JPH10179154A - Ｄ−鏡像異性体とｌ−鏡像異性体との混合物中におけるｄ−鏡像異性体の濃度を減少させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来の２−ハロアルカン酸の光学異性体分離
方法に比べてより低廉な費用で分離が可能な方法を提供
すること。 【解決手段】 シュードモナス属から得られるＤ−２−
クロロまたはブロモアルカン酸ハライドヒドロラーゼを
用いて、Ｄ−鏡像異性体の少なくとも一部が２−ヒドロ
キシアルカン酸またはその誘導体に転化されるような条
件下で、２−クロロまたはブロモアルカン酸のＤ−鏡像
異性体とＬ−鏡像異性体との混合物を処理する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は２−クロロまたはブ
ロモアルカン酸のＤ−鏡像異性体とＬ−鏡像異性体との
混合物中におけるＤ−鏡像異性体の濃度を実質的に減少
させる方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】２−ハロアルカン酸、例えば２−クロロ
プロピオン酸（以下では、便宜上「２−ＣＰＡ」と呼
ぶ）は特にピリジルオキシ−フェノキシ置換アルカン酸
（以下では便宜上「ＰＰＡＡ’ｓ」と呼ぶ）の製造にお
ける中間体として有用である。或る種のＰＰＡＡ’ｓ、
例えばＤ−２−（４−５−（トリフルオロメチル−２−
ピリジルオキシ）フェノキシ）プロピオン酸とその低級
アルキルエステルは、我々のヨーロッパ特許出願明細書
第０００３８９０Ａ号にさらに詳しく述べるように、特
にイネ科植物に対する除草性化合物として有用である。

【０００３】「２−ハロアルカン酸」（以下では、便宜
上「２−ＨＡＡ’ｓ」と呼ぶ）はここでは、カルボキシ
ル基に隣接する炭素原子に１個のフルオロ、クロロ、ブ
ロムまたはヨード・ラジカルを有し、直鎖または分枝鎖
であるアルキル基が２〜６個の炭素原子を含むアルカン
酸を意味する。このアルキル基が、以下で定義する酵素
または細菌と不利に反応しない極性置換基を有する可能
性も除外されるわけではない。

【０００４】２−ＨＡＡ’ｓ中及びＰＰＡＡ’ｓに含ま
れるアルカン酸残基中の２−炭素原子が非対称性炭素原
子であり、このためこの化合物が２つの鏡像異性体形で
存在し得ることは理解されよう。これらの形態の１つを
Ｄ−絶対立体配置すなわち右旋性グリセルアルデヒドと
同じ絶対立体配置を有し、他の形態はＬ−絶対立体配置
を有する。これらの鏡像異性体は互いの鏡像であり、光
学的に活性であり、平明偏光を逆方向に回転させる。

【０００５】ヨーロッパ特許出願明細書第０００３８９
０Ａ号では、特定のＰＰＡＡのＤ鏡像異性体がＬ鏡像異
性体よりも大きい除草活性を有することを述べている。
除草剤「ジクロルプロップ（Ｄｉｃｈｌｏｒｐｒｏ
ｐ）」と「メコプロップ（Ｍｅｃｏｐｒｏｐ）」がＤ
（＋）異性体のみが除草活性を有するラセミ化合物とし
て製造されることは、英国作物保護会議（ｔｈｅ Ｂｒ
ｉｔｉｓｈ Ｃｒｏｐ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｃｏｕ
ｎｃｉｌ）によって刊行された、シー・アール・ワーシ
ングによる編集の「殺虫剤マニュアル（ｔｈｅ Ｐｅｓ
ｔｉｃｉｄｅｓ Ｍａｎｕａｌ）」第７版，１８４頁と
３４５頁にも述べられている。

【０００６】さらに、ＰＰＡＡ’ｓのＤ−鏡像異性体が
対応する２−ＨＡＡのＬ−鏡像異性体から製造され得る
こともヨーロッパ特許出願明細書第０００３８９０Ａ号
に述べられている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ラセミ混合物の光学異
性体分離に基づく従来の方法を用いる２−ＨＡＡのＬ−
鏡像異性体の製造は、費用がかかる傾向がある。我々は
このような製造のための生化学的方法を今回、開発し
た。この方法は２−ＨＡＡのＤ−鏡像異性体を選択的に
脱ハロゲン化して２−ヒドロキシアルカン酸を製造し、
２−ヒドロキシアルカン酸混合物から２−ＨＡＡ Ｌ−
鏡像異性体を分離することに基づくものである。さら
に、２−ヒドロキシアルカン酸がラクテートのＤ−鏡像
異性体である場合には、この方法はＬ−鏡像異性体の営
利的に魅力ある製造方法になる。我々の同時係属英国特
許出願第８４１３１５５号にさらに詳細に述べるよう
に、Ｄ−ラクテートはワルデン反転によって、例えば２
−ＣＰＡの特にＬ−鏡像異性体を製造するのに用いられ
る。

【０００８】２−ＣＰＡのＤ−鏡像異性体及びＬ−鏡像
異性体の両方の立体配置の反転または保持のいずれかに
よるラクテートへの転化を触媒する酵素が公知である
［ウェイトマン（Ｗｅｉｇｈｔｍａｎ）等のジャーナル
・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジィ（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ），１９８２年，１２８巻，１７５５〜１７６２
頁］。２−ＣＰＡのＬ−鏡像異性体のみの反転によるラ
クテートへの転化を触媒する酵素も公知である［リット
ル（Ｌｉｔｔｌｅ）等、ヨーロピアン・ジャーナル・オ
ブ・バイオケミストリィ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１９７１
年，２１巻，９９〜１０９頁］。しかし、２−ＣＰＡの
Ｄ−鏡像異性体のみをラクテートに転化させる酵素は今
までに知られていない。我々は今回、２−ＨＡＡ’ｓも
しくはその適当な誘導体の２−ヒドロキシ化合物への転
化を触媒することはできるが、２−ＨＡＡ’ｓのＬ−鏡
像異性体もしくはその適当な誘導体の２−ヒドロキシ化
合物への転化を触媒することはできない酵素を発見し
た。

【０００９】２−ＨＡＡ’ｓのＤ−鏡像異性体もしくは
その適当な誘導体の２−ヒドロキシアルカン酸もしくは
その適当な誘導体への転化を触媒することはできるが、
２−ＨＡＡ’ｓのＬ−鏡像異性体もしくはその誘導体か
らのハロゲン残基の放出を触媒することはできない酵素
を以下では便宜上「Ｄ−２−ＨＨＡ−ハライドヒドロラ
ーゼ」と呼ぶことにする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、２−ＨＡＡの
Ｄ−鏡像異性体とＬ−鏡像異性体との混合物中における
Ｄ−鏡像異性体の濃度を実質的に減少させる方法であっ
て、Ｄ−鏡像異性体の少なくとも一部が２−ヒドロキシ
アルカン酸またはその誘導体に転化され得るような条件
下で、この混合物をＤ−２−ＨＡＡハライドヒドロラー
ゼで処理する工程を含み、前記Ｄ−２−ＨＡＡハライド
ヒドロラーゼはシュードモナス属から得られる酵素であ
る方法を提供する。

【００１１】また、本発明は、２−ＨＡＡのＤ−鏡像異
性体とＬ−鏡像異性体の混合物中におけるＤ−鏡像異性
体の濃度を実質的に減少させる方法であって、Ｄ−鏡像
異性体の少なくとも一部が２−ヒドロキシアルカン酸に
転化されるような条件下で、この混合物をＤ−２−ＨＡ
Ａハライドヒドロラーゼで処理する段階を嫌気性条件下
で実施することから成る方法を提供する。

【００１２】本発明に用いる２−ＨＡＡは２−ブロモま
たは２−クロロ−プロピオン酸であることが好ましい。
我々のヨーロッパ特許出願明細書第０００３８９０Ａ号
にさらに詳しく述べるように、カルボキシル基が適当な
誘導体の形態である可能性を排除するわけではないが、
カルボキシル基は遊離形または、金属イオンが細胞もし
くは酵素と不利に反応しないような、遊離形の金属塩の
形態であることが好ましい。金属イオンは元素周規律表
の第１Ａ族の金属から誘導されるものであることが好ま
しいが、ナトリウムまたはカリウムであることがより好
ましい。

【００１３】本発明で用いられる細菌としては如何なる
種属の細菌も用いられるが、シュードモナス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ）属の菌株、特にシュードモナス・プチ
ダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）またはシ
ュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）種属の菌株が適切であ
る。

【００１４】本発明において利用する酵素を得るための
ソースとして用いることのできる５種類の菌株は、ザ
ナショナル コレクション オブ インダストリアル
バクテリア（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂａｃｔｅｒ
ｉａ）［イギリス，スコットランド，アバーディーン，
アベイロード１３５，郵便私書箱３１］に寄託されてお
り、次の受入れ番号を与えられている： １．シュードモナス・プチダ ＮＣＩＢ１２０１８ ２．シュードモナス・フルオレッセンス ＮＣＩＢ１２
１５９ ３．ＮＣＩＢ１２１６０ ４．ＮＣＩＢ１２１６１ ５．シュードモナス・プチダ ＮＣＩＢ１２１５８ これらの菌株及び、本発明の細菌のソースとなり得る、
これらから誘導される菌株も本発明の一部を構成する。

【００１５】２−ＨＡＡ’ｓのＬ−鏡像異性体とともに
またはこれの代りに２−ヒドロキシアルカン酸を製造す
るのに用いた場合の本発明の方法も、特に２−ヒドロキ
シアルカン酸が乳酸であるならば本発明の範囲に含まれ
る。

【００１６】前記で定義したようなＤ−２−ＨＡＡ−ハ
ライドヒドロラーゼは例えばシュードモナス・プチダＮ
ＣＩＢ１２０１８のような細菌から、酵素技術で周知の
方法、例えば吸収、溶出及び沈降法によって単離するこ
とができる。例えば、適当な有機体の細胞を例えば細胞
のフレンチプレスで破壊する。ホモジネート懸濁液を例
えば遠心分離または濾過のような通常の生化学的分離方
法によって、固相と液相に分離して、適当な緩衝溶液中
の細胞を含まない抽出物が得られる。適当な緩衝溶液に
は、特にリン酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン（「Ｔｒｉｓ」）、炭酸水素塩、グリシン、イミダゾ
ール等がある。緩衝溶液の濃度は典型的には１ｍＭ〜２
００ｍＭの範囲であり、例えば約２５ｍＭである。

【００１７】細胞を含まない抽出物は特に分子量及び／
または荷重に応じて分子を分離し得る分別方法、例えば
限外濾過、例えばポリアクリルアミドゲル上での電気泳
動または例えばＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム上で
のクロマトグラフィを用いて、分別することができる。
適当なフラクションの確認及び目的の酵素活性を有する
酵素のそれからの単離は当技術上で公知の方法、例えば
ウェイトマン（Ｗｅｉｇｈｔｍａｎ）等がジャーナル
オブ ゼネラル マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ）１９８０年，１２１巻，１８７〜１９３頁に述べて
いる方法を用いて行うことができる。

【００１８】本発明において用いる酵素はＤ−２−ＣＰ
Ａに対する脱ハロゲン化に最適なｐＨ値、８．５〜９．
５を有している。これらの酵素は有機及び無機の緩衝溶
液中で良好な活性を有するが、適当にｐＨを調節した非
緩衝化系においても作用する。

【００１９】２−ＣＰＡを用いる化学プラントに隣接す
る土壌から新規な細菌を単離し、菌株選択法によって、
２−ＨＡＡ’ｓまたはその誘導体の脱ハロゲン化に関し
てすぐれた効能を有する純粋な形態になるように培養し
た。この培養には、娘世代の増殖、単独細胞コロニーの
選択及び公知の発酵培地での増殖は標準方法を用いた。

【００２０】本発明において利用する酵素を得るための
ソースとして上記した、ＮＣＩＢに寄託の５種類の菌株
がＬ−２−ＨＡＡ’ｓまたはその適当な誘導体の対応２
−ヒドロキシ化合物への転化を触媒し得る酵素を含むこ
とが発見された。

【００２１】本発明による方法は細胞内または細胞外Ｄ
−２−ＨＡＡ−ハライドヒドロラーゼを用いて実施する
ことができる。細胞外Ｄ−２−ＨＡＡ−ハライドヒドロ
ラーゼを用いる場合には、細胞は「固定化した」または
「不溶化した」形態であり得る。

【００２２】適当な公知の処置、例えばフロキュレーシ
ョンによって、または本質的に不溶の不活性な担体物質
に物理的または化学的に結合させることによって、酵素
及び細胞を「固定化」または「不溶化」して、酵素及び
細胞を流通反応器への使用を容易にする方法は、技術上
公知である。ここで用いるかぎり、「固定化酵素」また
は「不溶化酵素」なる用語は、不溶性担体物質に物理的
または化学的に結合したまたは不溶性担体物質中に包ま
れた、あるいは不溶性塊状物もしくは凝集塊を形成する
ように処理された酵素または細胞を意味する。固定化さ
れた酵素がこれを通常溶解させるような液体と接触して
も、酵素は担体物質に付着したままである。固定化され
た細胞がこれを通常容易に分散させるような液体と接触
しても、細胞は担体物質に付着したままでまたは凝集塊
として残留する。

【００２３】担体としては種々な物質を用いることがで
きる。例えば、酵素及び細胞を例えば種々なセルロース
誘導体、ポリアミノスチレン床等のような種々な有機物
質、または例えば孔質ガラス及びシリカゲルのような種
々な無機物質に結合させることができる。酵素を種々な
石英質物質に吸着させる方法は、米国特許第３５５６９
４５号に述べられている。無機物質、特にアルカリ耐性
セラミック、が好ましい。

【００２４】酵素及び細胞を例えばポリアクリルアミド
もしくはカラジーナン等のゲルのような適当な不溶性担
体物質中に酵素もしくは細胞を含む方法またはこれらを
凝集させる方法は技術上周知である［バーク（Ｂｕｒｋ
ｅ）、フイロソフイカル トランザクションズ オブ
ザ ローヤル ソサイアティ オブ ロンドン（Ｐｈｉ
ｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｌｏ
ｎｄｏｎ）１９８３年，３００巻，３６９〜３８９頁；
モスバッハ（Ｍｏｓｂａｃｈ）、ストラクチャー アン
ド オーダーイン ポリマーズ レクチャー インター
ナショナル シンポジウム（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎ
ｄ Ｏｒｄｅｒ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｌｅｃｔｕ
ｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｎｐｏｓｉｕ
ｍ）１９８０，ペルガモン １９８１，２３１〜２３８
頁参照］。

【００２５】固定化した酵素または細胞を用いる場合に
は、連続型反応器、より好ましくは流通反応器でこれら
を使用することができる。

【００２６】本発明の方法に細胞内酵素を用いる場合に
は、例えば突然変または遺伝子工学によって適当な細胞
を製造することができる。例えば、Ｄ−２−ＨＡＡハラ
イドヒドロラーゼ及び、Ｌ−２−ＨＡＡもしくはその誘
導体の対応２−ヒドロキシ化合物への転化を触媒し得る
酵素を含む自然生成微生物の細胞に、細胞がＬ−鏡像異
性体に対して不利に反応する可能性を失うような突然変
異処理を行うことができる。この突然変異処理は例えば
紫外線のような適当な電磁線への暴露等の物理的処理ま
たは例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグ
アニジンのような適当な化学薬品による化学的処理であ
る。適当な化学処理にはオルンストン（Ｏｒｎｓｔｏ
ｎ）が述べている方法がある［ジャーナル オブ バイ
オロジカルケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９６６年，
２４１巻，３８００〜３８１０頁］。

【００２７】この代りに、Ｄ−２−ＨＡＡ−ハライドヒ
ドロラーゼを指定する遺伝情報をＤ−２−ＨＡＡ−ハラ
イドヒドロラーゼが自然に生成する微生物から、適当な
異種有機体すなわちＤ−２−ＨＡＡ−ハライドヒドロラ
ーゼが自然に生成しない有機体に移すことができる。例
えば、Ｄ−２−ＨＡＡ−ハライドヒドロラーゼを指定す
る遺伝子を有するプラスミド［カワサキ（Ｋａｗａｓａ
ｋｉ）等のアグリカルチャー アンド バイオロジカル
ケミストリィ（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９８１
年，４５巻，２９〜３４頁］は、例えば塩沈殿方法のよ
うな公知の方法［グエリイ（Ｇｕｅｒｒｙ）等、ジャー
ナル オブ バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ），１９７３年，１１６
巻，１０６４〜１０６６頁］によって単離して、例えば
塩化セシウム−臭化エチジウム密度勾配遠心分離法によ
るような公知の方法によって、さらに精製することがで
きる。遺伝子は例えば形質転換のような公知の方法によ
って異種有機体に導入することができる。この代りに、
例えば細胞抱合によって遺伝子を第二有機体に直接移す
こともできるが、この方法は移動を必要とする［ビーチ
ング（Ｂｅａｃｈｉｎｇ）等、ジエイ・ゲン・マイクロ
バイオル（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１９８
３年，１２９巻，２０７１〜２０７８頁］。

【００２８】Ｄ−２−ＨＡＡ−ハライドヒドロラーゼの
産生に不利な影響を与えず、また２−ＨＡＡ’ｓ Ｌ−
鏡像異性体とも不利に反応することがないと考えられる
適当な異種有機体の例としては、特に大腸菌、メチロフ
ィルス・メチロトロプル（特に、我々の英国特許明細書
第１，３７０，８９２号に記載する菌株、ＮＣＩＢＮ
ｏ．１０５０８〜Ｎｏ．１０５１５及びＮｏ．１０５９
２〜Ｎｏ．１０５９６）及び枯草菌が挙げられる。

【００２９】本発明の方法を細胞内Ｄ−２−ＨＡＡ−ハ
ライドヒドロラーゼの存在下で実施する場合には、適当
な有機体の細胞を通常の増殖培地中で連続法、回分法ま
たは供給回分法によって増殖することができる。増殖培
地は典型的には、無機塩水溶液と、例えばグルコース、
エタノール、酢酸または２−ＨＡＡのような適当な炭素
源とから成る。炭素源の濃度は広範囲にわたって変動し
得るが、一般には１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の範
囲である。増殖期には酸素または酸素含有ガスが存在し
なければならない。増殖期中の培地温度はかなり変化し
得るが、通常は２５℃〜３５℃の範囲である。増殖中の
培地のｐＨは５．５〜８．０の範囲、好ましくは６．５
〜７．５の範囲に維持しなければならない。培養物のサ
イズは例えば１．５ｌ〜５０．０００ｌの範囲でかなり
変動し得る。

【００３０】増殖期後に、細胞を本発明の方法に用い
る。細胞は例えば遠心分離またはフロキュレーションに
よって回収できる、または前記方法に直接用いることが
できる。細胞を回収する場合には、例えばリン酸塩、炭
酸水素塩もしくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン緩衝溶液または水のような、有意な細胞増殖を支持
しない緩衝溶液中に細胞を再懸濁させる。再懸濁した細
胞の濃度は典型的には１〜３０ｇ（乾燥重量）／ｇであ
る。細胞は２０℃〜４０℃の温度に維持し、ｐＨを５．
５〜９．５に維持する。

【００３１】次に、培養物を２−ＨＡＡまたはその適当
な誘導体、例えばその低級アルキルエステルまたは好ま
しくは、例えばナトリウム塩もしくはカリウム塩のよう
なその塩の混合物と技術上周知の方法によって接触させ
る。この細胞懸濁液の生産的な寿命は典型的には５〜１
０００時間である。この期間後に、細胞を遠心分離及び
／またはフロキュレーション及び／または濾過によって
除去する。上清液に新たな細胞を加えて、プロセスをく
り返すことができる。プロセスの最後に、酸性化した水
性反応混合物から適当な極性溶媒による溶媒抽出によっ
て２−ＨＡＡを抽出するのが好ましい。用いることので
きる極性溶媒の例は特にジエチル・エーテル、塩化メチ
レン及びメチルイソブチルケトンである。連続抽出法を
用いるのが特に好ましいが、細胞分離後に （１）水性培地を蒸発させ、残渣を例えばクロロホルム
または塩化メチレンのような適当な溶媒に溶解する； （２）水性培地を適当な吸収剤で処理する、例えばイオ
ン交換カラムに通す；または （３）水性培地を目的化合物がその塩として、例えばカ
ルシウム塩として沈殿するように試薬によって処理する
という可能性を排除するわけではない。

【００３２】酸素圧を減少すると酵素の半減期が増大す
ることを発見したので、本発明の方法は実質的に酸素を
含まない雰囲気下で実施する。この方法は窒素雰囲気で
実施するのが好ましい。

【００３３】本発明に用いる細胞を浸透性化して、細胞
の内外への基質及び生成物の移動を容易にする。適当な
浸透性化処理方法はフエリックス（Ｆｅｌｉｘ）がアナ
リティカル バイオケミストリィ（Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９８２年，１２０
巻，２１１〜２３４頁に述べている。

【００３４】本発明の方法で製造される２−ＨＡＡのＬ
−鏡像異性体は少なくとも８０％、特に少なくとも９５
％及び特に好ましくは少なくとも９９％の光学的純度を
有する。

【００３５】本発明を次の実施例に関連してさらに説明
する。実施例中では次の培地を用いた：クエン酸塩緩衝溶液 ０．１Ｍクエン酸（１４．９ｍｌ）と０．１Ｍクエン酸
三ナトリウム（３５．１ｍｌ）に蒸留水を加えて５００
ｍｌにする。生成した緩衝溶液はｐＨ５．５を有した。

【００３６】バウショップ−エルスドンズ（Ｂａｕｓｃ
ｈｏｐ ａｎｄ Ｅｌｓｄｏｎｓ）培地 （ａ）塩溶液 酸化マグネシウム（１０．７５ｇ）、硫酸亜鉛・七水和
物（１．４４ｇ）、硫酸コバルト・七水和物（０．２８
ｇ）、炭酸カルシウム（２．０ｇ）、硫酸マンガン・四
水和物（１．１２ｇ）、ホウ酸（０．０６ｇ）、硫酸第
一鉄・七水和物（４．５ｇ）、硫酸銅五水和物（０．２
５ｇ）及び濃塩酸（５１．３ｍｌ）を別々に水に溶解し
た。但し酸化マグネシウムと炭酸カルシウムは別々に少
量の濃塩酸に溶解した。これらの溶液を混合し、蒸留水
に加えて１ｌとした。

【００３７】（ｂ）ストック溶液Ａ リン酸二水素カリウム（５００ｇ）、水酸化ナトリウム
（１１０ｇ）及びニトリロ三酢酸（５０ｇ）を蒸留水に
溶解して、２ｌとした。

【００３８】（ｃ）ストック溶液Ｂ 硫酸アンモニウム（２００ｇ）、硫酸マグネシウム・七
水和物（２０ｇ）、硫酸第一鉄・七水和物（１ｇ）及び
前記塩溶液の一部（２００ｍｌ）に蒸留水を加えて２ｌ
とした。

【００３９】（ｄ）Ｂ−Ｅ最少培地 ストック溶液Ａの一部（１０ｍｌ）、ストック溶液Ｂの
一部（１０ｍｌ）及び蒸留水（４８ｍｌ）を混合し、ｐ
Ｈ７．０〜７．２の水溶液とした。

【００４０】（ｅ）Ｂ−Ｅ寒天培地 Ｄｉｆｃｏ Ｂａｃｔｏ寒天を２．０％ ｗ／ｖの濃度
になるようにＢ−Ｅ最少培地に加えた、この濃度では固
体化培地が得られた。

【００４１】培地Ａ 培地Ａは硫酸アンモニウム（５ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ₄・
７Ｈ₂Ｏ（０．８ｇ／ｌ）、硫酸カリウム（０．４５ｇ
／ｌ）、濃リン酸（１．３ｍｌ／ｌ）、ＦｅＳＯ₄・５
Ｈ₂Ｏ（０．０４ｇ／ｌ）及び微量元素溶液（６０ｍｌ
／ｌ）から成る水溶液であった。

【００４２】微量元素溶液は銅（５ｐｐｍ）、Ｍｎ（２
５ｐｐｍ）、Ｚｎ（２３ｐｐｍ）及びカルシウム（７２
０ｐｐｍ）を含むものであった。

【００４３】培地Ｂ 培地Ｂは硫酸アンモニウム（１．８ｇ／ｌ）、硫酸マグ
ネシウム（ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ）（０．２ｇ／ｌ）、塩
化第二鉄（０．９７ｍｇ／ｌ）、リン酸水素カリウム
（Ｋ₂ＨＰＯ₄）（１．９ｇ／ｌ）、リン酸二水素ナトリ
ウム（ＮａＨ₂ＰＯ₄）（１．５６ｇ／ｌ）及び培地Ａに
用いたような微量元素溶液（１ｍｌ／ｌ）から成る水溶
液であった。

【００４４】実施例１ この実施例では、本発明において用いられる酵素製造を
説明する。

【００４５】１． ２−ＣＰＡを分解し得る微生物の単
離 ＨＡＡ’ｓが自然に生成する場所（例えば針葉樹林）及
び合成ＨＡＡ’ｓの保管場所からの土壌サンプル（１
ｇ）を、ＤＬ−２−ＣＰＡのナトリウム塩またはカリウ
ム塩を２０ｍＭの濃度で含むＢ−Ｅ最少培地（１００ｍ
ｌ）中で３０℃において３日間インキュベートした。次
に培養物を１．５％ｗ／ｖ寒天で固化させた上記定義の
培地サンプル上で連続的に希釈し、３０℃においてさら
に３〜７日間インキュベートした。２−ＣＰＡを分解し
得る細菌のコロニー（この１つはシュードモナス・プチ
ダＮＣＩＢ１２０１８であった）を採取して、さらに精
製した。

【００４６】２． ２−ＣＰＡのＤ−鏡像異性体を脱ハ
ロゲン化し得るがＬ−鏡像異性体を脱ハロゲン化できな
い酵素の検出 段階１で単離した、分離したコロニーのサンプルを、２
Ｍ水酸化カリウムの添加によってｐＨ７．０±０．１に
調節したＢ−Ｅ最少培地（２ｌ）中、３０℃において別
々に増殖させた。培養物を１０００ｒｐｍで撹拌し、空
気を０．５ｌ／分で供給した。ＤＬ−２−ＣＰＡのカリ
ウム塩を発酵器に３モル／時の速度で加えた。

【００４７】１６時間後に、培養物を５０００Ｇ、２０
分間の遠心分離によって回収し、細胞を４℃、ｐＨ７の
２５ｍＭリン酸塩緩衝溶液（ＮａＨ₂ＰＯ₄）で洗浄し、
同緩衝溶液１０ｍｌ中に再懸濁させた。これらの細胞を
１２０００ｐｓｉのフレンチ細胞プレスに２回通すこと
によって破壊し、未破壊細胞と細胞破片を１２０，００
０Ｇ、１時間の遠心分離によって除去して、細胞を含ま
ない抽出物を得た。

【００４８】細胞を含まない抽出物のサンプルにポリア
クリルアミドゲル電気泳動を２通りに実施した［ハード
マン（Ｈａｒｄｍａｎ）等、ジャーナル オブ ゼネラ
ルマイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅ
ｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）１９８１年，
１２３巻，１１７〜１２８頁］。電気泳動後に、前記の
ハードマン等の参考文献に述べられているように、各ゲ
ル対の一方を５０ｍＭ Ｄ−２−ＣＰＡ含有緩衝溶液中
でインキュベートし、他方を５０ｍＭ Ｌ−２−ＣＰＡ
含有緩衝溶液中でインキュベートした。

【００４９】この方法は、シュードモナス・プチダ Ｎ
ＣＩＢ１２０１８中に２種類のハライドヒドロラーゼが
存在することを明らかにした。一種類の酵素はＬ−２−
ＣＰＡに対する活性を有するが、Ｄ−２−ＣＰＡに対す
る活性を有さず、第二の酵素はＤ−２−ＣＰＡに対する
活性を有するが、Ｌ−２−ＣＰＡに対する活性を有さ
ず、すなわち、本発明で用いられる酵素であった。

【００５０】［Ｄ−２−ＣＰＡとＬ−２−ＣＰＡはフー
（Ｆｕ）等がジャーナル オブ ザアメリカン ケミカ
ル ソサィアティ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ）
１９５４年，７６巻，６０５４〜６０５８頁に述べられ
ているように製造することができる。）３． デハロゲナーゼの単離 シュードモナス・プチダ ＮＣＩＢ１２０１８から細胞
を含まない抽出物の一部（２５ｍｌ）を、ｐＨ７．５の
２５ｍＭトリス／サルフェート緩衝溶液と予備平衡させ
たＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ カラム（直径４５ｍ
ｍ，高さ６０ｃｍ）上に装入した。このカラムを純粋な
この緩衝溶液及び次に連続的に０．１５Ｍ，０．２Ｍ及
び０．５Ｍ塩化カリウムを含有する緩衝溶液２００ｍｌ
ずつで１００ｍｌ／時の流速度で溶出した。

【００５１】これらの４フラクションのハライドヒドロ
ラーゼ活性を、段階２に述べたように基質としてＬ−２
−ＣＰＡ及びＤ−２−ＣＰＡを用いて分析した。

【００５２】Ｄ−２−ＣＰＡに対する活性は０．１５Ｍ
フラクションのみにおいて検出された。Ｌ−２−ＣＰＡ
に対する活性は０．５Ｍフラクションにおいてのみ検出
された。純粋な緩衝溶液フラクション及び０．２Ｍフラ
クションには、ハライドヒドロラーゼ活性は検出されな
かった。

【００５３】４． Ｄ−２−ＨＡＡハライドヒドロラー
ゼの性質 ０．１５ＭフラクションのハライドヒドロラーゼはＤ−
２−ＣＰＡに対する活性に最適なｐＨ８．８〜９．０を
有する。これは有機緩衝溶液（トリス／サルフェート）
及び無機緩衝溶液（炭酸水素塩／炭酸塩）中で良好な活
性を有し、ｐＨを８．８〜９．０に調節した非緩衝化培
地（例えば蒸留水）中で活性を示す。

【００５４】この酵素は、０．１Ｍトリス／サルフェー
ト、ｐＨ９緩衝溶液中、４℃で貯蔵した場合に、約１０
日間の半減期を有する。

【００５５】この酵素活性は１ＭまでのＤＬ−２−ＣＰ
Ａによって阻害されず、１Ｍ濃度までの反応生成物すな
わち塩化物イオン及びラクテートによって阻害されなか
った。

【００５６】実施例２ この実施例では、Ｄ−２−ＨＡＡハライドヒドロラーゼ
の使用を説明する。

【００５７】シュードモナス・プチダ ＮＣＩＢ１２０
１８からのＤ−２−ＨＡＡハライドヒドロラーゼを含
む、実施例１、段階３で得た０．１５Ｍ溶出フラクショ
ンの一部（１５０ｍｌ）と０．０５Ｍ炭酸水素塩緩衝溶
液（ＮａＨＣＯ₃／Ｎａ₂ＣＯ₃）の混合物に、３０℃に
おいて撹拌しながら、ＤＬ−２−ＣＰＡカリウム塩を加
え、２Ｍ水酸化カリウム水溶液を添加してｐＨを９．０
に維持した。塩化物イオンの放出を監視することによっ
て、反応をフォローアップした。塩化物イオン放出が終
了した後、さらにＤＬ−２−ＣＰＡの追加量を加えた。
５時間後に、塩化物イオンの濃度は８７ｍＭであった。
これにさらにＤＬ−２−ＣＰＡ １６ｇ（１５０ｍｏｌ
ｅ）を加えた。

【００５８】反応混合物をｐＨ４に酸性化し、沈殿した
蛋白質を１０，０００Ｇ、３０分間の遠心分離によって
除去した。透明な上清液をさらにｐＨ２．０に酸性化
し、塩化メチレンで連続的に抽出した。塩化メチレンを
蒸発させて粗２−ＣＰＡ ７．３ｇを得、これを蒸留し
て無色油５．０６ｇの主フラクションを得た。この油は
［α］_D ^30.4（−）１２．５°（Ｃ＝１．７７，ＣＣ
ｌ₄）の旋光度を有し、Ｌ：Ｄ比９２：８の２−ＣＰＡ
に相当した（すなわち８４％鏡像異性体過剰）。生成物
はＩＲとＮＭＲスペクトルによって同定した。

【００５９】実施例３ この実施例はＬ−２−ＣＰＡを脱ハロゲン化できない突
然変異菌株の製造を説明する。

【００６０】Ｌｕｒｉａ 液体培地中のシュードモナス
・プチダ ＮＣＩＢ１２０１８を振とう水浴上で３０℃
において一晩増殖させた。これを新たなＬｕｒｉａ 液
体培地に継代培養し、上記条件で増殖させて、５５０ｎ
ｍで測定した光学密度（以下では便宜上ＯＤ−５５０と
呼ぶ）０．５を得た。

【００６１】この培養物の２通りのサンプル（１５ｍ
ｌ）を遠心分離し、細胞ペレットをクエン酸緩衝溶液
（１５ｍｌ）中Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン
（０．７５ｍｇ）の溶液に別々に再懸濁させた。混合物
を往復振とう機上で３０℃において４５分間インキュベ
ートした。

【００６２】細胞を遠心分離によって回収し、Ｂ−Ｅ最
少培地への再懸濁及び遠心分離によって２回洗浄した。
ペレットをＢ−Ｅ最少培地（５ｍｌ）に懸濁させ、アリ
コート（１ｍｌ）を振とう機フラスコ中のＢ−Ｅ最少培
地（２ｍｌ）と０．３％ピルビン酸ナトリウムに接種し
た。

【００６３】増殖後に、培養物のＯＤ−５５０を測定
し、培養物を希釈し、約１０００細胞／ｍｌとし、Ｂ−
Ｅ寒天培地とピルビン酸ナトリウム（１０ｍｍｏｌｅ）
から成るプレート上にアリコート（０．１ｍｌ）を展
げ、コロニーが出現するまで、３０℃でインキュベート
した。コロニーのサンプルを１０ｍＭ Ｄ−２−ＣＰＡ
と１０ｍＭ Ｌ−２−ＣＰＡを含有するＢ−Ｅ寒天培地
プレート上にレプリカ培養した。レプリカ・プレート対
を比較し、コロニーを単離した。コロニーはＬ−２−Ｃ
ＰＡ上では増殖したが、Ｄ−２−ＣＰＡ上では増殖しな
かった。これらのコロニーをＬ−、Ｄ−２−ＣＰＡ及び
ピルビン酸塩上での増殖に関して比較し、好ましい表現
型を備え、殆んど逆もどりを示さないコロニーを次のテ
スト用に選択した（表１）。

【００６４】

【表１】 単離物のサンプルをＤＬ−２−ＣＰＡ（２０ｍＭ）含有
のＢ−Ｅ最少培地（２０ｍｌ）中、３０℃において振と
うさせながら一晩増殖させた。培養物を１０，０００Ｇ
において２０分間遠心分離し、細胞をトリス／サルフェ
ート緩衝溶液（０．１Ｍ，ｐＨ８．８）（１０ｍｌ）中
に再懸濁させた。各細胞懸濁液を２アリコートに分割し
た。

【００６５】各アリコート対の１つにＤ−２−ＣＰＡを
４０ｍＭまで加え、他方はＬ−２−ＣＰＡを４０ｍＭま
で加えた。次に各アリコートを３０℃において振とうし
ながら２４時間インキュベートし、塩化物イオンの放出
をフォローアップした。

【００６６】一種類の突然変異体（以下では便宜上、Ａ
ＪＩ−２３と呼ぶ）はＤ−２−ＣＰＡから細胞乾燥重量
１ｇにつき塩化物８．５ｍｍｏｌｅ／時の速度で、塩化
物を放出したが、Ｌ−２−ＣＰＡからは放出しなかっ
た。

【００６７】実施例４ この実施例はＤ−２−ＣＰＡから塩化物イオンを放出す
るがＬ−２−ＣＰＡからは放出することのできない突然
変異菌株の使用を説明する。

【００６８】突然変異株、実施例３で製造したＡＪＩ−
２３のサンプルを、炭素源として０．３％ｗ／ｖピルビ
ン酸ナトリウムを含有するＢ−Ｅ液体培地上で、０．１
／時の希釈率によるケモスタット培養（５００ｍｌ）と
して、３０℃において１ｖ／ｖ／分で通気しながら増殖
させた。ケモスタット廃棄ポットからの使用済み培養物
５ｌを遠心分離によって回収した。

【００６９】２−ＣＰＡラセミ体のカリウム塩２００ｍ
ｍｏｌを含有する０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム／炭酸塩
緩衝溶液（１８０ｍｌ）、ｐＨ９中の細胞を再懸濁させ
た。反応混合物を３０℃において５００ｒｐｍで撹拌
し、４Ｍ水酸化カリウム水溶液を添加してｐＨを８．８
に維持した。２２時間後に、廃棄ポットからの細胞をさ
らに加え、反応をさらに２０時間続けた。次に遠心分離
によって細胞を除去した。上清液を濃硫酸によってｐＨ
４に酸性化し、生成する沈殿を遠心分離によって除去し
た。透明な溶液を塩化メチレンで抽出し、２−ＣＰＡの
Ｌ−鏡像異性体（３．５ｇ）を単離した。これは光学純
度８２％を有することがわかった（６４％鏡像異性体過
剰）。

【００７０】実施例５ この実施例は本発明による突然変異菌株の鏡像異性体純
度の高いＬ−２−ＣＰＡ製造への利用を説明する。

【００７１】実施例３で製造した突然変異菌株ＡＪＩ−
２３のサンプルを、実施例４で説明したように、ケモス
タット培養として増殖させた。

【００７２】培養物の一部（４００ｍｌ）を用いて、培
地Ａ（６ｌ）に接種し、混合物に０．７５ｇ／ｌ／時の
率でグルコースを連続的に加えた。混合物を５００ｒｐ
ｍで撹拌し、空気を４ｌ／分で通気し、２Ｍ ＮａＯＨ
の添加によってｐＨを７．０に維持し、温度を３０℃に
維持した。２４時間後に、細胞密度が細胞乾燥重量約８
ｇ／ｌになったときに、グルコースの添加を停止した。
次にＤＬ−２−ＣＰＡを２０ｍｍｏｌｅ／時の速度で２
０時間加えた。細胞を遠心分離によって回収した。

【００７３】回収した細胞の一部（乾燥重量８ｇ）を、
ＤＬ−２−ＣＰＡナトリウム塩（１０８ｇ）を含有する
５０ｍＭリン酸カリウム（９００ｍｌ）（ｐＨ７．４）
中に再懸濁させ、この混合物を２５０ｒｐｍで撹拌し、
温度を３０℃に維持し、混合物の上に窒素を通過させ
て、混合物の上方に本質的に酸素を含まないブランケッ
トを維持し、ｐＨを７．４±０．２に維持するために必
要に応じて４Ｍ水酸化ナトリウム溶液を加えた。

【００７４】２０時間反応させた後に、塩化物イオンは
もはや放出されなくなってから、反応混合物を２つの部
分に分割した（部分ＡとＢ）。部分Ａを硫酸によってｐ
Ｈ１に酸性化し、けいそう土を通して濾過し、塩化メチ
レンによって連続的に抽出し、塩化メチレン抽出物を油
状物（２５．５２ｇ）になるまで、蒸発乾燥させた。シ
ョートパス蒸留によって、０．８７％四塩化炭素溶液と
して［α］_D ³⁰−１３．３°を有するフラクションを得
た。このフラクションはＮＭＲによって２％未満のＤ−
２−ＣＰＡを含むＬ−２−ＣＰＡ（すなわち９６％鏡像
異性体過剰）であることが判明した。

【００７５】実施例６ この実施例は適当な担体に固定した、本発明による細菌
の存在下でのＤ−２−ＣＰＡからの塩化物イオンの放出
を説明する。

【００７６】実施例４で述べたようにケモスタットで増
殖させたＡＪＩ−２３（乾燥重量０．４ｇ）、３０％ｗ
／ｖアクリルアミド水溶液（６．１ｍｌ）、２％ｗ／ｖ
ビスアクリルアミド水溶液（１．２５ｍｌ）及び１Ｍト
リス−サルフェート緩衝溶液ｐＨ８．７（１０．７５ｍ
ｌ）から成る混合物を真空下で脱気し、次に、Ｎ，Ｎ，
Ｎ¹，Ｎ¹，−テトラメチル−エチレンジアミン（３７μ
ｌ）と１０％ｗ／ｖ過硫酸アンモニウム（６０μｌ）を
加えて、重合を開始させた。３０分後に、生成した固定
化細胞含有固体ゲルを１０ｍｌ注射器のオリフィスから
押し出し、１Ｍトリス／サルフェート緩衝溶液で洗浄し
た。

【００７７】前記固定化細胞をＤＬ−２−ＣＰＡナトリ
ウム塩（５ｍｍｏｌｅ）含有の０．５Ｍリン酸塩緩衝溶
液（ｐＨ８）（１０ｍｌ）中、３０℃において緩和に振
とうしながらインキュベートした。塩化物イオン放出を
フォローアップすることによって、細胞活性を評価し
た。塩化物イオン放出は少なくとも２００時間続き、こ
のときに塩化物イオン濃度は１３０ｍＭになった。

【００７８】実施例７ Ｄ−２−ＨＡＡハライドヒドロラーゼを含む環境からの
付加的微生物の単離塩素化塩を汚染物として含む、イギ
リスの各地から集めた土壌サンプル（２ｇ）を、唯一の
炭素源として２０ｍＭ ＤＬ−２−ＣＰＡナトリウム塩
を含有する無機塩培地（培地Ｂ）１００ｍｌ中で、３０
℃において振とうしながらインキュベートした。３日後
に、このようにして製造した、各濃縮培養物のアリコー
トを連続希釈後に上記の寒天固化培地上で培養した。２
〜５日後に出現した微生物コロニーを単離し、標準の微
生物学的方法によって純粋形になるように培養した。

【００７９】各有機体のサンプルを同培地２００ｍｌ中
で１６時間増殖させた後、細胞を遠心分離によって回収
し、２０ｍＭトリス／サルフェート緩衝溶液（ｐＨ７．
８）中に再懸濁させて、乾燥重量約５０ｇ／ｌの細胞密
度を得た。Ｌ−２−ＣＰＡ、Ｎａ⁺塩とＤＬ−２−ＣＰ
Ａ、Ｎａ⁺塩の両方の各有機体による脱塩素化速度を実
施例２に述べたように測定した。Ｌ−２−ＣＰＡよりも
ＤＬ−２−ＣＰＡに対して高い脱塩素化速度を示した有
機体をさらに研究した（表２）。

【００８０】このような有機体の細胞を含まない抽出物
を実施例１に述べたように製造し、これらのデハロゲナ
ーゼ補体を前述したように電気泳動によって調べた。ゲ
ルをＬ−２−ＣＰＡ及びＤ−２−ＣＰＡに対する活性に
関して調べた。各デハロゲナーゼ蛋白質の基質特異性が
注目された（表３）。Ｄ−２−ＣＰＡに特異的なデハロ
ゲナーゼがＬ−２−ＣＰＡに対して活性を示さないこと
が発見された。

【００８１】

【表２】

【表３】 実施例８ シュードモナス・プチダと突然変異体ＡＪＩ−２３から
のＤ−２−ＨＡＡ−ハライドヒドロラーゼの、ラセミ体
混合物としてのＤ−２−ブロモプロピオン酸（Ｄ−２−
ＢＰＡ）選択的脱臭素化への利用。

【００８２】実施例１に述べたように製造した酵素製剤
の１００μｌアリコートを０．５Ｍリン酸カリウム緩衝
溶液ｐＨ７．３中で種々の濃度のＤＬ−２−ＣＰＡ、Ｎ
ａ⁺塩とともに３０℃において１６時間インキュベート
した（最終量５ｍｌ）。

【００８３】実施例３におけるように製造した突然変異
体ＡＪＩ−２３を上記と同様に処理した（最終細胞濃
度、乾燥重量１ｇ／ｌ）。１６時間後に、反応混合物中
の臭化物イオン量を上記と同様にＭａｒｉｏｕｓ Ｃｈ
ｌｏｒｏ−Ｏ−カウンターで測定した。各場合に、ＤＬ
−２−ＢＰＡの５０％が脱臭素化され、異性体特異性で
あることを示した（表４）。

【００８４】

【表４】 実施例９ 突然変異有機体ＡＪＩ−２３に含まれるＤ−２−ＣＰＡ
を用いた、半工業的規模での鏡像異性体高過剰のＬ−２
−ＣＰＡの製造。

【００８５】突然変異体ＡＪＩ−２３を０．３％ｗ／ｖ
ピルビン酸ナトリウム及び１０ｍＭＤＬ−２−ＣＰＡ含
有の、実施例４で用いた無機塩培地の培養物２×６００
ｍｌ中で３０℃において増殖させた。２４時間後に、次
の成分： ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ １．０１ｇ／ｌ （ＮＨ₄）₂・ＳＯ₄ ６．３ｇ／ｌ Ｋ₂ＳＯ₄ ０．５７ｇ／ｌ ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０５ｇ／ｌ ＭｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．００７８ｇ／ｌ ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．００７８ｇ／ｌ ＣｕＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．００１５ｇ／ｌ ＣａＣｌ₂ ０．１５ｇ／ｌ Ｈ₂ＳＯ₄（濃） ０．１５ｇ／ｌ グルコース ８．０ｇ／ｌ リン酸（比重１．７５） ０．８８ｇ／ｌ を含有する培地５００ｌ中で両培養物をインキュベート
した。

【００８６】これを３０℃において８００ｒｐｍで撹拌
し、アンモニアの添加によってｐＨを７．０に維持し
た。２０時間後に、さらに５０ｍＭ ＤＬ−２−ＣＰＡ
を含む新しい培地を絶えず添加することによって（希釈
率０．１／時）、連続培養した。培養物を同じ率で取り
出し（細胞乾燥重量５ｇ／ｌ）、遠心分離により濃縮し
て１０％ｗ／ｖ細胞スラリーを得た。

【００８７】４５０ｌ−温度調節ジャケット付き容器内
の次の成分： 水 １２８ｋｇ ＤＬ−２−ＣＰＡ ２３ｋｇ 及び リン酸二水素ナトリウム ２ｋｇ を含有する溶液に、３２％水酸化ナトリウム溶液を加え
てｐＨを６．０に高めた。次に２０％ ＮａＯＨ液を徐
々に加えることによって、ｐＨをさらに７．２に高め
た。容器ジャケットを通して水を循環させて、温度を３
０℃に維持した。容器内容物を６０ｒｐｍで撹拌した。

【００８８】上述のように製造した、細胞２ｋｇ（乾燥
重量）を含有する細胞スラリー２０ｋｇをこの容器に装
入し、内容物上方に窒素ブランケットを供給した。Ｎａ
ＯＨ液の添加によって判定して全てのＤ−２−ＣＰＡが
脱塩素化されるまで、ｐＨを７．２に制御して反応を進
行させた（７．５時間）、次に硫酸（７８％）を加え
て、ｐＨを１．５に減じた。Ｃｌａｒｃｅｌｆｌｏ １
（濾過助剤）（６ｋｇ）を加え、１時間濾過した。次
に、このバッチをフィルタープレスに通し、透明な濾液
を回収した。

【００８９】濾液の一部（８００ｇ）をメチルイソブチ
ルケトン（ＭＩＢＫ）（４００ｇ）に加え、室温で２０
分間撹拌した。次に内容物を沈殿させて分離して、水性
ラフイネートとＭＩＢＫ抽出物とを得た。水性ラフイネ
ートを次にＭＩＢＫで抽出した。Ｃｌａｒｃｅｌｆｌｏ
１（１０ｇ）をＭＩＢＫ抽出物に加え、次に濾過し
て、ＭＩＢＫ抽出物を一緒にした。ＭＩＢＫ抽出物を反
応器に装入し、ＮａＯＨ（１３．４７％ ｗ／ｗ溶液、
８６．７ｇを加えた）。５分間撹拌し、沈降分離させた
後、透明な水層に硫酸を加えて、ｐＨ７．０に調節し、
２−ＣＰＡ、ナトリウム塩の２８〜３０％ ｗ／ｗ溶液
を得た。ＮＭＲによる分析（実施例２はこれが９８％超
鏡像異性体過剰（Ｌ−２−ＣＰＡ ９９．４％：Ｄ−２
−ＣＰＡ０．６％）でＬ−２−ＣＰＡナトリウム塩であ
ることを示した。

【００９０】実施例１０ 本発明による細胞を含まない酵素の嫌気的使用。

【００９１】シュードモナス・プチダ菌株ＮＣＩＢ１２
０１８を増殖させ、これから実施例１で述べたようにＤ
−２−ＨＡＡ−ハライドヒドロラーゼ酵素を単離した。
細胞を含まない抽出物の０．１５Ｍフラクションの一部
（１ｍｌ）をＤＬ−２−ＣＰＡナトリウム塩５ｍｍｏｌ
ｅ及びトリス／サルフェート緩衝液（ｐＨ９．０）５ｍ
ｍｏｌｅと混合して全体量を１０ｍｌとした。これを２
通りに実施した。この１つのサンプルを１００ｍｌ−三
角フラスコに入れ、３０℃の振とう水浴（６０往復／
分）中でインキュベートした。第二サンプルも同様にイ
ンキュベートしたが、この場合には窒素雰囲気を用い
た。両方の場合に、Ｄ−２−ＣＰＡからの塩化物イオン
放出をフォローアップした。結果は表５に示す。この表
から窒素雰囲気下では酵素が空気雰囲気下よりも高い率
で長期間にわたって塩化物イオンを放出することがわか
る。

【００９２】

【表５】 実施例１１ 本発明による細胞結合酵素の嫌気的使用 突然変異菌株ＡＪＩ−２３を実施例３に述べたように製
造し、実施例１のシュードモナス・プチダＮＣＩＢ１２
０１８の増殖に用いた条件下で増殖させた。

【００９３】製造した培養物を遠心分離して、細胞スラ
リーを得た。細胞乾燥重量３．２ｇに相当するスラリー
の一部を、ＤＬ−２−ＣＰＡナトリウム塩２５０ｍｍｏ
ｌｅとリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）５０ｍｍ
ｏｌｅ含有の水５００ｍｌ中に懸濁させた。これを１ｌ
ガラス容器中で３０℃において撹拌しながら（２５０ｒ
ｐｍ）、インキュベートした。２Ｍ ＮａＯＨを添加し
て、ｐＨ７．４に維持することによって、Ｄ−２−ＨＡ
Ａ−ハライドヒドロラーゼの活性をフォローアップし
た。第二の反応では、窒素を反応混合物の表面上に通し
て、嫌気性雰囲気を維持した。

【００９４】結果を表６に示す。これらの結果は窒素雰
囲気下の反応が空気雰囲気下の反応に比べて高い率で長
期間持続することを示した。

【００９５】

【表６】

【００９６】

【発明の効果】本発明の方法によれば、従来の光学異性
体分離方法を用いる場合に比べて、より低廉な費用で２
−ハロアルカン酸のＬ−鏡像異性体を得ることが可能に
なった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:125）

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２−クロロまたはブロモアルカン酸のＤ
   −鏡像異性体とＬ−鏡像異性体との混合物中におけるＤ
   −鏡像異性体の濃度を実質的に減少させる方法であっ
   て、Ｄ−鏡像異性体の少なくとも一部が２−ヒドロキシ
   アルカン酸またはその誘導体に転化されるような条件下
   で、前記混合物をＤ−２−クロロまたはブロモアルカン
   酸ハライドヒドロラーゼで処理する工程を含み、前記Ｄ
   −２−クロロまたはブロモアルカン酸ハライドヒドロラ
   ーゼはシュードモナス属から得られる酵素である前記方
   法。
2. 【請求項２】 嫌気性条件下で実施する請求項１記載の
   方法。
3. 【請求項３】 ２−クロロまたはブロモアルカン酸が２
   −クロロまたはブロモプロピオン酸である請求項１また
   は２記載の方法。
4. 【請求項４】 ２−ヒドロキシアルカン酸の製造に用い
   る請求項１ないし３のいずれか１項記載の方法。
5. 【請求項５】 ２−ヒドロキシアルカン酸が乳酸である
   請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 Ｄ−２−クロロまたはブロモアルカン酸
   ハライドヒドロラーゼ処理を窒素雰囲気下で実施する請
   求項２記載の方法。