JPH0315394A

JPH0315394A - フタル酸分解系巨大プラスミドおよびこれを含有する微生物

Info

Publication number: JPH0315394A
Application number: JP15074989A
Authority: JP
Inventors: Taiji Oshima; 大嶋　泰治; Takatoshi Nomura; 恭稔野村
Original assignee: Japan Synthetic Rubber Co Ltd
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 1989-06-14
Filing date: 1989-06-14
Publication date: 1991-01-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、自己伝達能をもつフタル酸および／またはそ
の塩を分解するために必要な遺伝子を含む巨大ブラスミ
ドおよびそれを含有する微生物に関する。

〔従来の技術〕

シュードモナス　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属す
る微生物は、土壌中における炭化水素系化合物分解物質
分解の中心的役割を果たしている微生物である。このよ
うな微生物の炭化水素系化合物の分解能の一部はプラス
ミドによって支配されていることが、米国のＣｈａｋｒ
ａｂａｒｔｙらの研究（　Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙ，＾
．Ｍ．ｌ９７６：＾ｎ，　ＲｅＶ．Ｇｅｎｅｔ．　，　
１２６＋　４１０）により明らかにされた。また、彼ら
は、炭化水素系化合物の分解に関与するシュードモナス
属に属する微生物およびその類縁微生物のプラスミドを
、分解系プラスミド（ｄｅｇｒａｄａｔｉｖａ　ｐｌａ
ｓｍｉｄ）と呼び、自己伝達能を持つ分子量の比較的大
きいブラスミドと、伝達能を持たない分子量の比較的小
さいプラスミドとに大別した。前者の様に分解能が伝達
性ブラスミドにコードされている場合には、微生物間の
接合伝達により分解系プラスミドを微生物間に広く伝播
させることができる。このような微生物を利用すること
により、炭化水素系化合物を容易に浄化することができ
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、フタル酸および／またはその塩の分解に関与し
、自己伝達能を有する分解系プラスミドについては全く
知られておらず、例えば、プラスチック製造段階で廃液
中に多量混入するフタル酸および／またはその塩の浄化
はかなり困難を伴うものであった。このような状況に於
いて本発明はフタル酸および／またはその塩の分解能を
微生物に付与し得るプラスミド、ならびに当該プラスミ
ドを含有する微生物を提供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

すなわち、本発明はシュードモナス属に属する微生物に
由来し、フタル酸および／またはその塩を分解するため
に必要な遺伝子を含み、自己伝達能を有する分子量３０
Ｍｄａ１以上の分解系巨大ブラスミド（以下単に「自己
伝達性フタル酸分解系巨大プラスミド」という）、及び
該巨大プラスミドを含有し、フタル酸および／またはそ
の塩の分解能を有するシュードモナス属に属する微生物
を提供するものである。

なお、本発明において塩とは、アルカリ金属塩、アルカ
リ土類金属塩など、例えばナトリウム塩、カリウム塩、
マグネシウム塩、カルシウム塩などを示すものである。

本発明の自己伝達性フタル酸分解系巨大プラスミドは、
例えば次のごとくして得られる。

（１）　　フタル酸分解系巨大プラスミドフタル酸を分
解するために必要な遺伝子を含む分解系プラスミド（以
下単に「フタル酸分解系巨大プラスミド」という〉は、
フタル゛酸を唯一の炭素源またはエネルギー源として利
用し得る能力を有し、かつ、フタル酸を４．５−ジヒド
ロ−４．５−ジヒドロキシフタル酸および／またはその
塩、４．５−ジヒドロキシフタル酸および／またはその
塩、プロトカテキン酸および／またはその塩の順に分解
する微生物より、常法、例えば、ＣａｓＢｅらの方法（
Ｃａｓ８ｓ，　Ｆ，　．　Ｃ．Ｂｏｕｃｈａｒ，　Ｊ．
　Ｓ．Ｍｉｃｈｅｌａｎｄ　　Ｊ．ロ６ｎａｒ　ｉ６，
１９７９　：　Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，，＋
１３．２１９）あるいは、ＨａｎａａｎとＯｌｓｅｎの
方法（Ｈａｎｓｅｎ，　Ｊ．Ｂ，　，　ａｎｄ　Ｒ．Ｈ
．Ｏｌｓａｎ，　１９７８：Ｊ．Ｂａｃｔａｒ　ｉｏ１
、　．　１３５＊　２２７）などにより巨大プラスミド
を調製し、アガロースゲル電気泳動によよ、分子量が３
０Ｍｄａｌ以上であるプラスミドを分離する方法により
得られる。

（２）　　自己伝達性を持つフタル酸分解系巨大プラス
ミド（１）で得たフタル酸分解系巨大プラスミドを、例えば
フタル酸を資化できない微生物にプレート法、液体法、
メンプランフィルター法などの接合伝達法（Ｉｌａｌｔ
ａｒ，Ｍ．Ｖ．，＾．Ｐｏｒｔｅｏｕｓａｎｄ　Ｒ．　
Ｊ．　Ｓａｉｄｌｅｒ．　１９Ｂ７：＾ｐｐｌ，　Ｂｎ
ｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１、　．　５３．　１０
５）を用いて、伝達し、自己伝達性分解系巨大プラスミ
ドを受容した微生物を見出し、この微生物より常法に従
い本発明の自己伝達性フタル酸分解系プラスミドを得る
。

以上において本発明の自己伝達性フタル酸分解系巨大プ
ラスミドの供給源となる微生物としては、例えば本発明
者が自然界より初めてフタル酸分解菌として分離、同定
したシュードモナス・プチダＮＭＨｌ０２−２　（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ　ＮＭ｝１１０２−２
）を挙げることができる。

なお、本菌株の菌学的性質は以下のとおりである。

シュードモナス・プチダＮＭＨ１０２〜２ａ》　形態的
性質 ■形大きさ ■　運動性鞭毛 ■　胞子 ■　ダラム染色ｂ）生理的性質 ■　脱窒反応　　　　　陰性 ■　肝テスト　　　　　陰性 ■　ｖｐテスト　　　　　陰性桿菌０．５Ｘｌ〜２μｍあり極鞭毛ｌ〜４本なし陰性インドールの生戊　なし硫化水素の生産　　なし澱粉加水分解能　　なしゼラチン加水分解能　なしカゼイン加水分解能　なし色素の生戒　キングＢ培地で水溶性蛍光色素生戒ウレアーゼ　　　　陰性オキシダーゼ　　　陽性カタラーゼ　　　　陽性リパーゼ　　　　　陰性アルギニンジヒドロラーゼ　陽性ポリーβ−ヒドロキシブチレート（ＰＨ８）の蓄積　　なしプロトカテキン酸の開裂　オルト開裂４１℃での生育　　陰性ｐＨ３．　６　　　　　　　陰性栄養要求性　　　　なし酸素に対する特性　絶対好気性トドテスト　　　　酸化的 ■　資化性　　Ｄ−グルコース、Ｄ−マンニトール、Ｌ
−アラビノース、Ｄ−フラクトース、クエン酸、ブロピオン酸、安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息番酸、酢酸Ｃ》　各種培地における生育状態 ■　肉汁寒天平板　生育良好、円形、金縁、淡黄褐色 ■　肉汁寒天斜面　生育良好、糸状 ■　肉汁液体　　　生育良好、白濁、被膜形威、沈渣あ
り ■　肉汁ゼラチン穿刺　生育良好、液化せず ■　リトマスミルク　　アルカリ性以上の菌学的性質は、バージイーズ・マニュアル・オブ
・システマチック・バクテリオロジー第１巻（Ｂａｒｇ
ｅｙ’ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＳｙｓｔｅｎａｔｉｃ
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ，　１）における
シの菌学的性質と同一のものである。

しかし、従来、自己伝達性フタル酸分解系巨大ブラスミ
ドを含有する微生物は知られていないことから、本菌株
はシュードモナス属に属する新規な菌株である。そこで
、本菌株を前記のようにシュードモナス・プチダＮＭ旧
０２−２と命名し、通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第１０２０１号（ＦＢＲＭ　Ｐ−１０２０１）として寄託
した。

本発明の自己伝達性フタル酸分解系巨大プラスミドを含
有させる微生物（以下、「受容菌」という）としては、
巨大プラスミドが安定に保持される菌であればよく、広
くダラム陰性菌が適用される。しかし、本発明の自己伝
達性フタル酸分解系巨大プラスミドは、シュードモナス
属に属する微生物に由来のプラスミドであるため、プラ
スミドの複製やフタル酸分解系遺伝子転写を良好１こな
らしめるためには、受容菌としてシュードモナスに属す
る微生物を用いることが好ましい。なお、本発明の自己
伝達性フタル酸分解系巨大プラスミドが有する遺伝子の
フタル酸分解様式は、例えば、次に示すとおりである。

■ ここで、［！．，　Ｂ．およびＥ，は上記式で示される
反応を司る酵素を示し、８，はフタル酸オキシゲナーゼ
とフタル酸オキシゲナーゼリダクターゼ、ロ，は、２．
６−シクロヘキサジエン−４．５＝ジオールー１．２−
ジカルボン酸デヒドロゲナーゼ、Ｂｌは４．５−ジヒド
ロキシフタル酸デカルボキシラーゼを示す。また、本発
明の自己伝達性フタル酸分解系巨大プラスミドにはこれ
らの酵素を生産する遺伝子が存在し、これらの遺伝子は
オペロンを形或している。なお、これらの遺伝子には調
節遺伝子が接続されており、フタル酸非存在下では、フ
タル酸分解系遺伝子の発現が抑制されている。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により具体的に脱明する。

実施例１（１）　　フタル酸を唯一の炭素源、エネルギー源とし
て生育することのできる微生物を獲得するために、各地
の土壌、ヘドロ、活性汚泥、廃水などを４６試料集め、
これらをフタル酸を唯一の単素源とする培地による集積
培養を行い、１１６株のフタル酸資化性菌を分離した。

このうち、３４株を選びフタル酸の分解経路を検討した
結果、フタル酸を４．５−ジヒドロキシフタル酸からプ
ロトカテキン酸へと分解する代謝系をもつＳ株が３２株
あり、同定の結果、これらのうち２０株はシュードモナ
ス属に属していることが分かった。その内訳は、シュー
ドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉ
ｄａ）が５株、シュードモナス・シュードアル力リゲネ
ス（Ｐｓａｕｄｏａ＋ｏｎａｓｐｓｅｕｄｏａ　ｌｃａ
　１　ｉｇｅｎｅｓ）が１株、シュードモナス０アシド
ヴオランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏ
ｒａｎｓ）が５株、シュードモナス・テストステロニ（
Ｐｓａｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔｅｓｔｏｓｔａｒｏｎｉ）
が８株、そしてシュードモナス・シコードフラバ（Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｓｅｕｄｏｆ　ｌａｖａ）が１株
であった。

（２）下記組成のｐＨ７に調製した培地（以下、「培地
Ａ」という）１０ｄに、（１）で得られたフタル酸資化
性ａｌｌ白菌耳をそれぞれ接種し、３０℃で２４時間培
養した。

ＮＨ４Ｃ１　　　　　　　　　　１．　０ｇκＨｉＰＯ
ｓ　　　　　　　　　　２．　ＯｇＭｇＳＯａ・７　Ｈ
＊０　　　　　　　０．５ｇＫＣＩ　　　　　　　　　
　　０．　５ｇＦｅＣＩｓ　’　６　Ｈ＊Ｏ　　　　　
　　Ｏ．　００１ｇ（’ａｃｌｉ　　　　　　　　　　
Ｏ．　ＩｇＢロＴ＾　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．１ｇＣＬＩＳＯ４　’　　５　　Ｈ
＊ロ　　　　　　　　　　　５μｇｔｌｓＢＯｓ　　　
　　　　　　　１μｇＭｎＣ１ｎ　　　　　　　　　　
１μｇ蒸留水　　　　　　　　　ｌ１集菌後、Ｈａｎｓａｎと０１ｓｅｎの方法（Ｈａｎｓａ
ｎ，　Ｊ．Ｂ，　，ａｎｄ　　Ｒ．Ｈ．ロ１ｓａｎ．１
９７８：Ｊ，Ｂａｃｔａｒｉｏ１、，１３５，２２７）
に従ってロＮ＾をｇＩｉ＠シ、０．７％（ｗ／ｖ）のア
ガロース水平ゲル電気泳勤により、保有しているプラス
ミドの分子量を決定した。なお、分子量の決定には、０
．７％（Ｗ／Ｖ＞のアガロース水平ゲルにおいて、約３
０Ｍｄａｌから１　４　０　Ｍｄａｌの間では、標準と
なるプラスミドの電気泳動上の移動度と、その既知の分
子量とは直線関係にある。（矢野圭司．１９８１．蛋白
質・核酸・酵素、２６：４９９−５１２）ことを利用し
た。また、分子量の標準マーカーとしてｐＴＮ　２　　
（７４　Ｍｄａｌ；Ｎａｋａｚａｗａ，Ｔ．，Ｂ，Ｈａ
ｙａｓｈｉ，Ｔ．　Ｙｏｋｏｔａ，　Ｙ．　Ｂｂｉｎａ
　ａｎｄ　Ａ　Ｎａｋａｚａｗａ．１９７８：Ｊ，　Ｂ
ａｃｔａｒｉｏ１、．　１３４．　２７０）Ｊ　ＲＰ４
（３６　Ｍｄａｌ；Ｊａｃｏｂｙ．　Ｇ．＾，　，　Ａ
．　Ｂ．Ｊａｃｏｂ　ａｎｄ　Ｒ．　Ｉｆ，　Ｈａｄｇ
ａｓ１９，７６：Ｊ．８ａｃｔｅｒｉｏ１、．　１２７
．　１２７８）を用いた。

この結果、５株のシュードモナス属に属するフタル酸資
化性細菌が分子量が３０Ｍｄａｌ以上の巨大プラスミド
を保持しており、このうち神奈川県の化学工場の活性汚
泥から分離したシュードモナス・プチダＮＭＨ１０２−
２株（ＦＯＲＭ　Ｐ−１０２０１）からは約１３０Ｍｄ
ａｔ　、三重県の化学工場の廃水から分離したシュード
モナス・ブチダは、約８５Ｍｄａ　ｔの分子量のプラス
ミドを保持していた。

（３）（２）で確認された巨大プラスミドを保持するフ
タル酸資化性菌の内、ＮＭＨ１０２−２株の保持する巨
大プラスミドの上にフタル酸分解系遺伝子および自己伝
達能に関与する遺伝子がコードされているかを調べるた
めに、メチオニン要求性でフタル酸を資化できないシュ
ードモナス・プチダＰｐＹ１０１株（Ｆｕｋｕｄａ．　
Ｍ．　．κ，Ｙａｎｏ　１９８５：＾ｇｒｉｃ　Ｂｉｏ
１、Ｃｈｅｍ．　，　４９．　２７１９３の染色体上に
トランスポゾン５を挿入することによりカナマイシン耐
性マーカーを付与した株ＰｐＹ１０１−Ｔｎ５を受容体
として、接合伝達法により巨大プラスミドが伝達させ、
受容菌がフタル酸資化能を付与されるかを調べた。

接合伝達は、メンプランフィルター法（ｌａｌｔｅｒ．
Ｍ．Ｖ．．＾．Ｐｏｒｔｅｏｕｓ　ａｎｄ　Ｒ．Ｊ．Ｓ
ｅｉｄｌｅｒ．１９８７：＾ＰＰＩ．Ｒｒ＋ｖｅｒｏｎ
，　ｌｌｉｃｒｏｂｉｏｌ，　５３．　１０５＞を用い
た。すなわち、ＮＭＨ１０２−２株とＰｐＹ１０１−Ｔ
ｎ５株をそれぞれＬＢ培地に接種し、３０℃でｌ８時間
振盪培養を行った。それぞれをＬＢ培地に希釈し、さら
に、６００ｎｍの光学濃度（００−ａ−）　＝　０．　
５〜０．８になるまで振盪培養を行った。集菌後、２回
ＬＢ培地で洗浄し、ＮＭＨ１０２−２株とＰｐＹ１０１
一丁ｎ５株の比が２＝１になるように混合し、５０〜１
００μｌずつ、ＬＢ寒天培地上においたニトロセルロー
スフィルター（ＴＯＹＯ　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　Ｎｉｔ
ｒａｔｅ恥＾０４５＾０２５＾〉上に乗せ、３０℃で５
時間接合させた。ニトロセルロースフィルター上の菌を
１一のフタル酸培地Ａで洗い取り、適当に希釈後、１０
０μｇ／一のカナマイシンと、２０μｇ／一のメチオニ
ンとを添加した０．４重量％フタル酸寒天培地および２
０μｓ／ｄのメチオニンを添加した０．４重量％コハク
酸寒天培地に広げた。

この結果、ＮＭＨ１０２−２株は、１．５　ＸＩＯ−＠
の割合（フタル酸寒天培地での生育コロニー数／コハク
酸寒天培地での生育コロニー数）でＰｐＹ１０１−Ｔｎ
５株に巨大プラスミドを接合伝達し、それに伴い、フタ
ル酸資化能も付与されることが分かった。これより、こ
れらの自己伝達性フタル酸分解性巨大プラスミドをＰＨ
Ｔプラスミドと名づけた。

また、これらの巨大ブラスミド上にフタル酸分解系遺伝
子がコードされていることを遺伝子レベルで確認するた
めに，　ＮＭ旧０２−２株からクローンしたフタル酸分
解系遺伝子の一部をａｓｐでラベルしたＤＮＡ断片をプ
ローブにして、ＰＨＴプラスミドとハイブリダイゼイシ
ョン実験を行い、それらが結合することを確認した。こ
れらの結果から、これらＰＨＴプラスミドは自己伝達能
を有し、その上には少なくともフタル陵をプロトカテキ
ン酸および／またはその塩に分解する酵素群をコードす
る遺伝子が存在することが分かった。

〔発明の効果〕

本発明の自己伝達性フタル酸分解系巨大プラスミドを利
用することにより、増殖力は強力だが、フタル酸分解能
を有さない微生物を、遺伝子組換えなどの人為的な手法
を用いずに新規な微生物に転換せしめることができる。

このような新規な微生物を用いることにより、例えばプ
ラスチック製造段階で廃液中に多量混入するフタル酸の
浄化を効果的に行うことが可能になる。

以上

Claims

【特許請求の範囲】１、シュードモナス属に属する微生物に由来し、フタル
酸および／またはその塩を分解するために必要な遺伝子
を含み自己伝達能を有する分子量の３０Ｍｄａｌ以上の
分解系巨大プラスミド。２、請求項１記載の分解系巨大プラスミドを含有し、フ
タル酸および／またはその塩の分解能を有するシュード
モナス属に属する微生物。