JPH09234089A - ヒドロキシビフェニル類の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物を用いたヒドロキシビフェニル類の有
利な製造法を提供すること。 【解決手段】 ４位および／または４´位に置換基を有
しないビフェニル類に、バシラス属に属する微生物を作
用させて酸化反応を行ない、前記ビフェニル類の４位お
よび／または４´位にヒドロキシ基を導入する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリエステル、ポ
リウレタン等のモノマーの原料や有機合成中間体として
有用なヒドロキシビフェニル類の製造法に関する。さら
に詳しくは、微生物を用いたヒドロキシビフェニル類の
有利な製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒドロキシビフェニル類の製法として
は、ビフェニルスルホン酸類をアルカリ溶融する方法が
一般的である。

【０００３】一方、微生物を用いた酸化反応は、微生物
があたかも空気中の酸素を活性化して酸化を行う触媒の
ように働くため経済的に有利であり、微生物の種類を選
択すれば工業的に有用な手段になりうる。たとえば、微
生物によるビフェニルの代謝では、Cunninghamella属や
Absidia 属の真菌が４−ヒドロキシビフェニルや４，４
´−ジヒドロキシビフェニルを生産することは知られて
いる(R.D.Schwartz,A.L.Williams,and D.B.Hutchinson,
Applied and Environmental Microbiology,1980,p.702-
708)。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの真菌
では、増殖が遅く、培地の組成が複雑であるという不利
がある。本発明はかかる問題を解決するためになされた
ものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく、ビフェニル類に作用させる微生物につい
て鋭意検討を重ねた結果、バシラス属に属する微生物を
用いれば前記目的を達成できることを見出した。

【０００６】すなわち、本発明は、４位および／または
４´位に置換基を有しないビフェニル類に、バシラス属
に属する微生物を作用させて酸化反応を行ない、前記ビ
フェニル類の４位および／または４´位にヒドロキシ基
を導入することを特徴とするヒドロキシビフェニル類の
製造法に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明では、基質として４位およ
び／または４´位に置換基を有しないビフェニル類を用
いる。すなわち、本発明の基質であるビフェニル類とし
ては、ビフェニルの他に、２位、３位、５位、６位、２
´位、３´位、５´位および６´位のいずれか少なくと
も１つにアルキル基を有する化合物を使用できる。な
お、アルキル基としては、炭素数１〜５程度のものが好
ましい。

【０００８】本発明に使用されうる微生物は、バシラセ
アエ（Bacillaceae ）科のバシラス属に属するグラム陽
性の有芽胞桿菌であり、好ましくはバシラス ブレビス
（Bacillus brevis ）、特に好ましくは平成６年９月７
日に工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した、受
託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４５２５である。バシラスブ
レビスは土壌常在の通性嫌気性菌で、耕地、河川、公
園、山林などあらゆる土壌中に芽胞の状態で分布してお
り、周毛性べん毛を有し、運動性を示すグラム陽性の有
芽胞桿菌であって菌体の中央またはやや中央に楕円形の
芽胞が存在する。

【０００９】前記微生物の培養には、通常、微生物の培
養に用いられる栄養源を含む液体培地が使用されうる。
前記栄養源は、炭素源および窒素源として肉エキス、ペ
プトンなどが用いられる。さらに、たとえばリン、マグ
ネシウム、鉄、マンガン、ＮａＣｌなどの無機物質およ
びビタミン類などが適宜混合されうる。そのような培地
の例としては、たとえば蒸留水に魚（カツオ）肉エキ
ス、ポリペプトン、ＮａＣｌを溶解した液体培地があげ
られる。培地は滅菌することが必要である。滅菌は通常
の高圧蒸気滅菌などにより行なうことができる。

【００１０】前記微生物は、本発明の製造法に用いる前
に、通常の条件、たとえば、ｐＨ５〜９、好ましくはｐ
Ｈ６．５〜７．５にて、１５〜４０℃、好ましくは２５
〜３５℃の温度で所望の濁度となるまで、１２〜４８時
間、前培養を行なってもよい。前培養を行なった培養物
の中に直接基質を加えて反応を行なってもよいし、基質
を入れた反応用の溶液中に前記培養物を適量加えてもよ
いし、または前培養後に遠心分離によって菌体を集めて
反応に用いてもよい。

【００１１】反応の際に用いられる液体の種類はとくに
限定されないが、たとえば、蒸留水、前記した液体培地
などを用いてもよい。液体培地を用いる場合は、希釈さ
れた液体培地を用いると反応の収率が上昇するので好ま
しい。

【００１２】本発明における「希釈された培地」および
「希釈培地」とは、通常用いられる量の栄養源を含有す
る液体培地を希釈してえられる培地を意味するが、少な
くとも炭素源が通常用いられる量より少なく含有され
る。好ましくは１／２〜１／２０量、より好ましくは１
／５〜１／１０量含有される培地をも含みうる。前記液
体培地の培地１０００ｍｌ中に栄養源の含有量はたとえ
ば魚肉（カツオ）エキス（和光純薬社製、魚肉エキス
（（カツオ製）、水分３０％含有）１０ｇ、ポリペプト
ン（日本製薬社製、総窒素１２．５〜１４．５％、アミ
ノ酸窒素５．０〜６．５％含有）１０ｇ、ＮａＣｌ２ｇ
である。希釈された液体培地は、好ましくは２〜２０
倍、より好ましくは５〜１０倍に滅菌水を用いて希釈さ
れたものである。

【００１３】反応液中の微生物の菌体量は、菌体が基質
および反応液に適切に接触しうるように選択するとよ
く、１〜１０ｇ菌体／１００ｍｌ反応液、好ましくは２
〜５ｇ菌体／１００ｍｌ反応液で行なうとよい。菌体の
量が少ないと基質との接触の効率が低く、また菌体の量
が多すぎると菌体による反応の効率が低下する。

【００１４】菌体は、前記の前培養された菌体をそのま
ま用いてもよいが、支持体に固定化された菌体を用いる
と繰り返し利用でき、また、プロダクトインヒビション
の原因となりうるヒドロキシビフェニル類を流通循環
法、回分法（バッチ法）または半回分法などによって反
応液から除くことができ、さらに連続的に多量のビフェ
ニル類を反応させることができるので好ましい。支持体
用材料としてはたとえばカラギーナン、アルギン酸、寒
天類などの、海藻からえられた多糖類を含む種々のゲル
化基剤、またはポリアクリルアミド、ポリビニルアルコ
ール、ポリアクリル酸（塩）などのゲル化能を有する吸
水性ポリマーがあげられる。これら支持体用材料のうち
とくにカラギーナン、アルギン酸を用いることが好まし
い。支持体の形状はとくに限定されないが好ましくは球
状である。たとえば、ゲル化にともなって菌体を固定化
する手順として、支持体用材料を含む液体を加熱して
溶解したのち冷却し、ゲル化時に菌体を加える、支持
体用材料を溶液としたのち菌体を加え、ナトリウム塩、
カルシウム塩などの金属塩溶液中に滴下してゲル化させ
る、などがあげられる。支持体用材料のゲル化にともな
って菌体を固定化する際、アセトン、ジメチルスルホキ
シドなどの有機溶媒が添加される。前記においては支
持体用材料を含む液体を加熱溶解ののち、熱による菌体
への影響および熱によって前記有機溶媒が蒸発すること
を考慮して、固定化を３０〜５５℃にて行なうことが好
ましい。前記支持体用材料としてカラギーナンを用いて
の手順を行なうばあい、固定化は以下の方法にしたが
って行なうとよい。蒸留水１２０ｍｌ対してκ−カラギ
ーナン１．０〜２．０ｇ、好ましくは１．２〜１．６ｇ
を添加して４５〜５５℃にて溶解し、菌体２〜５ｇを加
える。この液に０．１〜２．０ｍｌ、好ましくは０．５
〜１．５ｍｌ、より好ましくは１．０ｍｌのアセトンを
加えたのち、２１〜２５ゲージ、好ましくは２１〜２２
ゲージの注射針を取付けた注射器を用いて２〜３％塩化
カリウム水溶液５００〜１０００ｍｌ中に滴下し、最大
直径が１〜５ｍｍ、好ましくは２〜４ｍｍ、とくに好ま
しくは約３ｍｍである粒状の菌体固定化物をうる。

【００１５】基質であるビフェニル類に前記微生物を反
応させる際、ビフェニル類を粉砕したものをそのまま添
加してもよいが、ビフェニル類は水に難溶性であるた
め、有機溶媒を少量用いて（１〜１０ｍｌ有機溶媒／１
００ｍｌ反応液、１〜５０ｍｇ基質／ｍｌ有機溶媒、好
ましくは４〜５ｍｇ基質／ｍｌ有機溶媒）溶解した後に
添加するとよい。有機溶媒はメタノール、アセトニトリ
ルのような親水性が高いものを用いたばあいにヒドロキ
シビフェニル類が生成しにくいので、親水性の低いも
の、たとえばアセトン、ジメチルスルホキシドなどが好
ましい。基質は反応初期に一括して添加しても、分割し
て添加してもよい。基質は反応液中１％（ｗ／ｖ）以下
程度、好ましくは０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）となる
よう添加するとよい。加える基質濃度が高すぎてもまた
低すぎても、反応率は低下する。反応はたとえばＬ字管
または坂口フラスコなどを用いて、通常１５〜４０℃、
好ましくは２５〜３５℃にて、反応産物量が一定値に達
するまで５〜３０時間、好ましくは１２〜２４時間行な
う。固定化菌体を用いたばあい、反応は４８〜９６時
間、好ましくは６０〜８０時間行なう。反応産物量は、
おそらくはプロダクトインヒビションにより一定値にと
どまると考えられるので、反応産物を反応液中から逐次
採取しながら反応を継続することにより、さらに高い収
率が得られる。

【００１６】反応時のｐＨは６．０〜９．０、好ましく
はｐＨ６．５〜８．０に調製するとよい。６．０より低
いｐＨでは反応が充分に行なわれず、９．０より高いｐ
Ｈで行なうと反応の効率は著しく低下する。反応は通
常、振とうまたは撹拌しながら行なう。反応終了後、ヒ
ドロキシビフェニル類を反応液から採取するには、一般
的な単離方法が採用されうる。すなわち、反応液より遠
心などによって菌体を除去したのち、エチルエーテルま
たは酢酸エチルなどを用いて２〜３回程度抽出し、乾
燥、減圧濃縮などを行なう。得られた抽出物は、カラ
ム、好ましくはシリカゲルカラムに付して精製し、ヒド
ロキシビフェニル類を単離する。シリカゲルカラムにて
精製する際、石油エーテル／ジエチルエーテル＝８／２
の溶媒を用いることが好ましい。精製、単離した反応産
物は、ＮＭＲ、質量分析、元素分析およびＨＰＬＣなど
の通常の分析方法により分析されうる。また単離した産
物の定量は、ＨＰＬＣなどを用いて行なうことができ
る。

【００１７】

【実施例】つぎに実施例により本発明をより詳細に説明
するが、これら実施例はもとより本発明の範囲を限定す
るものではない。なお、生成物の％は、基質に対するモ
ル％である。

【００１８】実施例１ 坂口フラスコ（５００ｍｌ）に、魚肉エキス（（カツオ
製）、和光純薬社製）１０ｇ、ポリペプトン（日本製薬
社製）１０ｇおよびＮａＣｌ２ｇを蒸留水１０００ｍｌ
中に溶解し、ｐＨ７．０に調製して１２０℃で20分高圧
蒸気滅菌した培地をそれぞれ２５０ｍｌ入れ、バシラス
ブレビス（平成６年９月７日に工業技術院生命工学工
業技術院研究所に寄託した（受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−
１４５２５））を一白金耳接種して、３０℃にて４８時
間振とう前培養し、充分に菌体を増殖させた。この培養
液を１０ｍｌ取り、基質であるビフェニルを１０μモル
のアセトンの溶液として調製し、０．１ｍｌ添加した。
添加後、３０℃にて７０時間振とうし、酸化反応を行な
った。反応終了後、反応液を５ｍｌの酢酸エチルで３回
抽出した後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を留去
し、メタノール１ｍｌに溶解した。このメタノール溶液
をＨＰＬＣ（カラム Ｃ−１８、４ｍｍ φ×１５０ｍ
ｍ、溶媒：メタノール／水（４０／６０〜９５／５）グ
ラジエント法、流速１ｍｌ／分、検出波長２３０ｎｍ）
により、市販試薬を標準試料として同定するとともに内
部標準法により、４−ヒドロキシビフェニルおよび４，
４´−ジヒドロキシビフェニルの定量を行なった。その
結果、４−ヒドロキシビフェニル８％、４，４´−ジヒ
ドロキシビフェニル０．５％が得られていることを確認
した。

【００１９】実施例２ 実施例１において、反応時間を２４時間とし、基質のア
セトン溶液を添加する前に培養液５ｍｌを遠心管にと
り、菌体を遠心分離し、蒸留水で洗浄した後、蒸留水を
加える操作を行った他は実施例１と同様の操作を行なっ
た。その結果、４−ヒドロキシビフェニル５％、４，４
´−ジヒドロキシビフェニル０％が得られていることを
確認した。

【００２０】比較例１ 実施例１において、培養液５ｍｌの代わりに実施例１で
用いた魚肉エキス（（カツオ製）、和光純薬社製）１０
ｇ、ポリペプトン（日本製薬社製）１０ｇおよびＮａＣ
ｌ２ｇを蒸留水１０００ｍｌ中に溶解し、ｐＨ７．０に
調製して１２０℃で２０分高圧蒸気滅菌した培地５ｍｌ
加えることによって酸化反応時に菌体を存在させないこ
と以外は実施例１と同様の操作を行った。その結果、４
−ヒドロキシビフェニルおよび４，４´−ジヒドロキシ
ビフェニルのいずれも確認できなかった。

【００２１】比較例２ 実施例１において、基質であるビフェニルのアセトン溶
液を加えないこと以外は実施例１と同様の操作を行っ
た。その結果、４−ヒドロキシビフェニルおよび４，４
´−ジヒドロキシビフェニルのいずれも確認できなかっ
た。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ４位および／または４´位に置換基を有
   しないビフェニル類に、バシラス属に属する微生物を作
   用させて酸化反応を行ない、前記ビフェニル類の４位お
   よび／または４´位にヒドロキシ基を導入することを特
   徴とするヒドロキシビフェニル類の製造法。
2. 【請求項２】 前記微生物がバシラス ブレビスである
   請求項１記載の製造法。
3. 【請求項３】 前記酸化反応が希釈された培地中で行な
   われる請求項１または２記載の製造法。
4. 【請求項４】 前記培地が２〜２０倍に希釈された培地
   である請求項３記載の製造法。