NL8802849A - Werkwijze voor de enantioselectieve bereiding van d-(-)-3-hal-methylpropionzuur of derivaten daarvan en de bereiding van captopril daaruit. - Google Patents

Description

STAMICARBON B.V.

Uitvinders: Vincentius Henricus Maria Elferink, te Lichtenvoorde Joannes Gerardus Theooorus Kierkels, te Sittara Marcel Kloosterman, te Geleen Jan Hendrik Roskam, te Baarlo

WERKWIJZE VOOR DE ENANTIOSELECTIEVE BEREIDING VAN

D-(-)-3-HAL-2-METHYLPROPIONZUUR OF DERIVATEN DAARVAN EN DE BEREIDING VAN CAPTOPRIL DAARUIT

Deze uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de enantioselectieve bereiding van D-(-)-3-Hal-2-methylpropionzuur of derivaten daarvan, alsmede op de bereiding van Captopril daaruit. Hal duidt een halogeenatoom en bij voorkeur een chloor- of broomatoom aan.

Captopril is de gebruiksnaam voor N-(3-mercapto-2-D-methy l-propanoyl)-L-proline, dat ook onder de ingeschreven handelsnaam "Capoten"R in de handel wordt gebracht. Eenvoudigheidshalve wordt in deze beschrijving en in de bijbehorende conclusies de naam Captopril gebruikt om de genoemde verbinding aan te duiden.

Captopril bezit een bijzonder sterk remmende werking ten opzichte van angiotensine omzettend enzym, wordt daarom aangeduid als ACE-inhibitor en is als zodanig bij orale toediening actief tegen hypertensie. De zg. ACE-remmende werking is sterk afhankelijk van de ruimtelijke configuratie van het molecuul. De prolinerest in het Cap-toprilmolecuul is afkomstig van het L-proline. De 3-mercapto-2-methyl-propionzuurrest in Captopril is afkomstig van het D-enantiomeer. Het Captopril is ongeveer 100 maal zo actief als de stereoisomere verbinding waarin het L-enantiomeer van 3-mercapto-2-methyl-propionzuur is gebonden. Het D-3-mercapto-2-methylpropionzuur resp. het D-(-)-3-Hal-2-methylpropionzuur is volgens de R-S-conventie het S-enantio-meer.

Uit een publicatie van Masami Shimazaki et al in Chem. Pharm. Buil. 30 (1982 ) 3139-3146 is een synthese van Captopril bekend waar voor wordt uitgegaan van optisch actief 3-hydroxy-2-methylpropionzuur. In die publicatie en in NL-A“80.06026 (komt overeen met o.a.

US-A-4.310.635) is ook beschreven dat het D-enantiomeer van dat zuur kan worden bereid door isoboterzuur, methacrylzuur of een mengsel van die zuren te onderwerpen aan de inwerking van een micro-organisme, dat de genoemde zuren kan omzetten in D-3-hydroxy-2-methylpropionzuur. Omdat het genoemde hydroxyzuur niet rechtstreeks in de overeenkomstige mercaptoverbinding kan worden omgezet, wordt het met thionylchloride omgezet tot het D-3-chloor-2-methylpropionylchloride. Het D-3-chloor-2-methyl-propionylchloride kan vervolgens als uitgangsver-binding voor de bereiding van Captopril worden gebruikt. De bereiding van Captopril vertoopt via het D-enantiomeer van een 3-alkanoylthio-of 3-arylthio-2-methylpropionzuur of een derivaat daarvan, in het bijzonder een ester daarvan. Een dergelijke verbinding wordt gekoppeld met L-protine en vervolgens wordt uit het koppelingsprodukt door verwijdering van de alkanoyl- of aroylgroep de thiolgroep vrijgemaakt.

Een bezwaar van deze synthese is dat het 3-hydroxy-2-methylpropionzuur instabiel is en dat de enzymatische omzetting van isoboterzuur en/of methacrylzuur in D-3-hydroxy-2methylpropionzuur moeizaam verloopt en kostbaar is, zoals ook in WO-A-87/05328 wordt vermeld.

In US-A-4.411.836; EP-A-130.752; WO-A-87/05328 en in een publicatie van Qu-Ming Gu et al. in Tetrahedron Letters 27 (1986) 5203-5206 wordt de bereiding van enantiomeren van 3-alkanoylthio- of 3-aroylthio-2-methylpropionzuur door enzymatische hydrolyse van esters daarvan beschreven. Enzymatische hydrolyses verlopen in het algemeen niet volledig enantioselectief en daarom moet men, om het gewenste enantiomeer met een bevredigende enantiomere zuiverheid in handen te krijgen, de hydrolyse na een bepaalde conversiegraad beëindigen. Dit is o.a, bekend uit de bovengenoemde publicatie van Qu-Pling Gu et al. en meer algemeen beschreven in een publicatie van Ching-Shih Chen et al. in J. Am. Chem. Soc. 104 (1982 ) 7294-7299.

De enantiomere overmaat, die een maat is voor de enantiomere zuiverheid en veelal wordt aangeduid als "e.e." (enantiomeric excess), is een veel gebruikte grootheid, die bijvoorbeeld in de publicatie van Ching-Shih Chen (loc. cit.) is gedefinieerd, welke publicatie als hierbij ingelast worde beschouwd. Kort gezegd is de enantiomere overmaat gelijk aan het verschil van de hoeveelheden enantiomeren gedeeld door de som van de hoeveelheden enantiomeren, welk quotiënt door vermenigvuldiging met 100 als percentage kan worden uitgedrukt.

Als men het product van een enantioselectieve enzymatische hydrolyse met grote enantiomere zuiverheid wil verkrijgen zal men de hydrolyse bij minder dan 50% conversie moeten beëindigen. Wil men daarentegen het resterende substraat (in het onderhavige geval de ester) met grote enantiomere zuiverheid verkrijgen, dan zal men de hydrolyse tot een conversiegraad van meer dan 50% moeten voortzetten.

Een bezwaar van de bereiding van enantiomeren van 3-alkanoyl-thio- of 3-aroylthio-2-methylpropionzuur of esters daarvan door enzymatische hydrolyse van desbetreffende esters is dat men daarbij een bijprodukt verkrijgt waarin weliswaar in hoofdzaak ongewenst enantio-meer van het zuur aanwezig is of als ester gebonden is, maar daarnaast een aanmerkelijke hoeveelheid gewenst enantiomeer aanwezig is, resp. als ester gebonden is. Het 3-alkanoylthio- resp. 3-aroylthio-2-methyl-propionzuur kan moeilijk en slechts tegen aanzienlijke kosten worden teruggewonnen, zodat het bijprodukt als afvalstroom geloosd zal moeten worden, hetgeen een aanzienlijke belasting van het milieu met zich brengt. Bovendien zijn de hiervoor genoemde in het bijprodukt aanwezige verbindingen duur en het verlies daarvan werkt sterk kostprijsverlagend.

Het is algemeen bekend - en ook in de publicatie van Ching-Shih Chen (loc. cit.) vermeld - dat de enzymatische hydrolyse van de enantiomeren van een chirale ester met verschillende snelheden kan verlopen. De mate van scheiding van de enantiomeren en het rendement van een enzymatische enantioselectieve hydrolyse m.a.w. de enantio-selectiviteit zullen beter zijn naarmate het verschil in hydrolyse-snelheden groter is. Het verschil in hydrolysesnelheden bij hydrolyse met een bepaald enzym kan men door een geschikte keuze van de procesparameters in zekere mate beïnvloeden. Uiteraard zal men bij gebruik van een bepaald enzym er naar streven de procesparameters zo gunstig mogelijk te kiezen, hetgeen aan de hand van daarop gerichte experimenten mogelijk is.

Gevonden werd nu dat men enantioselectief D-(-)-3-Hal-2-methylpropionzuur of derivaten daarvan kan bereiden door - en dat is het kenmerk van de uitvinding - een ester van 3-Ha1-2•'methylpropionzuur, waarbij Hal een halogeenatoom en bij voorkeur een chloor- of broomatoom aanduidt/ te onderwerpen aan de inwerking van een esterbin-dingen hydrolyserend enzympreparaat, zodanig dat bij een esterconver-sie van ten hoogste 75% een esterfractie overblijft met een enan-tiomere overmaat D-ester van ten minste 95%, en de esterfractie uit het reactieproduct te winnen. De esterfractie met een enantiomere overmaat D-ester van ten minste 95% kan men vervolgens gebruiken als uitgangsproduct voor de bereiding van Captopril. Desgewenst kan men de ester hydrolyseren tot het overeenkomstige enantiomeer van het zuur. Die hydrolyse kan 20wel door enzymatische als door chemische hydrolyse met een zuur of een base of op elke andere geschikte wijze worden uitgevoerd, mits daarbij geen racemisatie dan wel eliminatie plaatsvindt.

Het zal de deskundige zonder meer duidelijk zijn dat men de enantioselectieve hydrolyse van een ester van 3-Hal-2-methylpropionr zuur ook kan uitvoeren met een enzympreparaat met een geringere enan-tiospecificiteit, waardoor men bij een conversie van 75% de ester met een geringere enantiomere overmaat dan 95% verkrijgt, resp. ter verkrijging van ester met een enantiomere overmaat van 95% de conversie meer dan 75% moet bedragen. Een dergelijke werkwijze is economisch minder aantrekkelijk, in het bijzonder wanneer men de ester van D-(-)-3-Hal-2-methylpropionzuur wil gebruiken als uitgangsproduct voor de bereiding van Captopril. Voor een dergelijke werkwijze worden dan ook geen uitsluitende rechten gevraagd.

Een belangrijk voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding is dat het uitgangsproduct, een racemisch mengsel van een ester van 3-Hal-2-methylpropionzuur, bereid kan worden door hydrohalo-genering van esters van methacrylzuur. Ook kan methacrylzuur worden gehydrohalogeneerd, waarna het verkregen 3-HaL-2-methylpropionzuur volgens algemeen gebruikelijke veresteringsmethoden kan worden veresterd. De uitgangsverbindingen zijn goedkoop en gemakkelijk verkrijgbaar.

Het zal duidelijk zijn dat bij de onderhavige werkwijze het in het algemeen van geen belang is van welke ester men uitgaat. In wezen kan elke ester worden gebruikt voorzover de in de ester gebonden koolwaterstofrest de enzymatische enantioselectieve hydrolyse niet stoort. De in de ester gebonden koolwaterstofrest kan desgewenst gesubstitueerd zijn, in het bijzonder door activerende substituenten zoals bijvoorbeeld halogeenatomen. In de praktijk zal men o.a. uit economische overwegingen de voorkeur geven aan C-|—C4 alkylesters zoals de methyl- of ethylester, welke alkylgroep desgewenst door een activerende substituent kan zijn gesubstitueerd. Een activerende substituent kan de enzymatische hydrolyse van de ester versnellen. Zo kan bijvoorbeeld een ester van 2-chloorethanol gemakkelijker en sneller gehydrolyseerd worden dan een ester van ethanol. Dit aspect kan voor het optimaliseren van de werkwijze volgens de uitvinding van belang zijn.

D-(-)-3-Hal-2-methylpropionzuur of een ester daarvan kan men op bekende wijze omzetten in de overeenkomstige 3-alkanoylthio- of 3-aroylthioverbinding, waarna daaruit op bekende wijze Captopril kan worden gesynthetiseerd. Onder alkanoylthio- of aroylthio wordt in deze beschrijving mede aralkanoylthio resp. alkaroylthio verstaan. Het D-(-)-3-Hal-2-methylpropionzuur of een ester daarvan dient daartoe een enantiomere overmaat te bevatten die ten minste gelijk is aan de enan-tiomere overmaat aan N-(3-mercaptc-2-D-methylpropanyol)-L-proline die in Captopril is vereist. Die enantiomere overmaat dient ten minste 95%, bij voorkeur ten minste 98% en meer in het bijzonder ten minste 99% te bedragen. Een dergelijke enantiomere overmaat is derhalve ook gewenst, resp. vereist voor D-(-)-3-Hal-2-methylpropionzuur of een daarvan te gebruiken ester. Een ander belangrijk voordeel van de onderhavige uitvinding is dat uit het D-(-)-3-Hal-2-methylpropionzuur of ester daarvan (e.e. ten minste 95%) het overeenkomstige enantiomeer van een 3-alkanoylthio- of 3-aroylthio-2-methylpropionzuur (of ester daarvan) kan worden bereid. De scheiding van de enantiomeren van die 3-alkanoylthio- of 3-aroylthioverbinding met alle daaraan verbonden \ bezwaren, komt daardoor te vervallen.

Enzymatische hydrolyse van esters is, zoals ook uit het voorgaande blijkt, algemeen bekend en vele enzymen uit de klasse der hydrotases kunnen daarvoor worden gebruikt, bijvoorbeeld esterases zoals varkenslever-esterase, cholinesterases, lipases, bijvoorbeeld varkenspancreas-lipase, proteolytische enzymen e.d. Een aantal hydro-lyserende enzymen worden op technische schaal geproduceerd en zijn in de handel verkrijgbaar. Behalve uit bacteriën kunnen hydrolyserende enzymen ook uit gist- en/of schimmelsoorten, uit planten en uit dierlijke organen zoals varkenslevers, varkensalvleesklieren e.d. worden verkregen.

Een ester-hydrolyserend enzympreparaat in het algemeen, maar ook een esterbindingen hydrolyserend enzympreparaat zoals dat bij de onderhavige uitvinding wordt gebruikt, wordt niet beperkt door herkomst, zuiverheid e.d. en kan bestaan uit bijvoorbeeld hele cellen van micro-organismen maar ook uit fijngemaakte cellen of uit extracten daarvan. Het enzym kan zowel in vrije als in geïmmobiliseerde vorm worden gebruikt. De uitvinding wordt niet beperkt door de vorm waarin het enzym in het enzympreparaat aanwezig is.

Esters van 3-Hal-2-methylpropionzuur kunnen niet met elk willekeurig ester-hydrolyserend enzympreparaat worden gehydrolyseerd. Het veel commerciêel verkrijgbare enzympreparaten en eveneens met vele microorganismen wordt geen of nauwelijks hydrolyse bewerkstelligd zoals bijvoorbeeld met diverse lipases (Candida lipolytica, Amano; PeniciIlium roquefort!, Amano; wheat germ. Sigma), esterases (pregastric esterase, Amano; cholesterol esterase from bovine pancreas. Sigma), proteases (Fungal protease, Hi les Kali) en andere.

Veel andere preparaten daarentegen zijn wel in staat esters van 3-Ha1-2-methylpropionzuur te hydrolyseren, echter, in veeL gevallen wordt daarbij niet voldaan aan de voorwaarde dat bij een esterconversie van ten hoogste 75% de enantiomere overmaat D-ester in de niet gehydrolyseerde esterfractie ten minste 95% bedraagt. Zo is uit door aanvraagster gedane onderzoekingen gebleken dat de enan-tioselectiviteit van vele in de handel verkrijgbare enzympreparaten zoals bijvoorbeeld met diverse esterases (Pig liver. Sigma; butyryl choline esterase from human serum; Sigma), acylases (porcine kidney,

Sigma; type I from Aspergillus niger, Sigma), Lipases (Humicola lanuginosa, Biocatalyst; Penicillium cyclopium, Amano; lipoprotein, Amano) proteases (Maxatase, Gist-Brocades; Optimase L 660, Miles Kali) en andere onvoldoende is om bij de hydrolyse van esters van 3-Hal-2-methylpropionzuur aan de gestelde voorwaarden te kunnen voldoen. Diverse andere microorganismen hydrolyseren esters van 3-Hal-2-methylpropionzuur eveneens met een te lage selectiviteit. Enkele voorbeelden hiervan zijn: Flavobacterium aquatile, Azotobacter agilis, Arthrobacter globiformis, Hansenula polymorpha, Geotrichum candidum, Torula monosa, Kluyveromyces fragilis, Pichi a pinus,

Trichosporon cutaneum, Zygosaccharomyces barkeri, Saccharomyces cere-visiae en andere.

Verrassenderwijs is nu gevonden dat een aantal preparaten wel voldoende selectiviteit vertonen, te weten commerciëel verkrijgbare lipases van de schimmels Rhizopus (o.a. delemar, niveus, javanicus, arrhizus, japonicus) en Mucor (o.a. javanicus, miehei), het lipase van de gist Candida (o.a. cylindraceae) en de volgende microorganismen uit stammencollecties: Verticillium glaucum NV DSM 2011,

Gliocladium viride CBS 22848, Rhodococcus erythropolis NCIB 11538, Rhodococcus erythropolis NCIB 11539, Rhodococcus erythropolis NCIB 11540, Rhodococcus rhodochrous ATCC 21243, Rhodococcus rhodochrous ATCC 21197, Rhodococcus sp. ATCC 4275, Rhodococcus sp. ATCC 19071, Rhodococcus sp. ATCC 19148, Nocardia tartaricans ATCC 31190, Xantho-monas hyacinthi NV DSM 49 (NCIB 40073), Pseudomonas fluorescens NV DSM 91 (NCIB 40074), Bacillus cereus NV DSM 6 (NCIB 40072), Corynebac-terium bovis ATCC 7715, Mycobacterium phlei ATCC 15610, Stam TA-2 (geïsoleerd op triacetin) (NCIB 40069), Stam TB-2 (geïsoleerd op tri-butyrin) (NCIB 40070), Stam EE-1 (NCIB 40071), Erwinia herbicola ATCC 14589.

Enzympreparaten worden verkregen door geschikte microorganismen te kweken in media, die componenten zoals koolstofbron, stikstofbron, vitaminen, mineralen e.d. bevatten. Ter optimalisatie van de activiteit en selectiviteit van dergelijke enzympreparaten kan een kleine hoeveelheid van de te hydrolyseren ester ofwel een andere bij dit soort kweekmethodes veel gebruikte toevoeging zoals Tween 80 en dergelijke aan het groeimedium worden toegevoegd.

De reactieomstandigheden voor de hydrolyse zijn niet erg kritisch. Hen voert de hydrolyse meestal uit in waterig milieu, maar ook kunnen mengsels van water met organische oplosmiddelen worden gebruikt. De pH wordt ingesteld op een waarde binnen het activiteits-gebied van het enzym, dat is in het algemeen van 2 tot 11 en bij voorkeur van 5 tot 9. De hydrolyse wordt in het algemeen uitgevoerd bij omgevingstemperatuur of bij weinig verhoogde temperatuur, alhoewel verlaagde temperaturen van -10nc tot -20bc, maar ook matig verhoogde temperaturen tot ongeveer 60«C en bij thermostablele enzymen zelfs nog hogere temperaturen mogelijk zijn. Uiteraard kiest men de reaktie-omstandigheden zodanig dat geen storende nevenreakties optreden.

De hydrolyse kan worden uitgevoerd door de ester bij het begin van, tijdens of na de kweek van het desbetreffende micro-organisme aan het kweekmedium toe te voegen. Ook kunnen gecultiveerde cellen, bijvoorbeeld door centrifugeren, worden geoogst en bij het ester bevattend reactiemedium worden gevoegd. In dit geval kunnen zowel celsuspensies als gedroogde cellen, bijvoorbeeld gelyofiliseerde cellen, gesproeidroogde cellen, cellen die behandeld zijn met een organisch oplosmiddel, zoals bijvoorbeeld aceton of tolueen worden gebruikt. Ook kapot gemaakte cellen of extracten van cellen kunnen worden gebruikt.

Hen voert de hydrolyse in het algemeen zo uit dat na vermenging van de ester met het enzym en toevoeging van een buffer door middel van titratie met base de pH binnen het activiteitsgebied van het enzym constant wordt gehouden. Het baseverbruik is een maat voor het voortschrijden van de hydrolyse. Wanneer de gewenste hydrolyse-graad is bereikt, wordt de hydrolyse gestopt en wordt de nog resterende ester uit het reactiemengsel gewonnen, bij voorbeeld door extractie.

De enantiomere overmaat in de niet gehydrolyseerde esterfrac-tie van een ester van 3-Hal-2-methylpropionzuur neemt toe met het voortschrijden van de conversie. Door lang te hydrolyseren en de conversie ver te Laten voortschrijden kan men sterk enantiomeer verrijkte ester overhouden, maar dat gaat ten koste van de opbrengst. Korter durende hydrolyse met geringere conversie levert weliswaar een hogere opbrengst op aan niet gehydrolyseerde ester, maar de ester is dan minder enantiomeer verrijkt. De deskundige zal gemakkelijk in staat zijn om de optimale uitvoeringsvorm te kiezen, maar het zal duidelijk zijn dat het van groot belang is dat een enzympreparaat wordt gebruikt dat de hydrolyse met een zo groot mogelijke enantioselectiviteit doet verlopen. Hiervoor is reeds vermeld dat de enantioselectiviteit ten minste zo groot moet zijn dat bij een esterconversie van ten hoogste 75% een esterfractie overblijft met een enantiomere overmaat D-ester van ten minste 95%. Bij voorkeur is de enantiomere overmaat ten minste 98% en meer in het bijzonder ten minste 99%. Het is voor de economie van het proces gewenst dat de conversie waarbij de gewenste enantiomere overmaat wordt bereikt zo laag mogelijk is. Die conversie mag ten hoogste 75% zijn.

Het volgens de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding bereide D-(-)-3-Hal-2-methylpropionzuur of een ester daarvan kan men op bekende wijze omzetten in het overeenkomstige D-3-acylthio-2-methylpropionzuur of een ester daarvan. De aard van de in te voeren acylthiorest is niet van veel belang en kan zowel alifatisch als aromatisch als van gemengd alifatisch/aromatisch karakter zijn. In het algemeen zal men een verbinding kiezen die relatief goedkoop is en gemakkelijk verkrijgbaar is. Bij voorkeur gebruikt men thioazijnzuur. Het zo verkregen D-3-acylthio-2-methylpropionzuur, resp. een ester daarvan, bij voorkeur D-3-acetylthio-2-methylpropionzuur, resp. een ester daarvan kan men op zichzelf bekende wijze (zie Chem. Pharm.

Buil. 30 (1982), 3139-3146) omzetten in Captopril. Dit is een zeer aantrekkelijke bereiding van Captopril, waarbij de hiervoor vermelde nadelen die zich voordoen bij de bereiding van D-3-acylthio-2-methyl-propionzuur resp. esters daarvan uit een racemisch mengsel worden vermeden.

Er zijn ook met Captopril verwante verbindingen met ACE-remmende werking bekend, die van Captopril verschillen doordat daarin een D-3-acylthio-2-methylpropionzuurrest is gebonden in plaats van de D-3-mercapto-2-methylpropionzuurrest. Ook zijn met Captopril verwante verbindingen bekend waarin in plaats van protine een ander aminozuur is gebonden. Dat aminozuur kan een gesubstitueerd proline, een al dan ' niet gesubstitueerd of geanelleerd picolinezuur of een willekeurig ander aminozuur zijn. Een aantal met Captopril verwante verbindingen is o.a. bekend met: Matthew J. Wyvratt en Arthur A. Patchett, Medicinal Research Reviews (1985 ) 483-531; alsmede uit: Drugs of the future 11, (1986) 116-120 en 12 (1987) 485-486.

Voor de bereiding van al dergelijke verbindingen met een D-3-mercapto-2-methyLpropionzuurrest of een D-3-acylthio-2-methyl-propionzuurrest in het molecuul kan nu met bijzonder voordeel worden uitgegaan van een volgens de uitvinding bereid(e) D-(-)-3-Ha1-2-methylpropionzuur of ester daarvan. Het zal duidelijk zijn dat in wezen de aard van het met het D-3-mercapto resp. acylthio-2-methylpropionzuur gekoppelde aminozuur daarbij van geen belang is. Wanneer de desbetreffende met Captopril verwante verbinding een D-3-acylthio-2-methylpropionzuurrest bevat dan kan het voordelig zijn om het D-(-)-3-Hal-2methylpropionzuur of een ester daarvan om te zetten in het D-3-acylthio-2-methylpropion2uur met dezelfde acylthiorest als in de te bereiden verbinding.

De uitvinding wordt verder verduidelijkt door de volgende voorbeelden, zonder daardoor te worden beperkt.

De resultaten van de voorbeelden zijn in tabelvorm samengevat.

Voorbeeld I

Aan een kaliumfosfaatbuffer (27 ml, 0,05 M, pH 7,0) werd D,L-methyl-3-chloor-2-methylpropionaat (10 ml) toegevoegd. Onder roeren bij QnC werd lipase van Rhizopus del erna r (2 g) toegevoegd waarna de pH op 7,0 werd gehouden m.b.v. automatische titratie met 2M NaOH. Na gedeeltelijke conversie (bepaald via loogverbruik) werd het mengsel aangezuurd tot pH 2,0 en geroerd met tert-butylmethylether (40 ml) gedurende 1 uur. Na centrifugering van het mengsel (5.000-10.000 rpm) werd de organische laag afgescheiden en de waterlaag opnieuw geëxtraheerd met tert-butylmethylether (40 ml). Na centrifugering werden beide organische lagen gecombineerd en gewassen met een verzadigde natriumwaterstofcarbonaat oplossing (2 x 20 ml). De organische laag werd gedroogd met anhydrisch MgS04, gefiltreerd, ingedampt en gedestilleerd onder verminderde druk, en leverde enantiomeer verrijkt D-(-)-methyl-3chloor-2-methylpropionaat op. De gecombineerde natrium-waterstofcarbonaatoplossingen werden aangezuurd tot pH 2,0, geëxtraheerd met tert-butylmethylether (40 ml) waarna de organische laag werd gedroogd (MgS04>, gefiltreerd en ingedampt. Destillatie onder verminderde druk leverde enantiomeer verrijkt L-(+)-3-chloor-2-methyl-propionzuur op.

Uit de gemeten draaiing (via polarimetrie) werd van beide verbindingen de enantiomere excess bepaald en hieruit op bekende wijze (Ching-Shih Chen, loc. cit.) de conversie.

Voorbeeld II

De procedure, zoals beschreven onder voorbeeld I, werd herhaald met dien verstande dat nu, in plaats van de kaliumfosfaat-buffer van een natriumacetaat-azijnzuurbuffer (0,05 M, pH 5,6) werd gebruikt, en de pH op 5,6 werd gehouden.

Voorbeeld III

De procedure, zoals beschreven onder voorbeeld II, werd herhaald met dien verstande dat in plaats van 27 ml natriumacetaat-azi jnzuurbuffer nu 24,3 ml van deze buffer werd gebruikt, aangevuld met 2,7 ml n-dibutylether als cosolvent.

Voorbeeld IV

Aan een kaliumfosfaatbuffer (300 ml, 0,1 M, pH 7,0) werd D,L-methyl-3-chloor-2-methylpropionaat (156 gram) toegevoegd. Onder roeren bij One werd lipase van Candida cylindraceae (10 gram) toegevoegd, waarna de pH op 7,0 werd gehouden zoals beschreven onder vooi-beeld I. Na gedeeltelijke conversie, werd het mengsel aangezuurd en opgewerkt op overeenkomstige wijze als in voorbeeld I.

Voorbeeld V

Aan een kaliumfosfaatbuffer (200 ml, 0,1 M, pH 7,0) werd D,L-methyl-3-chloor-2-methylpropionaat (136,5 gram) en tert-butyl-methylether (100 ml) toegevoegd. Onder roeren bij One werd lipase van

Candida cylindraceae (15 gram) toegevoegd, waarna de pH op 7,0 werd gehouden zoals beschreven in voorbeeld I. Na gedeeltelijke conversie werd het mengsel aangezuurd en op overeenkomstige wijze opgewerkt als in voorbeeld I.

Vergelijkingsvoorbeelden A-C

Aan een kaliumfosfaatbuffer (27 ml, 0,05 M, pH 7,0) werd D,L-methyl-3-chloor-2-methytpropionaat toegevoegd (10 ml). Onder roeren bij 28**C werd telkens een van de onderstaande enzympreparaten toegevoegd. Er trad echter (zelfs na enkele weken roeren) geen enzymatische hydrolyse op.

A: lipase van PeniciIlium roqueforti (Amano, 4 g).

Bs esterase pregastric (Amano, 4 g).

C; protease uit fungus Optimase L 660 (Miles Kali, 2 ml).

Vergelijkingsvoorbeelden D-F

De procedure, zoals beschrevei onder voorbeeld I werd herhaald met dien verstande dat nu, in plaats van lipase uit Rhizopus delemar aangegeven hoeveelheden van andere enzympreparaten gebruikt werden.

Vergelij- Herkomst emzympreparaat conversie D-(-)-methyl-3-Hal-kinsgvoor- (Firma, hoeveelheid) (%) 2-methylpropionaat beeld _ e.e. (X) e.e. ?5(%)*> D lipase van Humicola lanuginosa 16 9 71 (Biocatalysts, 2 g) E acylase uit varkensnier (Sigma, 1 g) 13 5 49 F esterase uit varkenslever (Sigma, 2 ml) 15 9 74 *) e.e. 75(%) ger^t aan welke e.e. theoretische gevonden zou worden bij extrapolatie van de conversie tot 75%.

Voorbeeld VI

De procedure zoals beschreven onder voorbeeld I werd herhaald met dien verstande dat nu in plaats van D,L-methyl-3-chloor-2-methyl-propionaat de overeenkomstige D,L-ethylester in equimolaire hoeveelheid werd gebruikt, alsmede lipase van Rhizopus javanicus.

Voorbeeld VII

De procedure zoals beschreven onder voorbeeld I werd herhaald met dien verstande dat nu in plaats van D,L-methyl-3-chloor-2-methyl-propionaat een equimolaire hoeveelheid van de overeenkomstige 3-broom-verbinding werd gebruikt. De enantiomere overmaat van verrijkt D-(-)-methyl-3-broom-2-methylproprionaat werd bepaald via 400 MHz ^H-NMR met behulp van TRIS-C3-(heptafluoropropylhydromethyleen)-D-camphoratol-Europium-III (Eu(hfc)3) in CDCI3.

Voorbeelden VIII t/m XXV

Het kweken van de microorganismen geschiedde in 1 liter Erlenmeyers gevuld met 500 ml medium, welke onder roeren (150 rpm) werden ge'incubeerd bij 28*»C. Voor bacteriën bestond het medium uit: gistextract (5 g/l), pepton (5 g/l), zetmeel (10 g/l) en D,L-methyl3-chloor-2-methylpropionaat (1 g/l) met een pH van 7,0. Voor gisten en schimmels bestond het medium uit: gistextract (3 g/l), pepton (5 g/l), glucose (10 g/l), moutextract (3 g/l) en D,L-methyl-2-chloor-2-methyl-propionaat met een pH van 5,5. Vijftig uur na het enten werden de gekweekte cellen door middel van centrifugatie geoogst (10 min, 15000g), gewassen met kaliumfosfaatbuffer (50 mM, pH 7,0) en geresuspendeerd in dezelfde buffer. De aldus verkregen celsuspensie werd ofwel direct gebruikt voor de enzymatische hydrolyse ofwel eerst korte tijd diepgevroren (-20nc).

Telkens werd de enzymatische hydrolyse uitgevoerd, zoals beschreven onder voorbeeld I, met de in tabel 2 vermelde microorga-nismen.

TABEL 1

Voorbeeld Herkomst emzympreparaat conversie D-(-)-methyl-3-Hal- (Firma, hoeveelheid) (%) 2-methylpropionaat _e.e. (¾)_*)_ I Rhizopus delemar 72 95 _(Biocatalysts, 2 g)______ II Rhizopus delemar 69 97 _Biocatalysts, 2 g)_ III Rhizopus delemar 64 98 _Biocatalysts, 2 g)_ IV Candida cylindraceae 68 95 _(Sigma, 10 g)_ V Candida cylindraceae 64 98 _(Sigma, 15 g)_ VI Rhizopus javanicus 73 96 _(Amano, 2 g)_ VII Rhizopus delemar 66 98 _(Biocatalysts, 2 g)_ *) N.B. Voorbeeld VI betreft de ethylester.

TABEL 2

Voorb. Microorganismen conversie D-(-)-methyl-3- (%) chloor-2-methyl- _methylester propionaat e.e.(%) VIII Rhodococcus erythropolis NCIB 11538 59 99 IX GliocLadiuin viride CBS 22848 52 96 X Rhodococcus rhodochrous ATCC 21243 59 97 XI Rhodococcus sp. ATCC 4275 53 95 XII Mycobacterium phlei ATCC 15610 62 98 XIII Nocardia tartaricans ATCC 31190 57 96 XIV Rhodococcus rhodochrous ATCC 21197 57 95 XV Rhodococcus sp. 1948 57 95 XVI Rhodococcus sp. ATCC 19071 55 99 XVII Stam TA-2 (NCIB 40069) 64 99 XVIII Stam TB-2 (NCIB 40070) 60 97 XIX Erwinia herbicola ATCC 14589 56 95 XX Stam EE-1 (NCIB 40071) 60 96 XXI Pseudomonas fLuorescens NV DSM 91 (NCIB 40074) 58 96 XXII Xanthomonas hyacinthi NV DSM 49 (NCIB 40073 ) 66 98 XXIII Bacillus cereus NV DSM 6 (NCIB 40072) 67 96 XXIV Verticillium glaucum NV DSM 2011 70 98 XXV Corynebacterium bovis ATCC 7715 64 95

Claims (9)

1. Werkwijze voor de enantioselectieve bereiding van D-(-)-3-Hal-2-methylpropionzuur of derivaten daarvan, met het kenmerk, dat men een ester van 3-Hal-2-methylpropionzuur, waarbij Hal een halogeenatoom en bij voorkeur een chloor- of broomatoom aanduidt, onderwerpt aan de inwerking van een esterbindingen hydrolyse rend enzympreparaat, zodanig dat bij een esterconversie van ten hoogste 75% een esterfractie overblijft met een enantiomere overmaat D-ester van ten minste 95%, en de esterfractie uit het reac-tieproduct wint.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de hydrolyse zodanig uitvoert dat de enantiomere overmaat D-ester ten minste 98% bedraagt.

3. Werkwijze volgens één van de conclusies 1-2, met het kenmerk, dat de enantiomere overmaat D-ester ten minste 99% bedraagt.

4. Werkwijze volgens één van de conclusies 1-3, met het kenmerk, dat het enzympreparaat afkomstig is van een microorganisme uit de groep Rhizopus, Mucor, Verticillium, Gliocladium, Rhodococcus, Nocardia, Xanthomonas, Pseudomonas, Bacillus, Corynebacterium, Mycobacterium, Erwinia.

5. Werkwijze volgens één van de conclusies 1-4, met het kenmerk, dat het enzympreparaat afkomstig is van een microorganisme uit de groep Rhizopus delemar, Rhizopus niveus, Rhizopus javanicus, Rhizopus arrhizus, Rhizopus japonicus, Mucor javanicus, Mucor miehei, Verticillium glaucum, Gliocladium viride, Candida cylindraceae, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus rhodochrous, Nocardia tar-taricans, Xanthomonas hyacinthi. Pseudomonas fluorescens, Bacillus cereus, Corynebacterium bovis, Mycobacterium phlei, Erwinia her-bicola.

6. Werkwijze volgens één van de conclusies 1-5, met het kenmerk, dat het enzympreparaat afkomstig is van een microorganisme uit de groep Verticillium glaucum NV DSM 2011, Gliocladium viride CBS 22848, Rhodococcus erythropolis NCIB 11538, Rhodococcus erythro- polis NCIB 11539, Rhodococcus erythropolis NCIB 11540, Rhodococcus rhodochrous ATCC 21243, Rhodococcus rhodochrous ATCC 21197, Rhodococcus sp. ATCC 4275, Rhodococcus sp. ATCC 19071, Rhodococcus sp. ATCC 19148, Nocardia tartaricans ATCC 31190, Xanthomonas hyacinthi NV DSM 49 (NCIB 40073), Pseudomonas fluorescens NV DSM 91 (NCIB 40074), Bacillus cereus NV DSM 6 (NCIB 40072), Corynebac-terium bovis ATCC 7715, Mycobacterium phlei ATCC 15610, Stam TA-2 (NCIB 40069), Stam TB-2 (NCIB 40070), Stam EE-1 (NCIB 40071), Erwinia herbicola ATCC 14589.

7. Werkwijze volgens één van de conclusies 1-6, met het kenmerk, dat men de esterfractie, die een enantiomere overmaat D-ester bevat, hydrolyseert tot D-(-)-3-Hal-2-methylpropionzuur.

8. Toepassing van volgens één van de conclusies 1-7 bereid D-(-)-3-Hal-2-methylpropionzuur of een ester daarvan voor de bereiding van Captopril of een daarmee verwante verbinding die een D-3-mercapto-2-methylpropionzuurrest of een D-3-acylthio-2-methylpropionzuur-rest bevat.

9. Werkwijzen, bereidingen en toepassingen zoals beschreven in de beschrijving en in de voorbeelden.