン酸を製造し、２−ヒドロキシアルカン酸混合物から
2HAA L−鏡像異性体を分離することに基づくものであ
る。さらに、２−ヒドロキシアルカン酸がラクテートの
Ｄ−鏡像異性体である場合には、この方法はＬ−鏡像異
性体の営利的に魅力ある製造方法になる。我々の同時係
属英国特許出願第8413155号にさらに詳細に述べるよう
に、Ｄ−ラクテートはワルデン反転によつて、例えば２
−CPAの特にＬ−鏡像異性体を製造するのに用いられ
る。 ２−CPAのＤ−鏡像異性体及びＬ−鏡像異性体の両方
の立体配置の反転または保持のいずれかによるラクテー
トへの転化を触媒する酵素が公知である〔ウエイトマン
（Weightman）等のジヤーナル・オブ・ジエネラル・マ
イクロバイオロジイ（Journal of General Microbiolog
y）,1982年,128巻,1755〜1762頁〕。２−CPAのＬ−鏡像
異性体のみの反転によるラクテートへの転化を触媒する
酵素も公知である〔リツトル（Little）等、ヨーロピア
ン・ジヤーナル・オブ・バイオケミストリイ（European
Journal of Biochemistry）,1971年,21巻,99〜109
頁〕。しかし、２−CPAのＤ−鏡像異性体のみをラクテ
ートに転化させる酵素は今までに知られていない。我々
は今回、２−HAA′ｓもしくはその適当な誘導体の２−
ヒドロキシ化合物への転化を触媒することはできるが、
２−HAA′ｓのＬ−鏡像異性体もしくはその適当な誘導
体の２−ヒドロキシ化合物への転化を触媒することはで
きない酵素を発見した。 ２−HAA′ｓのＤ−鏡像異性体もしくはその適当な誘
導体の２−ヒドロキシアルカン酸もしくはその適当な誘
導体への転化を触媒することはできるが、２−HAA′ｓ
のＬ−鏡像異性体もしくはその誘導体からのハロゲン残
基の放出を触媒することはできない酵素を以下では便宜
上「Ｄ−２−HHA−ハライドヒドロラーゼ」と呼ぶこと
にする。 本発明は、２−クロロまたはブロモアルカン酸のＤ−
鏡像異性体とＬ−鏡像異性体との混合物中におけるＤ−
鏡像異性体を選択的に加水分解する酵素であるＤ−２−
クロロまたはハブロモアルカン酸ハライドヒドロラーゼ
で当該混合物を処理することによってＤ−鏡像異性体の
濃度を減少させ２−クロロまはたはブロモアルカン酸の
Ｌ−鏡像異性体を得る方法を提供する。我々のヨーロツ
パ特許出願明細書第0003890A号にさらに詳しく述べるよ
うに、カルボキシル基が適当な誘導体の形態である可能
性を排除するわけではないが、カルボキシル基は遊離形
または、金属イオンが細胞もしくは酵素と不利に反応し
ないような、遊離形の金属塩の形態であることが好まし
い。金属イオンは元素周期律表の第I A属の金属から誘
導されるものであることが好ましいが、ナトリウムまた
はカリウムであることがより好ましい。 本発明においては如何なる種属の細菌も用いられる
が、シユードモナス（Pseudomonas）属の菌株、特にシ
ユードモナス・プチダ（Pseudo−monas putida）または
シユードモナス・フルオレツセンス（Pseudomonas fluo
rescens）種属の菌株が適切である。 本発明において細菌を突然変異または遺伝操作によつ
て誘導し、本発明の第一態様による酵素組成物を単離す
るためのソースとして用いることのできる５種類の菌株
は、ザ ナシヨナルコレクシヨン オブ インダストリ
アル バクテリア（the National Collection of Indus
trial Bacteria）〔イギリス，スコツトランド，アバー
デイーン，アベイロート135,郵便私書箱31〕に寄託され
ており、次の受入れ番号を与えられている： 1. シユードモナス・プチダ NCIB12018 2. シユードモナス・フルオレツセンス NCIB12159 3. NCIB12160 4. NCIB12161 5. シユードモナス・プチダ NCIB12158 ２−HAA′ｓのＬ−鏡像異性体とともにまたはこれの
代りに２−ヒドロキシアルカン酸を製造するのに用いた
場合の本発明の方法も、特に２−ヒドロキシアルカン酸
が乳酸であるならば本発明の範囲に含まれる。 前記で定義したようなＤ−２−HAA−ハライドヒドロ
ラーゼは例えばシユードモナス・プチダNCIB12018のよ
うな細菌から、酵素技術で周知の方法、例えば吸収、溶
出及び沈降法によつて単離することができる。例えば、
適当な有機体の細胞を例えば細胞のフレンチプレスで破
壊する。ホモジネート懸濁液を例えば遠心分離または
過のような通常の生化学的分離法によつて、固相と液相
に分離して、適当な緩衝溶液中の細胞を含まない抽出物
が得られる。適当な緩衝溶液には、特にリン酸塩、トリ
スヒドロキシメチルアミノメタン（「Tris」）、炭酸水
素塩、グリシン、イミダゾール等がある、緩衝溶碇の濃
度は典型的には1mM〜200mMの範囲であり、例えば約25mM
である。 細胞を含まない抽出物は特に分子量及び／または荷重
に応じて分子を分離し得る分別方法、例えば限界過、
例えばポリアクリルアミドゲル上での電気泳動または例
えばDEAE−Sephacelカラム上でのクロマトグラフイを用
いて、分別することができる。適当なフラクシヨンの確
認及び目的の酵素活性を有する酵素のそれからの単離は
当技術上で公知の方法、例えばウエイトマン（Weightma
n）等がジヤーナル オブ ゼネラル マイクロバイオ
ロジー（Journal of General Microbiology）1980年,12
1巻,187〜193頁に述べている方法を用いて行うことがで
きる。 本発明の第二態様による酵素はＤ−２−CPAに対する
脱ハロゲン化に最適なpH値、8.5〜9.5を有している。こ
れらの酵素は有機及び無機の緩衝溶液中で良好な活性を
有するが、適当にpHを調整した非緩衝化系においても作
用する。 ２−CPAを用いる化学プラントに隣接する土壌から新
規な細菌を単離し、菌株選択法によつて、２−HAA′ｓ
またはその誘導体の脱ハロゲン化に関してすぐれた効能
を有する純粋な形態になるように培養した。この培養に
は、娘世代の増殖、単独細胞コロニーの選択及び公知の
発酵培地での増殖は標準方法を用いた。 本発明において用いる細菌のソースとして上記した、
NCIBに寄託の５種類の菌株が第二の酵素を含み、この第
二の酵素がＬ−２−HAA′ｓまたはその適当な誘導体の
対応２−ヒドロキシ化合物への転化を触媒し得ることが
発見された。 本発明の方法は細胞内または細胞外Ｄ−２−HAA−ハ
ライドヒドロラーゼを用いて実施することができる。細
胞外Ｄ−２−HAA−ハライドヒドロラーゼを用いる場合
には、細胞は「固定化した」または「不溶化した」形態
であり得る。 適当な公知の処置、例えばフロキユレーシヨンによつ
て、または本質的に不溶の不活性な担体物質に物理的ま
たは化学的に結合させることによつて、酵素及び細胞を
「固定化」または「不溶化」して、酵素及び細胞を流通
反応器への使用を容易にする方法は、技術上公知であ
る。ここで用いるかぎり、「固定化酵素」または「不溶
化酵素」なる用語は、不溶性担体物質に物理的または化
学的に結合したまたは不溶性担体物質中に包まれた、あ
るいは不溶性塊状物もしくは凝集塊を形成するように処
理された酵素または細胞を意味する。固定化された酵素
がこれを通常溶解させるような液体と接触しても、酵素
は担体物質に付着したままである、固定化された細胞が
これを通常容易に分散させるような液体と接触しても、
細胞は担体物質に付着したままでまたは凝集塊として残
留する。 担体としては種々な物質を用いることができる。例え
ば、酵素及び細胞を例えば種々なセルロース誘導体、ポ
リアミノスチレン床等のような種々な有機物質、または
例えば孔質ガラス及びシリカゲルのような種々な無機物
質に結合させることができる。酵素を種々な石英質物質
に吸着させる方法は、米国特許第3556945号に述べられ
ている。無機物質、特にアルカリ耐性セラミツク、が好
ましい。 酵素及び細胞を例えばポリアクリルアミドもしくはカ
ラジーナン等のゲルのような適当な不溶性担体物質中に
酵素もしくは細胞を含む方法またはこれらを凝集させる
方法は技術上周知である〔バーク（Burke）、フイロソ
フイカル トランスアクシヨンズ オブ ザ ローヤル
ソサイアテイ オブ ロンドン（Philosophical Tran
sactions of the Royal Society of London）1983年,30
0巻,369〜389頁；モスバツハ（Mosbach）、ストラクチ
ヤー アンド オーダー イン ポリマーズ レクチヤ
ー インターナシヨナル シンポジウム（Structure an
d Order in Polymers Lecture International Synposiu
m）1980,ペルガモン1981,231〜238頁参照〕 固定化した酵素または細胞を用いる場合には、連続型
反応器より好ましくは流通反応器でこれらを使用するこ
とができる。 本発明の方法に細胞内酵素を用いる場合には、例えば
突然変異または遺伝子工学によつて適当な細胞を製造す
ることができる。例えば、Ｄ−２−HAAハライドヒドロ
ラーゼ及び、Ｌ−２−HAAもしくはその誘導体の対応２
−ヒドロキシ化合物への転化を触媒し得る酵素を含む自
然生成微生物の細胞に、細胞がＬ−鏡像異性体に対して
不利に反応する可能性を失うような突然変異処理を行う
ことができる。この突然変異処理は例えば紫外線のよう
な適当な電磁線への暴露等の物理的処理または例えばＮ
−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンのよ
うな適当な化学薬品による化学的処理である。適当な化
学処理にはオルンストン（Ornston）が述べている方法
がある〔ジヤーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Journal of Biological Chemistry）1966年,241
巻,3800〜3810頁〕。 この代りに、Ｄ−２−HAA−ハライドヒドロラーゼを
指定する遺伝情報をＤ−2HAA−ハライドヒドロラーゼが
自然に生成する微生物から、適当な異種有機体すなわち
Ｄ−２−HAA−ハライドヒドロラーゼが自然に生成しな
い有機体に移すことができる。例えば、Ｄ−２−HAA−
ハライドヒドロラーゼを指定する遺伝子を有するプラス
ミド〔カワサキ（Kawasaki）等のアグリカルチヤー ア
ンド バイオロジカル ケミストリイ（Agriculture an
d Biological Chemistry）1981年,45巻,29〜34頁〕は、
例えば塩沈殿方法のような公知の方法〔グエリイ（Guer
ry）等、ジヤーナル オブ バクテリオロジー（Journa
l of Bacteriology）,1973年,116巻,1064〜1066頁〕に
よつて単離して、例えば塩化セシウム−臭化エチジウム
密度勾配遠心分離法によるような公知の方法によつて、
さらに精製することができる。遺伝子は例えば形質転換
のような公知の方法によつて異種有機体に導入すること
ができる。この代りに、例えば細胞抱合によつて遺伝子
を第二有機体に直接移すこともできるが、この方法は移
動を必要とする〔ビーチング（Beaching）等、ジエイ・
ゲン・マイクロバイオル（J.Gen.Microbiol.）1983年,1
29巻,2071〜2078頁〕。 Ｄ−２−HAA−ハライドヒドロラーゼの産生に不利な
影響を与えず、また２−HAA′sL−鏡像異性体とも不利
に反応することがないと考えられる適当な異種有機体の
例としては、特に大腸菌、メチロフイルス・メチロトロ
プル（特に、我々の英国特許明細書第1,370,892号に記
載する菌株、NCIBNo.10508〜No.10515及びNo.10592〜N
o.10596）及び枯草菌が挙げられる。 本発明の第三及び第五態様による方法を細胞内Ｄ−２
−HAA−ハライドヒドロラーゼの存在下で実施する場合
には、適当な有機体の細胞を通常の増殖培地中で連続
法、回分法または供給回分法によつて増殖することがで
きる。増殖培地は典型的には、無機塩水溶液と、例えば
グルコース、エタノール、酢酸または２−HAAのような
適当な炭素源とから成る。炭素源の濃度は広範囲にわた
つて変動し得るが、一般には１％（w/v）〜５％（w/v）
の範囲である。増殖期には酸素または酸素含有ガスが存
在しなければならない。増殖期中の培地温度はかなり変
化し得るが、通常は25℃〜35℃の範囲である。増殖中の
培地のpHは5.5〜8.0の範囲、好ましくは6.5〜7.5の範囲
に維持しなければならない。培養物のサイズは例えば1.
5〜50.000の範囲でかなり変動し得る。 増殖期後に、細胞を本発明の方法に用いる。細胞は例
えば遠心分離またはフロキユレーシヨンによつて回収で
きる、または前記方法に直接用いることができる。細胞
を回収する場合には、例えばリン酸塩、炭酸水素塩もし
くはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝溶液
または水のような、有意な細胞増殖を支持しない緩衝溶
液中に細胞を再懸濁させる。再懸濁した細胞の濃度は典
型的には１〜30g（乾燥重量）/gである。細胞は20℃〜4
0℃の温度に維持し、pHを5.5〜9.5に維持する。 次に、培養物を２−HAAまたはその適当な誘導体、例
えばその低級のアルキルエステルまたは好ましくは、例
えばナトリウム塩もしくはカリウム塩のようなその塩の
混合物と技術上周知の方法によつて接触させる。この細
胞懸濁液の生産的な寿命は典型的には５〜1000時間であ
る。この期間後に、細胞を遠心分離及び／またはフロキ
ユレーシヨン及び／または過によつて除去する。上清
液に新たな細胞を加えて、プロセスをくり返すことがで
きる。プロセスの最後に、酸性化した水性反応混合物か
ら適当な極性溶媒による溶媒抽出によつて２−HAAを抽
出するのが好ましい。用いることのできる極性溶媒の例
は特にジエチル・エーテル、塩化メチレン及びメチルイ
ソブチルケトンである。連続抽出法を用いるのが特に好
ましいが、細胞分離後に （１） 水性培地を蒸発させ、残渣を例えばクロロホル
ムまたは塩化メチレンのような適当な溶媒に溶解する； （２） 水性培地を適当な吸収剤で処理する、例えばイ
オン交換カラムに通す；または （３） 水性培地を目的化合物がその塩として、例えば
カルシウム塩として沈殿するように試薬によつて処理す
る という可能性を排除するわけではない。 酸素圧を減少すると酵素の半減期が増大することを発
見したので、実質的に酸素を含まない雰囲気下で実施す
る方法もあり、この場合は窒素雰囲気下で実施するのが
好ましい。 本発明に用いる細胞を浸透性化して、細胞の内外への
基質及び生成物の移動を容易にする。適当な浸透性化処
理方法はフエリツクス（Felix）がアナリテイカル バ
イオケミストリイ（Analytical Biochemistry）1982年,
120巻,211〜234頁に述べている。 本発明の方法で製造される２−HAA L−鏡像異性体は
少なくとも80％、特に少なくとも95％及び特に好ましく
は少なくとも99％の光学的純度を有する。 本発明を次の実施例に関連してさらに説明する。実施
例中では次の培地を用いた： クエン酸塩緩衝溶液 0.1Μクエン酸（14.9ml）と0.1Μクエン酸三ナトリウ
ム（35.1ml）に蒸留水を加えて500mlにする。生成した
緩衝溶液はpH5.5を有した。 バウシヨツプ−エルスドンズ（Bauschop and Elsdons）
培地 （ａ） 塩溶液 酸化マグネシウム（10.75g）、硫酸亜鉛・七水和物
（1.44g）、硫酸コバルト・七水和物（0.28g）、炭酸カ
ルシウム（2.0g）、硫酸マンガン・四水和物（1.12
g）、ホウ酸（0.06g）、硫酸第一鉄・七水和物（4.5
g）、硫酸銅五水和物（0.25g）及び濃塩酸（51.3ml）を
別々に水に溶解した。但し酸化マグネシウムと炭酸カル
シウムは別々に少量の濃塩酸に溶解した。これらの溶液
を混合し、蒸留水に加えて１とした。 （ｂ） ストツク溶液Ａ リン酸二水素カリウム（500g）、水酸化ナトリウム
（100g）及びニトリロ酸酢酸（50g）を蒸留水に溶解し
て、２とした。 （ｃ） ストツク溶液Ｂ 硫酸アンモニウム（200g）、硫酸マグネシウム・七水
和物（20g）、硫酸第一鉄・七水和物（1g）及び前記塩
溶液の一部（200ml）に蒸留水を加えて２とした。 （ｄ） Ｂ−Ｅ最少培地 ストツク溶液Ａ−の一部（10ml）、ストツク溶液Ｂの
一部（10ml）及び蒸留水（48ml）を混合し、pH7.0〜7.2
の水溶液とした。 （ｅ） Ｂ−Ｅ寒天培地 Difco Bacto寒天を2.0％ w/vの濃度になるようにＢ−
Ｅ最少培地に加えた、この濃度では固体化培地が得られ
た。 培地Ａ 培地Ａは硫酸アンモニウム（5g/）、MgSO4・7H2O
（0.8g/）、硫酸カリウム（0.45g/）、濃リン酸
（1.3ml/）、FeSO4・5H2O（0.04g/）及び微量元素
溶液（60ml/）から成る水溶液であつた。 微量元素溶液は銅（5ppm）、Mn（25ppm）、Zn（23pp
m）及びカルシウム（720ppm）を含むものであつた。 培地Ｂ 培地Ｂは硫酸アンモニウム（1.8g/）、硫酸マグネ
シウム（MgSO4・7H2O）（0.2g/）、塩化第二鉄（0.97
mg/）、リン酸水素カリウム（K2HPO4）（1.9g/）、
リン酸二水素ナトリウム（NaH2PO4）（1.56g/）及び
培地Ａに用いたような微量元素溶液（1ml/）から成る
水溶液であつた。 実施例１ この実施例では、本発明において使用する酵素製造を
説明する。 1. ２−CPAを分解し得る微生物の単離 HAA′ｓが自然に生成する場所（例えば針葉樹林）及
び合成HAA′ｓの保管場所からの土壌サンプル（1g）
を、DL−２−CPAのナトリウム塩またはカリウム塩を20m
Mの濃度で含むＢ−Ｅ最少培地（100ml）中で30℃におい
て３日間インキユベートした。次に培養物を1.5％w/v寒
天で固化させた上記定義の培地サンプル上で連続的に希
釈し、30℃においてさらに３〜７日間インキユベートし
た。２−CPAを分解し得る細菌のコロニー（この１つは
シユードモナス・プチダNCIB12018であつた）を採取し
て、さらに精製した。 2. ２−CPAのＤ−鏡像異性体を脱ハロゲン化し得るが
Ｌ−鏡像異性体を脱ハロゲン化できない酵素の検出 段階１で単離した、分離したコロニーのサンプルを、
２Μ水酸化カリウムの添加によつてpH7.0±0.1に調節し
たＢ−Ｅ最少培地（２）中、30℃において別々に増殖
させた。培養物を1000rpmで撹拌し、空気を0.5／分で
供給した。DL−２−CPAのカリウム塩を発酵器に３モル
／時の速度で加えた。 16時間後に、培養物を5000G、20分間の遠心分離によ
つて回収し、細胞を４℃、pH7の25mMリン酸塩緩衝溶液
（NaH2PO4）で洗浄し、同緩衝溶液10ml中に再懸濁させ
た。これらの細胞を12000psiのフレンチ細胞プレスに２
回通すことによつて破壊し、未破壊細胞と細胞破片を12
0,000G、１時間の遠心分離によつて除去して、細胞を含
まない抽出物を得た。 細胞を含まない抽出物のサンプルにポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を２通りに実施した〔ハードマン（Hard
man）等、ジヤーナル オブ ゼネラル マイクロバイ
オロジー（Journal of General Microbiology）1981
年、123巻,117〜128頁〕。電気泳動後に、前記のハード
マン等の参考文献に述べられているように、各ゲル対の
一方を50mM D−２−CPA含有緩衝溶液中でインキユベー
トし、他方を50mM L−２−CPA含有緩衝溶液中でインキ
ユベートした。 この方法は、シユードモナス・プチダ NCIB12018中
に２種類のハライドヒドロラーゼが存在することを明ら
かにした。一種類の酵素はＬ−２−CPAに対する活性を
有するが、Ｄ−２−CPAに対する活性を有さず、第二の
酵素はＤ−２−CPAに対する活性を有するが、Ｌ−２−C
PAに対する活性を有さず、すなわち、本発明の第一態様
による酵素であつた。 〔Ｄ−２−CPAとＬ−２−CPAはフー（Fu）等がジヤー
ナル オブ ザ アメリカン ケミカル ソサイアテイ
（Journal of the American Chemical Society）1954
年,76巻,6054〜6058頁に述べられているように製造する
ことができる。） 3. デハロゲナーゼの単位 シユードモナス・プチダ NCIB12018から細胞を含ま
ない抽出物の一部（25ml）を、pH7.5の25mMトリス／サ
ルフエート緩衝溶液と予備平衡させたDEAE−Sephacelカ
ラム（直径45mm,高さ60cm）上に装入した。このカラム
を純粋なこの緩衝溶液及び次に連続的に0.15Μ,0.2Μ及
び0.5Μ塩化カリウムを含有する緩衝溶液200mlずつで10
0ml/時の流速度で溶出した。 これらの４つのフラクシヨンのハライドヒドロラーゼ
活性を、段階２に述べたように基質としてＬ−２−CPA
及びＤ−２−CPAを用いて分析した。 Ｄ−２−CPAに対する活性は0.15Μフラクシヨンのみ
において検出された。Ｌ−２−CPAに対する活性は0.5Μ
フラクシヨンにおいてのみ検出された。純粋な緩衝溶液
フラクシヨン及び0.5Μフラクシヨンについては、ハラ
イドヒドロラーゼ活性は検出されなかつた。 4. Ｄ−２−HAAハライドヒドロラーゼの性質 0.15ΜフラクシヨンのハライドヒドロラーゼはＤ−２
−CPAに対する活性に最適なpH8.8〜9.0を有する。これ
は有機緩衝溶液（トリス／サルフエート）及び無機緩衝
溶液（炭酸水素塩／炭酸塩）中で良好な活性を有し、pH
を8.8〜9.0に調節した非緩衝化培地（例えば蒸留水）中
で活性を示す。 この酵素は、0.1Μトリス／サルフエート、pH9緩衝溶
液中、４℃で貯蔵した場合に、約10日間の半減期を有す
る。 この酵素活性は１ΜまでのDL−２−CPAによつて阻害
されず、１Μ濃度までの反応生成物すなわち塩化物イオ
ン及びラクテートによつて阻害されなかつた。 実施例２ この実施例では、Ｄ−２−HAAハライドヒドロラーゼ
の使用を説明する。 シユードモナス・プチダ NCIB12018からのＤ−２−H
AAハライドヒドロラーゼを含む。実施例１、段階３で得
た0.15Μ溶出フラクシヨンの一部（150ml）と0.05Μ炭
酸水素塩緩衝溶液（NaHCO3/Na2CO3）の混合物に、30℃
において撹拌しながら、DL−２−CPAカリウム塩を加
え、２Μ水酸化カリウム水溶液を添加してpHを9.0に維
持した。塩化物イオンの放出を監視することによつて、
反応をフオローアツプした。塩化物イオン放出が終了し
た後、さらにDL−２−CPAの追加量を加えた。５時間後
に、塩化物イオンの濃度は87mMであつた。これにさらに
DL−２−CPA16g（150mole）を加えた。 反応混合物をpH4に酸性化し、沈殿した蛋白質を10,00
0G、30分間の遠心分離によつて除去した。透明な上清液
をさらにpH2.0に酸性化し、塩化メチレンで連続的に抽
出した。塩化メチレンを蒸発させて粗２−CPA 7.3gを
得、これを蒸留して無色油5.06gの主フラクシヨンを得
た。この油は▲〔α〕30.4 D▼（−）12.5゜（Ｃ＝1.7
7、CCl4）の旋光度を有し、L:D比92:8の２−CPAに相当
した（すなわち84％鏡像異性体過剰）。生成物はIRとNM
Rスペクトルによつて同定した。 実施例３ この実施例はＬ−２−CPAの脱ハロゲン化できない突
然変異菌株の製造を説明する。 Luria液体培地中のシユードモナス・プチダNCIB12018
を振とう水浴上で30℃において一晩増殖させた。これを
新たなLuria液体培地に継代培養し、上記条件で増殖さ
せて、550nmで測定した光学密度（以下では便宜上OD−5
50と呼ぶ）0.5を得た。 この培養物の２通りのサンプル（15ml）を遠心分離
し、細胞ペレツトをクエン酸緩衝溶液（15ml）中Ｎ−メ
チルＮ′−ニトロソグアニジン（0.75mg）の溶液に別々
に再懸濁させた。混合物を往復動振とう機上で30℃にお
いて45分間インキユベートした。 細胞を遠心分離によつて回収し、Ｂ−Ｅ最少培地への
再懸濁及び遠心分離によつて２回洗浄した。ペレツトを
Ｂ−Ｅ最少培地（5ml）に懸濁させ、アリコート（1ml）
を振とう機フラスコ中のＢ−Ｅ最少培地（2ml）と0.3％
ピルビン酸ナトリウムに接種した。 増殖後に、培養物のOD−550を測定し、培養物を希釈
し、約1000細胞/mlとし、Ｂ−Ｅ寒天培地とピルビン酸
ナトリウム（10mmole）から成るプレート上にアリコー
ト（0.1ml）を展げ、コロニーが出現するまで、30℃で
インキユベートした。コロニーのサンプルを10mM D−２
−CPAと10mM L−２−CPAを含有するＢ−Ｅ寒天培地プレ
ート上にレプリカ培養した。レプリカ・プレート対を比
較し、コロニーを単離した。コロニーはＬ−２−CPA上
では増殖したが、Ｄ−２−CPA上では増殖しなかつた。
これらのコロニーをＬ−、Ｄ−２−CPA及びピルビン酸
塩上での増殖に関して比較し、好ましい表現型を備れ、
殆んど逆もどりを示さないコロニーを次のテスト用に選
択した（表１）。 単離物のサンプルをDL−２−CPA（20mM）含有のＢ−
Ｅ最少培地（20ml）中、30℃において振とうさせながら
一晩増殖させた。培養物を10,000Gにおいて20分間遠心
分離し、細胞をトリス／サルフエート緩衝溶液（0.1Μ,
pH8.8）（10ml）中に再懸濁させた。各細胞懸濁液を２
アリコートに分割した。 各アリコート対の１つにＤ−２−CPAを40mMまで加
え、他方はＬ−２−CPAを40mMまで加えた。次に各アリ
コートを30℃において振とうしながら24時間インキユベ
ートし、塩化物イオンの放出をフオローアツプした。 一種類の突然変異体（以下では便宜上、AJI−23と呼
ぶ）はＤ−２−CPAから細胞乾燥重量1gにつき塩化物8.5
mmole/時の速度で、塩化物を放出したが、Ｌ−２−CPA
からは放出しなかつた。 実施例４ この実施例はＤ−２−CPAから塩化物イオンを放出す
るがＬ−２−CPAからは放出することのできない突然変
異菌株の使用を説明する。 突然変異株、実施例３で製造したAJI−23のサンプル
を、炭素源として0.3％w/vピルビン酸ナトリウムを含有
するＢ−Ｅ液体培地上で、0.1/時の希釈率によるケモス
タツト培養（500ml）として、30℃において1v/v/分で通
気しながら増殖させた。ケモスタツト廃棄ポツトからの
使用済み培養物５を遠心分離によつて回収した。 ２−CPAラセミ体のカリウム塩200mmolを含有する0.1
Μ炭酸水素ナトリウム／炭酸塩緩衝溶液（180ml）pH中
の細胞を再懸濁させた。反応混合物を30℃において500r
pmで撹拌し、４Μ水酸化カリウム水溶液を添加してpHを
8.8に維持した。22時間後に、廃棄ポツトからの細胞を
さらに加え、反応をさらに20時間続けた。次に遠心分離
によつて細胞を除去した。上清液を濃硫酸によつてpH4
に酸性化し、生成する沈殿を遠心分離によつて除去し
た。透明な溶液を塩化メチレンで抽出し、２−CPAのＬ
−鏡像異性体（3.5g）を単離した。これは光学純度82％
を有することがわかつた（64％鏡像異性体過剰）。 実施例５ この実施例は突然変異菌株の鏡像異性体純度の高いＬ
−２−CPA製造への利用を説明する。 実施例３で製造した突然変異菌株AJI−23のサンプル
を、実施例４で説明したように、ケモスタツト培養とし
て増殖させた。 培養物の一部（400ml）を用いて、培地Ａ（６）に
接種し、混合物に0.75g/／時の率でグルコースを連続
的に加えた。混合物を500rpmで撹拌し、空気を４／分
で通気し、２Μ NaOHの添加によつてpHを7.0に維持し、
温度を30℃に維持した。24時間後に、細胞密度が細胞乾
燥重量約8g/になつたときに、グルコースの添加を停
止した。次にDL−２−CPAを20mmole/時の速度で20時間
加えた。細胞を遠心分離によつて回収した。 回収した細胞の一部（乾燥重量8g）を、DL−２−CPA
ナトリウム塩（108g）を含有する50mMリン酸カリウム
（900ml）（pH7.4）中に再懸濁させ、この混合物を250r
pmで撹拌し、温度を30℃に維持し、混合物の上に窒素を
通過させて、混合物の上方に本質的に酸素を含まないブ
ランケツトを維持し、pHを7.4±0.2に維持するために必
要に応じて４Μ水酸化ナトリウム溶液を加えた。 20時間反応させた後に、塩化物イオンはもはや放出さ
れなくなつてから、反応混合物を２つの部分に分割した
（部分ＡとＢ）。部分Ａを硫酸によつてpH1に酸性化
し、けいそう土を通して過し、塩化メチレンによつて
連続的に抽出し、塩化メチレン抽出物を油状物（25.52
g）になるまで、蒸発乾燥させた。シヨートパス蒸留に
よつて、0.87％四塩化炭素溶液として▲〔α〕30 D▼−1
3.3゜を有するフラクシヨンを得た。このフラクシヨン
はNMRによつて２％未満のＤ−２−CPAを含むＬ−２−CP
A（すなわち96％鏡像異性体過剰）であることが判明し
た。 実施例６ この実施例は適当な担体に固定した、細菌の存在下で
のＤ−２−CPAからの塩化物イオンの放出を説明する。 実施例４で述べたようにケモスタツトで増殖させたAJ
I−23（乾燥重量0.4g）、30％w/vアクリルアミド水溶液
（6.1ml）、２％w/vビスアクリルアミド水溶液（1.25m
l）及び１Μトリス−サルフエート緩衝溶液pH8.7（10.7
5ml）から成る混合物を真空下で脱気し、次に、N,N,N1,
N1,−テトラメチル−エチレンジアミン（37μ）と10
％w/v過硫酸アンモニウム（60μ）を加えて、重合を
開始させた。30分後に、生成した固定化細胞含有固体ゲ
ルを10ml注射器のオリフイスから押し出し、１Μトリス
／サルフエート緩衝溶液で洗浄した。 前記固定化細胞をDL−２−CPAナトリウム塩（5mmol
e）含有の0.5Μリン酸塩緩衝溶液（pH8）（10ml）中、3
0℃において緩和に振とうしながらインキユベートし
た。塩化物イオン放出をフオローアツプすることによつ
て、細胞活性を評価した。塩化物イオン放出は少なくと
も200時間続き、このとき塩化物イオン濃度は130mMにな
つた。 実施例７ Ｄ−２−HAAハライドヒドロラーゼを含む環境からの
付加的微生物の単離 塩素化酸を汚染物として含む、イギリスの各地から集
めた土壌サンプル（2g）を、唯一の炭素源として20mM D
L−２−CPAナトリウム塩を含有する無機塩培地（培地
Ｂ）100ml中で、30℃において振とうしながらインキユ
ベートした。３日後に、このようにして製造した、各濃
縮培養物のアリコートを連続希釈後に上記の寒天固化培
地上で培養した。２〜５日後に出現した微生物コロニー
を単離し、標準の微生物学的方法によつて純粋形になる
ように培養した。 各有機体のサンプルを同培地200ml中で16時間増殖さ
せた後、細胞を遠心分離によつて回収し、20mMトリスサ
ルフエート緩衝溶液（pH7.8）中に再懸濁させて、乾燥
重量約50g/の細胞密度を得た。Ｌ−２−CPA、Na+塩と
DL−２−CPA、Na+塩の両方の各有機体による脱塩素化速
度を実施例２に述べたように測定した。Ｌ−２−CPAよ
りもDL−２−CPAに対して高い脱塩素化速度を示した有
機体をさらに研究した（表２）。 このような有機体の細胞を含まない抽出物を実施例１
に述べたように製造し、これらのデハロゲナーゼ補体を
前述したように電気泳動によつて調べた。ゲルをＬ−２
−CPA及びＤ−２−CPAに対する活性に関して調べた。各
デハロゲナーゼ蛋白質の基質特異性が注目された（表
３）。Ｄ−２−CPAに特異的なデハロゲナーゼがＬ−２
−CPAに対して活性を示さないことが発見された。 実施例８ シユードモナス・プチダと突然変異体AJI−23からの
Ｄ−２−HAA−ハライドヒドロラーゼの、ラセミ体混合
物としてのＤ−２−ブロモプロピオン酸（Ｄ−２−BP
A）選択的脱臭素化への利用。 実施例１に述べたように製造した酵素製剤の100μ
アリコートを0.5Μリン酸カリウム緩衝溶液pH7.3中で種
々の濃度のDL−２−BPA、Na+塩とともに30℃において16
時間インキユベートした（最終量5ml）。 実施例３におけるように製造した突然変異体AJI−23
を上記と同様に処理した（最終細胞濃度、乾燥重量1g/
）。16時間後に、反応混合中の臭化物イオン量を上記
と同様にMarious Chloro−Ｏ−カウンターで測定した。
各場合に、DL−２−BPAの50％が脱臭素化され、異性体
特異性であることを示した（表４）。 実施例９ 突然変異有機体AJI−23に含まれるＤ−２−CPAを用い
た、半工業的規模での鏡像異性体高過剰のＬ−２−CPA
の製造。 突然変異体AJI−23を0.3％w/vピルビン酸ナトリウム
及び10mMDL−２−CPA含有の、実施例４で用いた無機塩
培地の培養物２×600ml中で30℃において増殖させた。2
4時間後に、次の成分： MgSO4・7H2O 1.10g/ （NH4）２・SO4 6.3g/ K2SO4 0.57g/ FeSO4・7H2O 0.05g/ MnSO4・7H2O 0.0078g/ ZnSO4・7H2O 0.0078g/ CuSO4・7H2O 0.0015g/ CaCl2 0.15g/ H2SO4（濃） 0.15g/ グルコース 8.0g/ リン酸（比重1.75） 0.88g/ を含有する培地500中で両培養物をインキユベートし
た。 これを30℃において800rpmで撹拌し、アンモニアの添
加によつてpHを7.0に維持した、20時間後に、さらに50m
M DL−２−CPAを含む新しい培地を絶えず添加すること
によつて（希釈率0.1/時）、連続培養した。培養物を同
じ率で取り出し（細胞乾燥重量5g/）、遠心分離によ
り濃縮して10％w/v細胞スラリーを得た。 450−温度調節ジヤケツト付き容器内の次の成分： 水 128kg DL−２−CPA 23kg 及び リン酸二水素ナトリウム 2kg を含有する溶液に、23％水酸化ナトリウム溶液を加えて
pHを6.0に高めた。次に20％NaOH液を徐々に加えること
によつて、pHをさらに7.2に高めた。容器ジヤケツトを
通じて水を循環させて、温度を30℃に維持した。容器内
容物を60rpmで撹拌した。 上述のように製造した、細胞2kg（乾燥重量）を含有
する細胞スラリー20kgをこの容器に装入し、内容物上方
に窒素ブランケツトを供給した。NaOH液の添加によつて
判定して全てのＤ−２−CPAが脱塩素化されるまで、pH
を7.2に制御して反応を進行させた（7.5時間）、次に硫
酸（78％）を加えて、pHを1.5に減じた。Clarcelflo 1
（過助剤）（6kg）を加え、１時間過した。次に、
このバツチをフイルタープレスに通し、透明な液を回
収した。 液の一部（800g）をメチルイソブチルケトン（MIB
K）（400g）に加え、室温で20分間撹拌した。次に内容
物を沈降させて分離して、水性ラフイネートとMIBK抽出
物とを得た。水性ラフイネートを次にMIBKで抽出した。
Clarcelflo 1（10g）をMIBK抽出物に加え、次に過し
て、MIBK抽出物を一緒にした。MIBK抽出物を反応器に装
入し、NaOH（13.47％ w/w溶液、86.7gを加えた）。５分
間撹拌し、沈降分離させた後、透明な水層に硫酸を加え
て、pH7.0に調節し、Ｄ−２−CPA、ナトリウム塩の28〜
30％ w/w溶液を得た。NMRによる分析（実施例２はこれ
が98％鏡像異性体過剰（Ｌ−２−CPA 99.4％:D−２−CP
A0.6％）でＬ−２−CPAナトリウム塩であることを示し
た。 実施例10 本発明における細胞を含まない酵素の嫌気性使用。 シユードモナス・プチド菌株NCIB 12018を増殖させ、
これから実施例１に述べたようにＤ−２−HAA−ハライ
ドヒドロラーゼ酵素を単離した。細胞を含まない抽出物
の0.15Μフラクシヨンの一部（1ml）をDL−2CPAナトリ
ウム塩5mmole及びトリス／サルフエート緩衝液（pH9.
0）5mmoleと混合して全体量を10mlとした。これを２通
りに実施した。この１つのサンプルを100ml−三角フラ
スコに入れ、30℃の振とう水浴（60往復／分）中でイン
キユベートした。第二サンプルも同様にインキユベート
したが、この場合には窒素雰囲気を用いた。両方の場合
に、Ｄ−２−CPAからの塩化物イオン放出をフオローア
ツプした。結果は表５に示す。この表から窒素雰囲気下
では酵素が空気雰囲気下よりも高い率で長期間にわたつ
て塩化物イオンを放出することがわかる。実施例11 本発明における細胞結合酵素の嫌気性使用 突然変異菌株AJI−23を実施例３に述べたように製造
し、実施例１のシユードモナス・プチダNCIB 12018の増
殖に用いた条件下で増殖させた。 製造した培養物を遠心分離して、細胞スラリーを得
た。細胞乾燥重量3.2gに相当するスラリーの一部を、DL
−２−CPAナトリウム塩250mmoleとリン酸カリウム緩衝
溶液（pH7.8）50mmole含有の水500ml中に懸濁させた。
これを１ガラス容器中で30℃において撹拌しながら
（250rpm）、インキユベートした。２Μ NaOHを添加し
て、pHを7.4に維持することによつて、Ｄ−２−HAA−ハ
ライドヒドロラーゼの活性をフオローアツプした。第二
の反応では、窒素を反応混合物の表面上に通して、嫌気
性雰囲気を維持した。 結果を表６に示す。これらの結果は窒素雰囲気下の反
応が空気雰囲気下の反応に比べて高い率で長時間持続す
ることを示した。
に関する。 ２−ハロアルカン酸、例えば２−クロロプロピオン酸
（以下では、便宜上「２−CPA」と呼ぶ）は特にピリジ
ルオキシ−フエノキシ置換アルカン酸（以下では便宜上
「PPAA′ｓ」と呼ぶ）の製造における中間体として有用
である。或る種のPPAA′ｓ、例えばＤ−２−（４−５−
（トリフルオロメチル−２−ピリジルオキシ）フエノキ
シ）プロピオン酸とその低級アルキルエステルは、我々
のヨーロツパ特許出願明細書第0003890A号にさらに詳し
く述べるように、特にイネ科植物に対する除草性化合物
として有用である。 「２−ハロアルカン酸」（以下では、便宜上「２−HA
A′ｓ」と呼ぶ）はここでは、カルボキシル基に隣接す
る炭素原子に１個のフルオロ、クロロ、ブロムまたはヨ
ード・ラジカルを有し、直鎖または分枝鎖であるアルキ
ル基が２〜６個の炭素原子を含むアルカン酸を意味す
る。このアルキル基が、以下で定義する酵素または細菌
の不利に反応しない極性置換基を有する可能性も除外さ
れるわけではない。 ２−HAA′ｓ中及びPPAA′ｓに含まれるアルカン酸残
基中の２−炭素原子が非対称性炭素原子であり、このた
めこの化合物が２つの鏡像異性体形で存在し得ることは
理解されよう。これらの形体の１つをＤ−絶対立体配置
すなわち右旋性グリセリルアルデヒドと同じ絶対立体配
置を有し、他の形体はＬ−絶対立体配置を有する。これ
らの鏡像異性体は互いの鏡像であり、光学的に活性であ
り、平明偏光を逆方向に回転させる。 ヨーロッパ特許出願明細書0003890A号では、特定のPP
AAのＤ鏡像異性体がＬ鏡像異性体よりも大きい除草活性
を有することを述べている。除草剤「ジクロルプロツプ
（Dichlorprop）」と「メコプロツプ（Mecoprop）」が
Ｄ（＋）異性体のみ除草活性を有するラセミ化合物とし
て製造されることは、英国作物保護会議（the British
Crop Protection Council）によつて刊行された、シー
・アール・ワーシングによる編集の「殺虫剤マニユアル
（the Pesticides Mannual）」第７版,184頁と345頁に
も述べられている。 さらに、PPAA′ｓのＤ−鏡像異性体が対応する２−HA
AのＬ−鏡像異性体から製造され得ることもヨーロツパ
特許出願明細書第0003890A号に述べられている。 ラセミ混合物の光学異性体分離に基づく従来の方法を
用いる２−HAA′sL−鏡像異性体の製造は、費用がかか
る傾向がある。我々はこのような製造のための生化学的
方法を今回、開発した。この方法は２−HAAのＤ−鏡像
異性体を選択的に脱ハロゲン化して２−ヒドロキシアル
カン酸を製造し、２−ヒドロキシアルカン酸混合物から
2HAA L−鏡像異性体を分離することに基づくものであ
る。さらに、２−ヒドロキシアルカン酸がラクテートの
Ｄ−鏡像異性体である場合には、この方法はＬ−鏡像異
性体の営利的に魅力ある製造方法になる。我々の同時係
属英国特許出願第8413155号にさらに詳細に述べるよう
に、Ｄ−ラクテートはワルデン反転によつて、例えば２
−CPAの特にＬ−鏡像異性体を製造するのに用いられ
る。 ２−CPAのＤ−鏡像異性体及びＬ−鏡像異性体の両方
の立体配置の反転または保持のいずれかによるラクテー
トへの転化を触媒する酵素が公知である〔ウエイトマン
（Weightman）等のジヤーナル・オブ・ジエネラル・マ
イクロバイオロジイ（Journal of General Microbiolog
y）,1982年,128巻,1755〜1762頁〕。２−CPAのＬ−鏡像
異性体のみの反転によるラクテートへの転化を触媒する
酵素も公知である〔リツトル（Little）等、ヨーロピア
ン・ジヤーナル・オブ・バイオケミストリイ（European
Journal of Biochemistry）,1971年,21巻,99〜109
頁〕。しかし、２−CPAのＤ−鏡像異性体のみをラクテ
ートに転化させる酵素は今までに知られていない。我々
は今回、２−HAA′ｓもしくはその適当な誘導体の２−
ヒドロキシ化合物への転化を触媒することはできるが、
２−HAA′ｓのＬ−鏡像異性体もしくはその適当な誘導
体の２−ヒドロキシ化合物への転化を触媒することはで
きない酵素を発見した。 ２−HAA′ｓのＤ−鏡像異性体もしくはその適当な誘
導体の２−ヒドロキシアルカン酸もしくはその適当な誘
導体への転化を触媒することはできるが、２−HAA′ｓ
のＬ−鏡像異性体もしくはその誘導体からのハロゲン残
基の放出を触媒することはできない酵素を以下では便宜
上「Ｄ−２−HHA−ハライドヒドロラーゼ」と呼ぶこと
にする。 本発明は、２−クロロまたはブロモアルカン酸のＤ−
鏡像異性体とＬ−鏡像異性体との混合物中におけるＤ−
鏡像異性体を選択的に加水分解する酵素であるＤ−２−
クロロまたはハブロモアルカン酸ハライドヒドロラーゼ
で当該混合物を処理することによってＤ−鏡像異性体の
濃度を減少させ２−クロロまはたはブロモアルカン酸の
Ｌ−鏡像異性体を得る方法を提供する。我々のヨーロツ
パ特許出願明細書第0003890A号にさらに詳しく述べるよ
うに、カルボキシル基が適当な誘導体の形態である可能
性を排除するわけではないが、カルボキシル基は遊離形
または、金属イオンが細胞もしくは酵素と不利に反応し
ないような、遊離形の金属塩の形態であることが好まし
い。金属イオンは元素周期律表の第I A属の金属から誘
導されるものであることが好ましいが、ナトリウムまた
はカリウムであることがより好ましい。 本発明においては如何なる種属の細菌も用いられる
が、シユードモナス（Pseudomonas）属の菌株、特にシ
ユードモナス・プチダ（Pseudo−monas putida）または
シユードモナス・フルオレツセンス（Pseudomonas fluo
rescens）種属の菌株が適切である。 本発明において細菌を突然変異または遺伝操作によつ
て誘導し、本発明の第一態様による酵素組成物を単離す
るためのソースとして用いることのできる５種類の菌株
は、ザ ナシヨナルコレクシヨン オブ インダストリ
アル バクテリア（the National Collection of Indus
trial Bacteria）〔イギリス，スコツトランド，アバー
デイーン，アベイロート135,郵便私書箱31〕に寄託され
ており、次の受入れ番号を与えられている： 1. シユードモナス・プチダ NCIB12018 2. シユードモナス・フルオレツセンス NCIB12159 3. NCIB12160 4. NCIB12161 5. シユードモナス・プチダ NCIB12158 ２−HAA′ｓのＬ−鏡像異性体とともにまたはこれの
代りに２−ヒドロキシアルカン酸を製造するのに用いた
場合の本発明の方法も、特に２−ヒドロキシアルカン酸
が乳酸であるならば本発明の範囲に含まれる。 前記で定義したようなＤ−２−HAA−ハライドヒドロ
ラーゼは例えばシユードモナス・プチダNCIB12018のよ
うな細菌から、酵素技術で周知の方法、例えば吸収、溶
出及び沈降法によつて単離することができる。例えば、
適当な有機体の細胞を例えば細胞のフレンチプレスで破
壊する。ホモジネート懸濁液を例えば遠心分離または
過のような通常の生化学的分離法によつて、固相と液相
に分離して、適当な緩衝溶液中の細胞を含まない抽出物
が得られる。適当な緩衝溶液には、特にリン酸塩、トリ
スヒドロキシメチルアミノメタン（「Tris」）、炭酸水
素塩、グリシン、イミダゾール等がある、緩衝溶碇の濃
度は典型的には1mM〜200mMの範囲であり、例えば約25mM
である。 細胞を含まない抽出物は特に分子量及び／または荷重
に応じて分子を分離し得る分別方法、例えば限界過、
例えばポリアクリルアミドゲル上での電気泳動または例
えばDEAE−Sephacelカラム上でのクロマトグラフイを用
いて、分別することができる。適当なフラクシヨンの確
認及び目的の酵素活性を有する酵素のそれからの単離は
当技術上で公知の方法、例えばウエイトマン（Weightma
n）等がジヤーナル オブ ゼネラル マイクロバイオ
ロジー（Journal of General Microbiology）1980年,12
1巻,187〜193頁に述べている方法を用いて行うことがで
きる。 本発明の第二態様による酵素はＤ−２−CPAに対する
脱ハロゲン化に最適なpH値、8.5〜9.5を有している。こ
れらの酵素は有機及び無機の緩衝溶液中で良好な活性を
有するが、適当にpHを調整した非緩衝化系においても作
用する。 ２−CPAを用いる化学プラントに隣接する土壌から新
規な細菌を単離し、菌株選択法によつて、２−HAA′ｓ
またはその誘導体の脱ハロゲン化に関してすぐれた効能
を有する純粋な形態になるように培養した。この培養に
は、娘世代の増殖、単独細胞コロニーの選択及び公知の
発酵培地での増殖は標準方法を用いた。 本発明において用いる細菌のソースとして上記した、
NCIBに寄託の５種類の菌株が第二の酵素を含み、この第
二の酵素がＬ−２−HAA′ｓまたはその適当な誘導体の
対応２−ヒドロキシ化合物への転化を触媒し得ることが
発見された。 本発明の方法は細胞内または細胞外Ｄ−２−HAA−ハ
ライドヒドロラーゼを用いて実施することができる。細
胞外Ｄ−２−HAA−ハライドヒドロラーゼを用いる場合
には、細胞は「固定化した」または「不溶化した」形態
であり得る。 適当な公知の処置、例えばフロキユレーシヨンによつ
て、または本質的に不溶の不活性な担体物質に物理的ま
たは化学的に結合させることによつて、酵素及び細胞を
「固定化」または「不溶化」して、酵素及び細胞を流通
反応器への使用を容易にする方法は、技術上公知であ
る。ここで用いるかぎり、「固定化酵素」または「不溶
化酵素」なる用語は、不溶性担体物質に物理的または化
学的に結合したまたは不溶性担体物質中に包まれた、あ
るいは不溶性塊状物もしくは凝集塊を形成するように処
理された酵素または細胞を意味する。固定化された酵素
がこれを通常溶解させるような液体と接触しても、酵素
は担体物質に付着したままである、固定化された細胞が
これを通常容易に分散させるような液体と接触しても、
細胞は担体物質に付着したままでまたは凝集塊として残
留する。 担体としては種々な物質を用いることができる。例え
ば、酵素及び細胞を例えば種々なセルロース誘導体、ポ
リアミノスチレン床等のような種々な有機物質、または
例えば孔質ガラス及びシリカゲルのような種々な無機物
質に結合させることができる。酵素を種々な石英質物質
に吸着させる方法は、米国特許第3556945号に述べられ
ている。無機物質、特にアルカリ耐性セラミツク、が好
ましい。 酵素及び細胞を例えばポリアクリルアミドもしくはカ
ラジーナン等のゲルのような適当な不溶性担体物質中に
酵素もしくは細胞を含む方法またはこれらを凝集させる
方法は技術上周知である〔バーク（Burke）、フイロソ
フイカル トランスアクシヨンズ オブ ザ ローヤル
ソサイアテイ オブ ロンドン（Philosophical Tran
sactions of the Royal Society of London）1983年,30
0巻,369〜389頁；モスバツハ（Mosbach）、ストラクチ
ヤー アンド オーダー イン ポリマーズ レクチヤ
ー インターナシヨナル シンポジウム（Structure an
d Order in Polymers Lecture International Synposiu
m）1980,ペルガモン1981,231〜238頁参照〕 固定化した酵素または細胞を用いる場合には、連続型
反応器より好ましくは流通反応器でこれらを使用するこ
とができる。 本発明の方法に細胞内酵素を用いる場合には、例えば
突然変異または遺伝子工学によつて適当な細胞を製造す
ることができる。例えば、Ｄ−２−HAAハライドヒドロ
ラーゼ及び、Ｌ−２−HAAもしくはその誘導体の対応２
−ヒドロキシ化合物への転化を触媒し得る酵素を含む自
然生成微生物の細胞に、細胞がＬ−鏡像異性体に対して
不利に反応する可能性を失うような突然変異処理を行う
ことができる。この突然変異処理は例えば紫外線のよう
な適当な電磁線への暴露等の物理的処理または例えばＮ
−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンのよ
うな適当な化学薬品による化学的処理である。適当な化
学処理にはオルンストン（Ornston）が述べている方法
がある〔ジヤーナル オブ バイオロジカル ケミスト
リー（Journal of Biological Chemistry）1966年,241
巻,3800〜3810頁〕。 この代りに、Ｄ−２−HAA−ハライドヒドロラーゼを
指定する遺伝情報をＤ−2HAA−ハライドヒドロラーゼが
自然に生成する微生物から、適当な異種有機体すなわち
Ｄ−２−HAA−ハライドヒドロラーゼが自然に生成しな
い有機体に移すことができる。例えば、Ｄ−２−HAA−
ハライドヒドロラーゼを指定する遺伝子を有するプラス
ミド〔カワサキ（Kawasaki）等のアグリカルチヤー ア
ンド バイオロジカル ケミストリイ（Agriculture an
d Biological Chemistry）1981年,45巻,29〜34頁〕は、
例えば塩沈殿方法のような公知の方法〔グエリイ（Guer
ry）等、ジヤーナル オブ バクテリオロジー（Journa
l of Bacteriology）,1973年,116巻,1064〜1066頁〕に
よつて単離して、例えば塩化セシウム−臭化エチジウム
密度勾配遠心分離法によるような公知の方法によつて、
さらに精製することができる。遺伝子は例えば形質転換
のような公知の方法によつて異種有機体に導入すること
ができる。この代りに、例えば細胞抱合によつて遺伝子
を第二有機体に直接移すこともできるが、この方法は移
動を必要とする〔ビーチング（Beaching）等、ジエイ・
ゲン・マイクロバイオル（J.Gen.Microbiol.）1983年,1
29巻,2071〜2078頁〕。 Ｄ−２−HAA−ハライドヒドロラーゼの産生に不利な
影響を与えず、また２−HAA′sL−鏡像異性体とも不利
に反応することがないと考えられる適当な異種有機体の
例としては、特に大腸菌、メチロフイルス・メチロトロ
プル（特に、我々の英国特許明細書第1,370,892号に記
載する菌株、NCIBNo.10508〜No.10515及びNo.10592〜N
o.10596）及び枯草菌が挙げられる。 本発明の第三及び第五態様による方法を細胞内Ｄ−２
−HAA−ハライドヒドロラーゼの存在下で実施する場合
には、適当な有機体の細胞を通常の増殖培地中で連続
法、回分法または供給回分法によつて増殖することがで
きる。増殖培地は典型的には、無機塩水溶液と、例えば
グルコース、エタノール、酢酸または２−HAAのような
適当な炭素源とから成る。炭素源の濃度は広範囲にわた
つて変動し得るが、一般には１％（w/v）〜５％（w/v）
の範囲である。増殖期には酸素または酸素含有ガスが存
在しなければならない。増殖期中の培地温度はかなり変
化し得るが、通常は25℃〜35℃の範囲である。増殖中の
培地のpHは5.5〜8.0の範囲、好ましくは6.5〜7.5の範囲
に維持しなければならない。培養物のサイズは例えば1.
5〜50.000の範囲でかなり変動し得る。 増殖期後に、細胞を本発明の方法に用いる。細胞は例
えば遠心分離またはフロキユレーシヨンによつて回収で
きる、または前記方法に直接用いることができる。細胞
を回収する場合には、例えばリン酸塩、炭酸水素塩もし
くはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝溶液
または水のような、有意な細胞増殖を支持しない緩衝溶
液中に細胞を再懸濁させる。再懸濁した細胞の濃度は典
型的には１〜30g（乾燥重量）/gである。細胞は20℃〜4
0℃の温度に維持し、pHを5.5〜9.5に維持する。 次に、培養物を２−HAAまたはその適当な誘導体、例
えばその低級のアルキルエステルまたは好ましくは、例
えばナトリウム塩もしくはカリウム塩のようなその塩の
混合物と技術上周知の方法によつて接触させる。この細
胞懸濁液の生産的な寿命は典型的には５〜1000時間であ
る。この期間後に、細胞を遠心分離及び／またはフロキ
ユレーシヨン及び／または過によつて除去する。上清
液に新たな細胞を加えて、プロセスをくり返すことがで
きる。プロセスの最後に、酸性化した水性反応混合物か
ら適当な極性溶媒による溶媒抽出によつて２−HAAを抽
出するのが好ましい。用いることのできる極性溶媒の例
は特にジエチル・エーテル、塩化メチレン及びメチルイ
ソブチルケトンである。連続抽出法を用いるのが特に好
ましいが、細胞分離後に （１） 水性培地を蒸発させ、残渣を例えばクロロホル
ムまたは塩化メチレンのような適当な溶媒に溶解する； （２） 水性培地を適当な吸収剤で処理する、例えばイ
オン交換カラムに通す；または （３） 水性培地を目的化合物がその塩として、例えば
カルシウム塩として沈殿するように試薬によつて処理す
る という可能性を排除するわけではない。 酸素圧を減少すると酵素の半減期が増大することを発
見したので、実質的に酸素を含まない雰囲気下で実施す
る方法もあり、この場合は窒素雰囲気下で実施するのが
好ましい。 本発明に用いる細胞を浸透性化して、細胞の内外への
基質及び生成物の移動を容易にする。適当な浸透性化処
理方法はフエリツクス（Felix）がアナリテイカル バ
イオケミストリイ（Analytical Biochemistry）1982年,
120巻,211〜234頁に述べている。 本発明の方法で製造される２−HAA L−鏡像異性体は
少なくとも80％、特に少なくとも95％及び特に好ましく
は少なくとも99％の光学的純度を有する。 本発明を次の実施例に関連してさらに説明する。実施
例中では次の培地を用いた： クエン酸塩緩衝溶液 0.1Μクエン酸（14.9ml）と0.1Μクエン酸三ナトリウ
ム（35.1ml）に蒸留水を加えて500mlにする。生成した
緩衝溶液はpH5.5を有した。 バウシヨツプ−エルスドンズ（Bauschop and Elsdons）
培地 （ａ） 塩溶液 酸化マグネシウム（10.75g）、硫酸亜鉛・七水和物
（1.44g）、硫酸コバルト・七水和物（0.28g）、炭酸カ
ルシウム（2.0g）、硫酸マンガン・四水和物（1.12
g）、ホウ酸（0.06g）、硫酸第一鉄・七水和物（4.5
g）、硫酸銅五水和物（0.25g）及び濃塩酸（51.3ml）を
別々に水に溶解した。但し酸化マグネシウムと炭酸カル
シウムは別々に少量の濃塩酸に溶解した。これらの溶液
を混合し、蒸留水に加えて１とした。 （ｂ） ストツク溶液Ａ リン酸二水素カリウム（500g）、水酸化ナトリウム
（100g）及びニトリロ酸酢酸（50g）を蒸留水に溶解し
て、２とした。 （ｃ） ストツク溶液Ｂ 硫酸アンモニウム（200g）、硫酸マグネシウム・七水
和物（20g）、硫酸第一鉄・七水和物（1g）及び前記塩
溶液の一部（200ml）に蒸留水を加えて２とした。 （ｄ） Ｂ−Ｅ最少培地 ストツク溶液Ａ−の一部（10ml）、ストツク溶液Ｂの
一部（10ml）及び蒸留水（48ml）を混合し、pH7.0〜7.2
の水溶液とした。 （ｅ） Ｂ−Ｅ寒天培地 Difco Bacto寒天を2.0％ w/vの濃度になるようにＢ−
Ｅ最少培地に加えた、この濃度では固体化培地が得られ
た。 培地Ａ 培地Ａは硫酸アンモニウム（5g/）、MgSO4・7H2O
（0.8g/）、硫酸カリウム（0.45g/）、濃リン酸
（1.3ml/）、FeSO4・5H2O（0.04g/）及び微量元素
溶液（60ml/）から成る水溶液であつた。 微量元素溶液は銅（5ppm）、Mn（25ppm）、Zn（23pp
m）及びカルシウム（720ppm）を含むものであつた。 培地Ｂ 培地Ｂは硫酸アンモニウム（1.8g/）、硫酸マグネ
シウム（MgSO4・7H2O）（0.2g/）、塩化第二鉄（0.97
mg/）、リン酸水素カリウム（K2HPO4）（1.9g/）、
リン酸二水素ナトリウム（NaH2PO4）（1.56g/）及び
培地Ａに用いたような微量元素溶液（1ml/）から成る
水溶液であつた。 実施例１ この実施例では、本発明において使用する酵素製造を
説明する。 1. ２−CPAを分解し得る微生物の単離 HAA′ｓが自然に生成する場所（例えば針葉樹林）及
び合成HAA′ｓの保管場所からの土壌サンプル（1g）
を、DL−２−CPAのナトリウム塩またはカリウム塩を20m
Mの濃度で含むＢ−Ｅ最少培地（100ml）中で30℃におい
て３日間インキユベートした。次に培養物を1.5％w/v寒
天で固化させた上記定義の培地サンプル上で連続的に希
釈し、30℃においてさらに３〜７日間インキユベートし
た。２−CPAを分解し得る細菌のコロニー（この１つは
シユードモナス・プチダNCIB12018であつた）を採取し
て、さらに精製した。 2. ２−CPAのＤ−鏡像異性体を脱ハロゲン化し得るが
Ｌ−鏡像異性体を脱ハロゲン化できない酵素の検出 段階１で単離した、分離したコロニーのサンプルを、
２Μ水酸化カリウムの添加によつてpH7.0±0.1に調節し
たＢ−Ｅ最少培地（２）中、30℃において別々に増殖
させた。培養物を1000rpmで撹拌し、空気を0.5／分で
供給した。DL−２−CPAのカリウム塩を発酵器に３モル
／時の速度で加えた。 16時間後に、培養物を5000G、20分間の遠心分離によ
つて回収し、細胞を４℃、pH7の25mMリン酸塩緩衝溶液
（NaH2PO4）で洗浄し、同緩衝溶液10ml中に再懸濁させ
た。これらの細胞を12000psiのフレンチ細胞プレスに２
回通すことによつて破壊し、未破壊細胞と細胞破片を12
0,000G、１時間の遠心分離によつて除去して、細胞を含
まない抽出物を得た。 細胞を含まない抽出物のサンプルにポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を２通りに実施した〔ハードマン（Hard
man）等、ジヤーナル オブ ゼネラル マイクロバイ
オロジー（Journal of General Microbiology）1981
年、123巻,117〜128頁〕。電気泳動後に、前記のハード
マン等の参考文献に述べられているように、各ゲル対の
一方を50mM D−２−CPA含有緩衝溶液中でインキユベー
トし、他方を50mM L−２−CPA含有緩衝溶液中でインキ
ユベートした。 この方法は、シユードモナス・プチダ NCIB12018中
に２種類のハライドヒドロラーゼが存在することを明ら
かにした。一種類の酵素はＬ−２−CPAに対する活性を
有するが、Ｄ−２−CPAに対する活性を有さず、第二の
酵素はＤ−２−CPAに対する活性を有するが、Ｌ−２−C
PAに対する活性を有さず、すなわち、本発明の第一態様
による酵素であつた。 〔Ｄ−２−CPAとＬ−２−CPAはフー（Fu）等がジヤー
ナル オブ ザ アメリカン ケミカル ソサイアテイ
（Journal of the American Chemical Society）1954
年,76巻,6054〜6058頁に述べられているように製造する
ことができる。） 3. デハロゲナーゼの単位 シユードモナス・プチダ NCIB12018から細胞を含ま
ない抽出物の一部（25ml）を、pH7.5の25mMトリス／サ
ルフエート緩衝溶液と予備平衡させたDEAE−Sephacelカ
ラム（直径45mm,高さ60cm）上に装入した。このカラム
を純粋なこの緩衝溶液及び次に連続的に0.15Μ,0.2Μ及
び0.5Μ塩化カリウムを含有する緩衝溶液200mlずつで10
0ml/時の流速度で溶出した。 これらの４つのフラクシヨンのハライドヒドロラーゼ
活性を、段階２に述べたように基質としてＬ−２−CPA
及びＤ−２−CPAを用いて分析した。 Ｄ−２−CPAに対する活性は0.15Μフラクシヨンのみ
において検出された。Ｌ−２−CPAに対する活性は0.5Μ
フラクシヨンにおいてのみ検出された。純粋な緩衝溶液
フラクシヨン及び0.5Μフラクシヨンについては、ハラ
イドヒドロラーゼ活性は検出されなかつた。 4. Ｄ−２−HAAハライドヒドロラーゼの性質 0.15ΜフラクシヨンのハライドヒドロラーゼはＤ−２
−CPAに対する活性に最適なpH8.8〜9.0を有する。これ
は有機緩衝溶液（トリス／サルフエート）及び無機緩衝
溶液（炭酸水素塩／炭酸塩）中で良好な活性を有し、pH
を8.8〜9.0に調節した非緩衝化培地（例えば蒸留水）中
で活性を示す。 この酵素は、0.1Μトリス／サルフエート、pH9緩衝溶
液中、４℃で貯蔵した場合に、約10日間の半減期を有す
る。 この酵素活性は１ΜまでのDL−２−CPAによつて阻害
されず、１Μ濃度までの反応生成物すなわち塩化物イオ
ン及びラクテートによつて阻害されなかつた。 実施例２ この実施例では、Ｄ−２−HAAハライドヒドロラーゼ
の使用を説明する。 シユードモナス・プチダ NCIB12018からのＤ−２−H
AAハライドヒドロラーゼを含む。実施例１、段階３で得
た0.15Μ溶出フラクシヨンの一部（150ml）と0.05Μ炭
酸水素塩緩衝溶液（NaHCO3/Na2CO3）の混合物に、30℃
において撹拌しながら、DL−２−CPAカリウム塩を加
え、２Μ水酸化カリウム水溶液を添加してpHを9.0に維
持した。塩化物イオンの放出を監視することによつて、
反応をフオローアツプした。塩化物イオン放出が終了し
た後、さらにDL−２−CPAの追加量を加えた。５時間後
に、塩化物イオンの濃度は87mMであつた。これにさらに
DL−２−CPA16g（150mole）を加えた。 反応混合物をpH4に酸性化し、沈殿した蛋白質を10,00
0G、30分間の遠心分離によつて除去した。透明な上清液
をさらにpH2.0に酸性化し、塩化メチレンで連続的に抽
出した。塩化メチレンを蒸発させて粗２−CPA 7.3gを
得、これを蒸留して無色油5.06gの主フラクシヨンを得
た。この油は▲〔α〕30.4 D▼（−）12.5゜（Ｃ＝1.7
7、CCl4）の旋光度を有し、L:D比92:8の２−CPAに相当
した（すなわち84％鏡像異性体過剰）。生成物はIRとNM
Rスペクトルによつて同定した。 実施例３ この実施例はＬ−２−CPAの脱ハロゲン化できない突
然変異菌株の製造を説明する。 Luria液体培地中のシユードモナス・プチダNCIB12018
を振とう水浴上で30℃において一晩増殖させた。これを
新たなLuria液体培地に継代培養し、上記条件で増殖さ
せて、550nmで測定した光学密度（以下では便宜上OD−5
50と呼ぶ）0.5を得た。 この培養物の２通りのサンプル（15ml）を遠心分離
し、細胞ペレツトをクエン酸緩衝溶液（15ml）中Ｎ−メ
チルＮ′−ニトロソグアニジン（0.75mg）の溶液に別々
に再懸濁させた。混合物を往復動振とう機上で30℃にお
いて45分間インキユベートした。 細胞を遠心分離によつて回収し、Ｂ−Ｅ最少培地への
再懸濁及び遠心分離によつて２回洗浄した。ペレツトを
Ｂ−Ｅ最少培地（5ml）に懸濁させ、アリコート（1ml）
を振とう機フラスコ中のＢ−Ｅ最少培地（2ml）と0.3％
ピルビン酸ナトリウムに接種した。 増殖後に、培養物のOD−550を測定し、培養物を希釈
し、約1000細胞/mlとし、Ｂ−Ｅ寒天培地とピルビン酸
ナトリウム（10mmole）から成るプレート上にアリコー
ト（0.1ml）を展げ、コロニーが出現するまで、30℃で
インキユベートした。コロニーのサンプルを10mM D−２
−CPAと10mM L−２−CPAを含有するＢ−Ｅ寒天培地プレ
ート上にレプリカ培養した。レプリカ・プレート対を比
較し、コロニーを単離した。コロニーはＬ−２−CPA上
では増殖したが、Ｄ−２−CPA上では増殖しなかつた。
これらのコロニーをＬ−、Ｄ−２−CPA及びピルビン酸
塩上での増殖に関して比較し、好ましい表現型を備れ、
殆んど逆もどりを示さないコロニーを次のテスト用に選
択した（表１）。 単離物のサンプルをDL−２−CPA（20mM）含有のＢ−
Ｅ最少培地（20ml）中、30℃において振とうさせながら
一晩増殖させた。培養物を10,000Gにおいて20分間遠心
分離し、細胞をトリス／サルフエート緩衝溶液（0.1Μ,
pH8.8）（10ml）中に再懸濁させた。各細胞懸濁液を２
アリコートに分割した。 各アリコート対の１つにＤ−２−CPAを40mMまで加
え、他方はＬ−２−CPAを40mMまで加えた。次に各アリ
コートを30℃において振とうしながら24時間インキユベ
ートし、塩化物イオンの放出をフオローアツプした。 一種類の突然変異体（以下では便宜上、AJI−23と呼
ぶ）はＤ−２−CPAから細胞乾燥重量1gにつき塩化物8.5
mmole/時の速度で、塩化物を放出したが、Ｌ−２−CPA
からは放出しなかつた。 実施例４ この実施例はＤ−２−CPAから塩化物イオンを放出す
るがＬ−２−CPAからは放出することのできない突然変
異菌株の使用を説明する。 突然変異株、実施例３で製造したAJI−23のサンプル
を、炭素源として0.3％w/vピルビン酸ナトリウムを含有
するＢ−Ｅ液体培地上で、0.1/時の希釈率によるケモス
タツト培養（500ml）として、30℃において1v/v/分で通
気しながら増殖させた。ケモスタツト廃棄ポツトからの
使用済み培養物５を遠心分離によつて回収した。 ２−CPAラセミ体のカリウム塩200mmolを含有する0.1
Μ炭酸水素ナトリウム／炭酸塩緩衝溶液（180ml）pH中
の細胞を再懸濁させた。反応混合物を30℃において500r
pmで撹拌し、４Μ水酸化カリウム水溶液を添加してpHを
8.8に維持した。22時間後に、廃棄ポツトからの細胞を
さらに加え、反応をさらに20時間続けた。次に遠心分離
によつて細胞を除去した。上清液を濃硫酸によつてpH4
に酸性化し、生成する沈殿を遠心分離によつて除去し
た。透明な溶液を塩化メチレンで抽出し、２−CPAのＬ
−鏡像異性体（3.5g）を単離した。これは光学純度82％
を有することがわかつた（64％鏡像異性体過剰）。 実施例５ この実施例は突然変異菌株の鏡像異性体純度の高いＬ
−２−CPA製造への利用を説明する。 実施例３で製造した突然変異菌株AJI−23のサンプル
を、実施例４で説明したように、ケモスタツト培養とし
て増殖させた。 培養物の一部（400ml）を用いて、培地Ａ（６）に
接種し、混合物に0.75g/／時の率でグルコースを連続
的に加えた。混合物を500rpmで撹拌し、空気を４／分
で通気し、２Μ NaOHの添加によつてpHを7.0に維持し、
温度を30℃に維持した。24時間後に、細胞密度が細胞乾
燥重量約8g/になつたときに、グルコースの添加を停
止した。次にDL−２−CPAを20mmole/時の速度で20時間
加えた。細胞を遠心分離によつて回収した。 回収した細胞の一部（乾燥重量8g）を、DL−２−CPA
ナトリウム塩（108g）を含有する50mMリン酸カリウム
（900ml）（pH7.4）中に再懸濁させ、この混合物を250r
pmで撹拌し、温度を30℃に維持し、混合物の上に窒素を
通過させて、混合物の上方に本質的に酸素を含まないブ
ランケツトを維持し、pHを7.4±0.2に維持するために必
要に応じて４Μ水酸化ナトリウム溶液を加えた。 20時間反応させた後に、塩化物イオンはもはや放出さ
れなくなつてから、反応混合物を２つの部分に分割した
（部分ＡとＢ）。部分Ａを硫酸によつてpH1に酸性化
し、けいそう土を通して過し、塩化メチレンによつて
連続的に抽出し、塩化メチレン抽出物を油状物（25.52
g）になるまで、蒸発乾燥させた。シヨートパス蒸留に
よつて、0.87％四塩化炭素溶液として▲〔α〕30 D▼−1
3.3゜を有するフラクシヨンを得た。このフラクシヨン
はNMRによつて２％未満のＤ−２−CPAを含むＬ−２−CP
A（すなわち96％鏡像異性体過剰）であることが判明し
た。 実施例６ この実施例は適当な担体に固定した、細菌の存在下で
のＤ−２−CPAからの塩化物イオンの放出を説明する。 実施例４で述べたようにケモスタツトで増殖させたAJ
I−23（乾燥重量0.4g）、30％w/vアクリルアミド水溶液
（6.1ml）、２％w/vビスアクリルアミド水溶液（1.25m
l）及び１Μトリス−サルフエート緩衝溶液pH8.7（10.7
5ml）から成る混合物を真空下で脱気し、次に、N,N,N1,
N1,−テトラメチル−エチレンジアミン（37μ）と10
％w/v過硫酸アンモニウム（60μ）を加えて、重合を
開始させた。30分後に、生成した固定化細胞含有固体ゲ
ルを10ml注射器のオリフイスから押し出し、１Μトリス
／サルフエート緩衝溶液で洗浄した。 前記固定化細胞をDL−２−CPAナトリウム塩（5mmol
e）含有の0.5Μリン酸塩緩衝溶液（pH8）（10ml）中、3
0℃において緩和に振とうしながらインキユベートし
た。塩化物イオン放出をフオローアツプすることによつ
て、細胞活性を評価した。塩化物イオン放出は少なくと
も200時間続き、このとき塩化物イオン濃度は130mMにな
つた。 実施例７ Ｄ−２−HAAハライドヒドロラーゼを含む環境からの
付加的微生物の単離 塩素化酸を汚染物として含む、イギリスの各地から集
めた土壌サンプル（2g）を、唯一の炭素源として20mM D
L−２−CPAナトリウム塩を含有する無機塩培地（培地
Ｂ）100ml中で、30℃において振とうしながらインキユ
ベートした。３日後に、このようにして製造した、各濃
縮培養物のアリコートを連続希釈後に上記の寒天固化培
地上で培養した。２〜５日後に出現した微生物コロニー
を単離し、標準の微生物学的方法によつて純粋形になる
ように培養した。 各有機体のサンプルを同培地200ml中で16時間増殖さ
せた後、細胞を遠心分離によつて回収し、20mMトリスサ
ルフエート緩衝溶液（pH7.8）中に再懸濁させて、乾燥
重量約50g/の細胞密度を得た。Ｌ−２−CPA、Na+塩と
DL−２−CPA、Na+塩の両方の各有機体による脱塩素化速
度を実施例２に述べたように測定した。Ｌ−２−CPAよ
りもDL−２−CPAに対して高い脱塩素化速度を示した有
機体をさらに研究した（表２）。 このような有機体の細胞を含まない抽出物を実施例１
に述べたように製造し、これらのデハロゲナーゼ補体を
前述したように電気泳動によつて調べた。ゲルをＬ−２
−CPA及びＤ−２−CPAに対する活性に関して調べた。各
デハロゲナーゼ蛋白質の基質特異性が注目された（表
３）。Ｄ−２−CPAに特異的なデハロゲナーゼがＬ−２
−CPAに対して活性を示さないことが発見された。 実施例８ シユードモナス・プチダと突然変異体AJI−23からの
Ｄ−２−HAA−ハライドヒドロラーゼの、ラセミ体混合
物としてのＤ−２−ブロモプロピオン酸（Ｄ−２−BP
A）選択的脱臭素化への利用。 実施例１に述べたように製造した酵素製剤の100μ
アリコートを0.5Μリン酸カリウム緩衝溶液pH7.3中で種
々の濃度のDL−２−BPA、Na+塩とともに30℃において16
時間インキユベートした（最終量5ml）。 実施例３におけるように製造した突然変異体AJI−23
を上記と同様に処理した（最終細胞濃度、乾燥重量1g/
）。16時間後に、反応混合中の臭化物イオン量を上記
と同様にMarious Chloro−Ｏ−カウンターで測定した。
各場合に、DL−２−BPAの50％が脱臭素化され、異性体
特異性であることを示した（表４）。 実施例９ 突然変異有機体AJI−23に含まれるＤ−２−CPAを用い
た、半工業的規模での鏡像異性体高過剰のＬ−２−CPA
の製造。 突然変異体AJI−23を0.3％w/vピルビン酸ナトリウム
及び10mMDL−２−CPA含有の、実施例４で用いた無機塩
培地の培養物２×600ml中で30℃において増殖させた。2
4時間後に、次の成分： MgSO4・7H2O 1.10g/ （NH4）２・SO4 6.3g/ K2SO4 0.57g/ FeSO4・7H2O 0.05g/ MnSO4・7H2O 0.0078g/ ZnSO4・7H2O 0.0078g/ CuSO4・7H2O 0.0015g/ CaCl2 0.15g/ H2SO4（濃） 0.15g/ グルコース 8.0g/ リン酸（比重1.75） 0.88g/ を含有する培地500中で両培養物をインキユベートし
た。 これを30℃において800rpmで撹拌し、アンモニアの添
加によつてpHを7.0に維持した、20時間後に、さらに50m
M DL−２−CPAを含む新しい培地を絶えず添加すること
によつて（希釈率0.1/時）、連続培養した。培養物を同
じ率で取り出し（細胞乾燥重量5g/）、遠心分離によ
り濃縮して10％w/v細胞スラリーを得た。 450−温度調節ジヤケツト付き容器内の次の成分： 水 128kg DL−２−CPA 23kg 及び リン酸二水素ナトリウム 2kg を含有する溶液に、23％水酸化ナトリウム溶液を加えて
pHを6.0に高めた。次に20％NaOH液を徐々に加えること
によつて、pHをさらに7.2に高めた。容器ジヤケツトを
通じて水を循環させて、温度を30℃に維持した。容器内
容物を60rpmで撹拌した。 上述のように製造した、細胞2kg（乾燥重量）を含有
する細胞スラリー20kgをこの容器に装入し、内容物上方
に窒素ブランケツトを供給した。NaOH液の添加によつて
判定して全てのＤ−２−CPAが脱塩素化されるまで、pH
を7.2に制御して反応を進行させた（7.5時間）、次に硫
酸（78％）を加えて、pHを1.5に減じた。Clarcelflo 1
（過助剤）（6kg）を加え、１時間過した。次に、
このバツチをフイルタープレスに通し、透明な液を回
収した。 液の一部（800g）をメチルイソブチルケトン（MIB
K）（400g）に加え、室温で20分間撹拌した。次に内容
物を沈降させて分離して、水性ラフイネートとMIBK抽出
物とを得た。水性ラフイネートを次にMIBKで抽出した。
Clarcelflo 1（10g）をMIBK抽出物に加え、次に過し
て、MIBK抽出物を一緒にした。MIBK抽出物を反応器に装
入し、NaOH（13.47％ w/w溶液、86.7gを加えた）。５分
間撹拌し、沈降分離させた後、透明な水層に硫酸を加え
て、pH7.0に調節し、Ｄ−２−CPA、ナトリウム塩の28〜
30％ w/w溶液を得た。NMRによる分析（実施例２はこれ
が98％鏡像異性体過剰（Ｌ−２−CPA 99.4％:D−２−CP
A0.6％）でＬ−２−CPAナトリウム塩であることを示し
た。 実施例10 本発明における細胞を含まない酵素の嫌気性使用。 シユードモナス・プチド菌株NCIB 12018を増殖させ、
これから実施例１に述べたようにＤ−２−HAA−ハライ
ドヒドロラーゼ酵素を単離した。細胞を含まない抽出物
の0.15Μフラクシヨンの一部（1ml）をDL−2CPAナトリ
ウム塩5mmole及びトリス／サルフエート緩衝液（pH9.
0）5mmoleと混合して全体量を10mlとした。これを２通
りに実施した。この１つのサンプルを100ml−三角フラ
スコに入れ、30℃の振とう水浴（60往復／分）中でイン
キユベートした。第二サンプルも同様にインキユベート
したが、この場合には窒素雰囲気を用いた。両方の場合
に、Ｄ−２−CPAからの塩化物イオン放出をフオローア
ツプした。結果は表５に示す。この表から窒素雰囲気下
では酵素が空気雰囲気下よりも高い率で長期間にわたつ
て塩化物イオンを放出することがわかる。実施例11 本発明における細胞結合酵素の嫌気性使用 突然変異菌株AJI−23を実施例３に述べたように製造
し、実施例１のシユードモナス・プチダNCIB 12018の増
殖に用いた条件下で増殖させた。 製造した培養物を遠心分離して、細胞スラリーを得
た。細胞乾燥重量3.2gに相当するスラリーの一部を、DL
−２−CPAナトリウム塩250mmoleとリン酸カリウム緩衝
溶液（pH7.8）50mmole含有の水500ml中に懸濁させた。
これを１ガラス容器中で30℃において撹拌しながら
（250rpm）、インキユベートした。２Μ NaOHを添加し
て、pHを7.4に維持することによつて、Ｄ−２−HAA−ハ
ライドヒドロラーゼの活性をフオローアツプした。第二
の反応では、窒素を反応混合物の表面上に通して、嫌気
性雰囲気を維持した。 結果を表６に示す。これらの結果は窒素雰囲気下の反
応が空気雰囲気下の反応に比べて高い率で長時間持続す
ることを示した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:39）
微生物の受託番号 ＮＣＩＢ １２１５９
微生物の受託番号 ＮＣＩＢ １２１６０
微生物の受託番号 ＮＣＩＢ １２１６１
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．２−クロロアルカン酸または２−ブロモアルカン酸
の鏡像異性体の混合物からＬ−２−クロロアルカン酸ま
たはＬ−２−ブロモアルカン酸を得る方法であって、当
該混合物をＤ−２−クロロアルカン酸またはＤ−２−ブ
ロモアルカン酸に選択的に作用するハライドヒドロラー
ゼで処理することを含む前記方法。 ２．２−クロロプロピオン酸または２−ブロモプロピオ
ン酸の鏡像異性体の混合物からＬ−２−クロロプロピオ
ン酸またはＬ−２−ブロモプロピオン酸を得る方法であ
って、当該混合物をＤ−２−クロロプロピオン酸または
Ｄ−２−ブロモプロピオン酸に選択的に作用するハライ
ドヒドロラーゼで処理することを含む、請求項１記載の
方法。 ３．嫌気性条件下で実施する請求項１または２記載の方
法。 ４．ハライドヒドロラーゼ処理を窒素雰囲気下で実施す
る請求項３記載の方法。 ５．２−ヒドロキシアルカン酸の製造に用いる請求項１
ないし４のいずれか１項記載の方法。 ６．２−ヒドロキシアルカン酸が乳酸である請求項５記
載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB848427032A GB8427032D0 (en) | 1984-10-25 | 1984-10-25 | Enzymes |
| GB8427032 | 1984-12-18 | ||
| GB848431923A GB8431923D0 (en) | 1984-12-18 | 1984-12-18 | Enzymes |
| GB8431923 | 1984-12-18 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9348278A Division JPH10179154A (ja) | 1984-10-25 | 1997-12-17 | Ｄ−鏡像異性体とｌ−鏡像異性体との混合物中におけるｄ−鏡像異性体の濃度を減少させる方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61104785A JPS61104785A (ja) | 1986-05-23 |
| JP2842570B2 true JP2842570B2 (ja) | 1999-01-06 |
Family
ID=26288376
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60239246A Expired - Fee Related JP2842570B2 (ja) | 1984-10-25 | 1985-10-25 | クロロまたはブロモアルカン酸の鏡像異性体の混合物におけるｄ−鏡像異性体を選択的に加水分解する酵素によってｌ−クロロ又はブロモアルカン酸を製造する方法 |
| JP9348278A Pending JPH10179154A (ja) | 1984-10-25 | 1997-12-17 | Ｄ−鏡像異性体とｌ−鏡像異性体との混合物中におけるｄ−鏡像異性体の濃度を減少させる方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9348278A Pending JPH10179154A (ja) | 1984-10-25 | 1997-12-17 | Ｄ−鏡像異性体とｌ−鏡像異性体との混合物中におけるｄ−鏡像異性体の濃度を減少させる方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4758518A (ja) |
| EP (1) | EP0179603B1 (ja) |
| JP (2) | JP2842570B2 (ja) |
| AT (1) | ATE87329T1 (ja) |
| AU (1) | AU592785B2 (ja) |
| CA (1) | CA1273885A (ja) |
| DE (1) | DE3587212T2 (ja) |
| IL (1) | IL76773A (ja) |
| NO (1) | NO854254L (ja) |
| NZ (1) | NZ213892A (ja) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU621813B2 (en) * | 1986-11-19 | 1992-03-26 | Genencor Inc. | Novel hydrolase and method |
| GB8701706D0 (en) * | 1987-01-27 | 1987-03-04 | Ici Plc | Immobilisation of enzymes |
| NL8801864A (nl) * | 1988-07-23 | 1990-02-16 | Stamicarbon | Werkwijze voor de bereiding van biokatalysatoren met voorheen niet aanwezige stereoselectieve enzymaktiviteit. |
| JP2655893B2 (ja) * | 1988-10-20 | 1997-09-24 | ユニチカ株式会社 | 光学活性なβ−ハロ乳酸又はグリシジル酸の合成法 |
| GB8824897D0 (en) * | 1988-10-24 | 1988-11-30 | Ici Plc | Biocatalysts |
| NL8802849A (nl) * | 1988-11-18 | 1990-06-18 | Stamicarbon | Werkwijze voor de enantioselectieve bereiding van d-(-)-3-hal-methylpropionzuur of derivaten daarvan en de bereiding van captopril daaruit. |
| US5210031A (en) * | 1989-07-20 | 1993-05-11 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Process for the production of R(-)-4-halo-3-hydroxybutyronitrile |
| US4912042A (en) * | 1989-08-17 | 1990-03-27 | Eastman Kodak Company | Preparation of D-malic acid or derivative |
| GB9206667D0 (en) * | 1992-03-27 | 1992-05-13 | Ici Plc | Purification process |
| US5332673A (en) * | 1993-03-08 | 1994-07-26 | Kansas State University Research Foundation | Application of native soil bacteria as selective biological control agents of the weeds downy brome, Japanese brome, and jointed goatgrass in wheat |
| EP0712808B1 (en) | 1994-11-21 | 2000-05-03 | Canon Kabushiki Kaisha | Process for decomposing pollutant with microorganism, process for remedying environment with microorganism, and microorganism itself |
| EP3461900A1 (en) * | 2017-09-28 | 2019-04-03 | Bayer Aktiengesellschaft | Method for the preparation of chiral alpha haloalkanoic acids |
| CN112680428B (zh) * | 2019-10-18 | 2022-10-14 | 中国科学院微生物研究所 | 一种脱卤酶Had2CG4B及其编码基因与应用 |
| US11352311B1 (en) * | 2021-06-27 | 2022-06-07 | Bomi Patel-Framroze | Single-step stereospecific synthesis of (S)-2-chloropropionic acid alkyl ester |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1473145A (fr) * | 1966-01-17 | 1967-03-17 | Rhone Poulenc Sa | Procédé de fabrication de l'acide d. lactique et de ses sels |
| JPS5931690A (ja) * | 1982-08-11 | 1984-02-20 | Unitika Ltd | 光学活性乳酸の製造方法 |
-
1985
- 1985-10-14 AT AT85307346T patent/ATE87329T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-10-14 DE DE85307346T patent/DE3587212T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-14 EP EP85307346A patent/EP0179603B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-18 NZ NZ213892A patent/NZ213892A/en unknown
- 1985-10-21 US US06/789,765 patent/US4758518A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-21 IL IL76773A patent/IL76773A/xx not_active IP Right Cessation
- 1985-10-23 AU AU48983/85A patent/AU592785B2/en not_active Expired
- 1985-10-24 NO NO854254A patent/NO854254L/no unknown
- 1985-10-25 CA CA000493891A patent/CA1273885A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-25 JP JP60239246A patent/JP2842570B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-12-17 JP JP9348278A patent/JPH10179154A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0179603A2 (en) | 1986-04-30 |
| JPS61104785A (ja) | 1986-05-23 |
| DE3587212D1 (en) | 1993-04-29 |
| ATE87329T1 (de) | 1993-04-15 |
| DE3587212T2 (de) | 1993-09-30 |
| AU592785B2 (en) | 1990-01-25 |
| JPH10179154A (ja) | 1998-07-07 |
| EP0179603A3 (en) | 1988-01-13 |
| AU4898385A (en) | 1986-05-01 |
| US4758518A (en) | 1988-07-19 |
| CA1273885A (en) | 1990-09-11 |
| NZ213892A (en) | 1992-03-26 |
| IL76773A (en) | 1990-03-19 |
| NO854254L (no) | 1986-04-28 |
| EP0179603B1 (en) | 1993-03-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2842570B2 (ja) | クロロまたはブロモアルカン酸の鏡像異性体の混合物におけるｄ−鏡像異性体を選択的に加水分解する酵素によってｌ−クロロ又はブロモアルカン酸を製造する方法 | |
| JP2623345B2 (ja) | 光学活性なα―置換有機酸の製造方法 | |
| Matin et al. | Physiological basis of the selective advantage of a Spirillum sp. in a carbon-limited environment | |
| JP2702915B2 (ja) | ２−アリールプロピオン酸の製造方法 | |
| US5283193A (en) | Process for producing optically active α-substituted organic acid and microorganism and enzyme used therefor | |
| JPH084515B2 (ja) | 有機化合物の製造方法 | |
| Hasan et al. | Two kinds of 2-halo acid dehalogenases from Pseudomonas sp. YL induced by 2-chloroacrylate and 2-chloropropionate | |
| JPS6219153B2 (ja) | ||
| Yoshida et al. | Isolation and identification of a pyrogallol producing bacterium from soil | |
| EP0274146B1 (en) | Process for the preparation of 2-arylpropionic acids | |
| JPH08187092A (ja) | 好熱性微生物が有するニトリル化合物をアミド化合物に変換させる水和活性を向上させる方法 | |
| JP3154348B2 (ja) | スカトール分解能を有する微生物およびスカトールの微生物的分解法 | |
| FR2653135A1 (fr) | L-carnitine deshydrogenase stable et procede pour sa production. | |
| JP2570313B2 (ja) | 新規微生物 | |
| Kurane et al. | Induction of enzymes involved in phthalate esters metabolism in Nocardia erythropolis and enzymatic hydrolysis of phthalate esters by commercial lipases | |
| JP3514799B2 (ja) | リパーゼ及びこれを産生する微生物 | |
| JP3011472B2 (ja) | 酵素法によるインジゴの製造法 | |
| JP4309969B2 (ja) | 新規酸化還元酵素及びそれを用いた３―（ｐ―ヒドロキシフェニル）―２―プロペノール誘導体等の製造法 | |
| SHIMAO et al. | Characteristics of transposon insertion mutants of mandelic acid-utilizing Pseudomonas putida strain A10L | |
| Leigh | Studies on bacterial dehalogenases | |
| JP3521493B2 (ja) | 微生物によるナフトールの製造法 | |
| CA2416429A1 (en) | Preparation of dicarboxylic acid monoesters from cyanocarboxylic acid esters | |
| Poh et al. | Regulation of isofunctional enzymes in Pseudomonas alcaligenes mutants defective in the gentisate pathway | |
| JPH03224496A (ja) | 光学活性なα―置換有機酸を製造する方法 | |
| JPH08332094A (ja) | アルカリゲネス属の微生物を利用してヘテロ芳香族カルボン酸を製造する微生物学的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |