JPH119294A - Ｓ，ｓ−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸の製造法 - Google Patents
Ｓ，ｓ−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸の製造法Info
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- JPH119294A JPH119294A JP18596297A JP18596297A JPH119294A JP H119294 A JPH119294 A JP H119294A JP 18596297 A JP18596297 A JP 18596297A JP 18596297 A JP18596297 A JP 18596297A JP H119294 A JPH119294 A JP H119294A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】リアーゼ活性を有する微生物または該処理
物の存在下、フマル酸とエチレンジアミンの混合物から
Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を酵
素反応により製造する方法において、フマル酸およびエ
チレンジアミンの総仕込み濃度をそれぞれ５００〜２５
００ｍＭおよび２５０〜１２５０ｍＭとし、水酸化アル
カリまたはアンモニアにより反応液のｐＨを７．５〜
９．５の範囲に調整し、反応温度を０〜４５℃の範囲と
する。 【効果】反応系の基質を高濃度に仕込み、さらに諸条件
を最適化することにより、フマル酸とエチレンジアミン
からのＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ製造における酵素反応収率を飛
躍的に改善し、効率的にＳ，Ｓ−ＥＤＤＳならびにその
ナトリウム塩等を製造できる。
物の存在下、フマル酸とエチレンジアミンの混合物から
Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を酵
素反応により製造する方法において、フマル酸およびエ
チレンジアミンの総仕込み濃度をそれぞれ５００〜２５
００ｍＭおよび２５０〜１２５０ｍＭとし、水酸化アル
カリまたはアンモニアにより反応液のｐＨを７．５〜
９．５の範囲に調整し、反応温度を０〜４５℃の範囲と
する。 【効果】反応系の基質を高濃度に仕込み、さらに諸条件
を最適化することにより、フマル酸とエチレンジアミン
からのＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ製造における酵素反応収率を飛
躍的に改善し、効率的にＳ，Ｓ−ＥＤＤＳならびにその
ナトリウム塩等を製造できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は微生物の作用により
フマル酸とエチレンジアミンからＳ，Ｓ−エチレンジア
ミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する方法に関する。
Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸は重
金属を補足するという特異な性質を持ち、自然界に放出
された後に生分解を受け易く、キレート剤、洗剤用ビル
ダーや写真用漂白剤などの用途が見込まれる。
フマル酸とエチレンジアミンからＳ，Ｓ−エチレンジア
ミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を製造する方法に関する。
Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸は重
金属を補足するという特異な性質を持ち、自然界に放出
された後に生分解を受け易く、キレート剤、洗剤用ビル
ダーや写真用漂白剤などの用途が見込まれる。
【０００２】
【従来の技術】エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク
酸（以下ＥＤＤＳと略記）の立体異性体混合物（Ｓ，Ｓ
−、Ｒ，Ｒ−、ｍｅｓｏ−体）は有機合成的手法により
マレイン酸とエチレンジアミンから〔米国特許第3,158,
635 号参照〕、また、その光学活性体であるＳ，Ｓ−体
はＬ−アスパラギン酸とジブロムエタンから〔John A.N
eal et al. Inorganic Chem. ７, 2405 (1968) 参
照〕、各々製造できるとの報告がある。しかし、Ｌ−ア
スパラギン酸とジブロムエタンからの製法では、製造原
料が比較的高価であるため、安価で汎用性のある光学活
性体を供給することは困難である。
酸（以下ＥＤＤＳと略記）の立体異性体混合物（Ｓ，Ｓ
−、Ｒ，Ｒ−、ｍｅｓｏ−体）は有機合成的手法により
マレイン酸とエチレンジアミンから〔米国特許第3,158,
635 号参照〕、また、その光学活性体であるＳ，Ｓ−体
はＬ−アスパラギン酸とジブロムエタンから〔John A.N
eal et al. Inorganic Chem. ７, 2405 (1968) 参
照〕、各々製造できるとの報告がある。しかし、Ｌ−ア
スパラギン酸とジブロムエタンからの製法では、製造原
料が比較的高価であるため、安価で汎用性のある光学活
性体を供給することは困難である。
【０００３】一方、微生物による製造に関しては、Ｓ，
Ｓ−ＥＤＤＳが放線菌ＭＧ４１７−ＣＦ１７株の培養液
からホスホリパーゼＣの特異的阻害剤として単離同定さ
れており〔T. Nishikiori et al., J. Antibiotics 37,
426 (1984) 参照〕、これらの放線菌を用いて発酵法に
よりＳ，Ｓ−ＥＤＤＳを生産する方法が提案されている
が〔PCT/EP96/01868号公報参照〕、製造時に微生物の生
育を伴うため、生産物の高濃度蓄積が難しく生産性に限
界がある。
Ｓ−ＥＤＤＳが放線菌ＭＧ４１７−ＣＦ１７株の培養液
からホスホリパーゼＣの特異的阻害剤として単離同定さ
れており〔T. Nishikiori et al., J. Antibiotics 37,
426 (1984) 参照〕、これらの放線菌を用いて発酵法に
よりＳ，Ｓ−ＥＤＤＳを生産する方法が提案されている
が〔PCT/EP96/01868号公報参照〕、製造時に微生物の生
育を伴うため、生産物の高濃度蓄積が難しく生産性に限
界がある。
【０００４】一方、本発明者らは、先に、微生物由来の
酵素反応によりフマル酸と各種ジアミンから効率よく光
学活性ジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸など
を製造する新規な方法を提案した〔特願平8-79404 号明
細書、EP 0731171 A公報参照〕。しかしながら、収率の
面で必ずしも充分な成果を得るに至らなかった。
酵素反応によりフマル酸と各種ジアミンから効率よく光
学活性ジアミノアルキレン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸など
を製造する新規な方法を提案した〔特願平8-79404 号明
細書、EP 0731171 A公報参照〕。しかしながら、収率の
面で必ずしも充分な成果を得るに至らなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】この問題を解決する方
法として、本発明者らは、既に該反応系にマグネシウム
等の多価金属イオンを存在させることにより反応収率を
大幅に向上させる方法を見出している〔特願平9-124700
および及び同9-31399 号明細書参照〕。ところで、Ｓ，
Ｓ−ＥＤＤＳをキレート剤や洗剤用ビルダーとして使用
する際には、ナトリウム等の１価の陽イオンとの塩とし
て用いるのが一般的であるが、上記多価金属イオンを用
いる反応においては、鉱酸等を用いて、一旦、Ｓ，Ｓ−
ＥＤＤＳを晶析、回収後、水酸化ナトリウム等のアルカ
リを添加して塩にする必要があり、操作面および晶析後
の母液中に含まれる多量の無機塩等の処理の面、さらに
は使用した多価金属の除去の面で問題があった。したが
って、本発明は、微生物によるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの製造
において、反応収率を向上させ、効率的にＳ，Ｓ−ＥＤ
ＤＳならびにそのナトリウム塩等を製造することを課題
とする。
法として、本発明者らは、既に該反応系にマグネシウム
等の多価金属イオンを存在させることにより反応収率を
大幅に向上させる方法を見出している〔特願平9-124700
および及び同9-31399 号明細書参照〕。ところで、Ｓ，
Ｓ−ＥＤＤＳをキレート剤や洗剤用ビルダーとして使用
する際には、ナトリウム等の１価の陽イオンとの塩とし
て用いるのが一般的であるが、上記多価金属イオンを用
いる反応においては、鉱酸等を用いて、一旦、Ｓ，Ｓ−
ＥＤＤＳを晶析、回収後、水酸化ナトリウム等のアルカ
リを添加して塩にする必要があり、操作面および晶析後
の母液中に含まれる多量の無機塩等の処理の面、さらに
は使用した多価金属の除去の面で問題があった。したが
って、本発明は、微生物によるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの製造
において、反応収率を向上させ、効率的にＳ，Ｓ−ＥＤ
ＤＳならびにそのナトリウム塩等を製造することを課題
とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、この課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、反応系の基質を高
濃度に仕込み、さらに諸条件を最適化することにより、
フマル酸とエチレンジアミンからのＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ製
造における酵素反応収率を飛躍的に改善し、効率的に
Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳならびにそのナトリウム塩等を製造で
きることを見い出し本発明に到達した。
を解決すべく鋭意研究を行った結果、反応系の基質を高
濃度に仕込み、さらに諸条件を最適化することにより、
フマル酸とエチレンジアミンからのＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ製
造における酵素反応収率を飛躍的に改善し、効率的に
Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳならびにそのナトリウム塩等を製造で
きることを見い出し本発明に到達した。
【０００７】すなわち、本発明は、リアーゼ活性を有す
る微生物または該処理物の存在下、フマル酸とエチレン
ジアミンの混合物からＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，
Ｎ’−ジコハク酸を酵素反応により製造する方法におい
て、フマル酸およびエチレンジアミンの総仕込み濃度を
それぞれ５００〜２５００ｍＭおよび２５０〜１２５０
ｍＭとすること、水酸化アルカリまたはアンモニアによ
り反応液のｐＨを７．５〜９．５の範囲に調整するこ
と、および反応温度を０〜４５℃の範囲とすることを特
徴とするＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハ
ク酸の製造法である。
る微生物または該処理物の存在下、フマル酸とエチレン
ジアミンの混合物からＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，
Ｎ’−ジコハク酸を酵素反応により製造する方法におい
て、フマル酸およびエチレンジアミンの総仕込み濃度を
それぞれ５００〜２５００ｍＭおよび２５０〜１２５０
ｍＭとすること、水酸化アルカリまたはアンモニアによ
り反応液のｐＨを７．５〜９．５の範囲に調整するこ
と、および反応温度を０〜４５℃の範囲とすることを特
徴とするＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハ
ク酸の製造法である。
【０００８】本発明は、基質の濃度、反応液のｐＨおよ
び反応温度が、それぞれ上記条件において、化学平衡点
を基質側から、より生成物側へ移動させるとの本発明者
による実験的知見に基づくものである。
び反応温度が、それぞれ上記条件において、化学平衡点
を基質側から、より生成物側へ移動させるとの本発明者
による実験的知見に基づくものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】上記化学平衡点は、例外なく、触
媒の種類に左右されることはない。したがって、諸条件
を等しくした場合、本発明における化学平衡点は副反応
やその他の反応が関わらない限り、すべての触媒につい
て一様の値を示す。すなわち、本発明の触媒であるリア
ーゼがいずれの微生物由来であるかは、それがＳ，Ｓ−
ＥＤＤＳを生成する能力を有する限り、特に限定されな
い。
媒の種類に左右されることはない。したがって、諸条件
を等しくした場合、本発明における化学平衡点は副反応
やその他の反応が関わらない限り、すべての触媒につい
て一様の値を示す。すなわち、本発明の触媒であるリア
ーゼがいずれの微生物由来であるかは、それがＳ，Ｓ−
ＥＤＤＳを生成する能力を有する限り、特に限定されな
い。
【００１０】本発明で使用される微生物としては、例え
ば、バークホルデリア（Burkholderia）属、アシドボラ
ックス（Acidovorax）属、シュードモナス（Pseudomona
s)属、パラコッカス（Paracoccus）属、スフィンゴモナ
ス（Sphingomonas）属、ブレブンジモナス（Brevundimo
nas)属等の細菌を挙げることができる。
ば、バークホルデリア（Burkholderia）属、アシドボラ
ックス（Acidovorax）属、シュードモナス（Pseudomona
s)属、パラコッカス（Paracoccus）属、スフィンゴモナ
ス（Sphingomonas）属、ブレブンジモナス（Brevundimo
nas)属等の細菌を挙げることができる。
【００１１】具体的には、Burkholderia sp.ＫＫ−５株
〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１２〕、同ＫＫ−９株〔ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５４１３〕、Acidovorax sp.ＴＮ−５１株
〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１６〕、Pseudomonas sp. ＴＮ
−１３１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１８〕、Paracoccus
sp.ＫＫ−６株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１５〕、Sphing
omonas sp.ＴＮ−２８株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１９〕
およびBrevundimonas sp. ＴＮ−３株〔ＦＥＲＭ ＢＰ
−５８８６〕を挙げることができる。
〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１２〕、同ＫＫ−９株〔ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５４１３〕、Acidovorax sp.ＴＮ−５１株
〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１６〕、Pseudomonas sp. ＴＮ
−１３１株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１８〕、Paracoccus
sp.ＫＫ−６株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１５〕、Sphing
omonas sp.ＴＮ−２８株〔ＦＥＲＭ ＢＰ−５４１９〕
およびBrevundimonas sp. ＴＮ−３株〔ＦＥＲＭ ＢＰ
−５８８６〕を挙げることができる。
【００１２】これらの細菌は、本発明者らにより自然界
から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託されている。本菌の菌学的
性質は以下に示す通りである。
から新たに分離され、上記番号にて通産省工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託されている。本菌の菌学的
性質は以下に示す通りである。
【００１３】 菌学的性質 ＫＫ−５株 ＫＫ−９株 形態 桿菌 桿菌 グラム染色 − − 胞子 − − 運動性 ＋ ＋ 鞭毛 極多毛 極多毛 酸素に対する態度 好気性 好気性 オキシダーゼ ＋ ＋ カタラーゼ ＋ ＋ ＯＦテスト Ｏ Ｏ キノン系 Ｑ−８ Ｑ−８ プロトカテキン酸の開裂 ｏｒｔｈｏ型 ｏｒｔｈｏ型 蛍光色素の生成 − − 硝酸塩還元 − ＋ インドール生成 − − アルギニンジヒドロラーゼ − − 尿素分解 − − エスクリン分解 − − ゼラチン液化 − − ＰＮＰＧ ＋ − キシロースからの酸生成 ＋ ＋ 資化性 グルコース ＋ ＋ Ｌ−アラビノース ＋ ＋ Ｄ−マンノース ＋ ＋ Ｄ−マンニトール ＋ ＋ マルトース − − グルコン酸カリウム ＋ ＋ ｎ−カプリン酸 ＋ ＋ アジピン酸 − − ｄｌ−リンゴ酸 ＋ ＋ クエン酸 ＋ − 酢酸フェニル ＋ ＋
【００１４】
【００１５】
【００１６】
【００１７】
【００１８】
【００１９】上記菌学的性質を、Bergey's Manual of S
ystematic Bacteriology Vol.1(1984)およびBergey's M
anual of Determinative Bacteriology 9 版(1994)によ
り分類すると、ＫＫ−５株およびＫＫ−９株はバークホ
ルデリア（Burkholderia）属に、ＴＮ−５１株はアシド
ボラックス（Acidovorax）属に、ＴＮ−１３１株はシュ
ードモナス（Pseudomonas)属に、Bergey's Manual of S
ystematic Bacteriology Vol.1(1984)により分類すると
ＫＫ−６株はパラコッカス（Paracoccus）属に、Berge
y's Manual of Determinative Bacteriology 9 版(199
4)およびMicrobiol. Immunol. 34, 99(1990)により分類
するとＴＮ−２８株はスフィンゴモナス（Sphingomona
s）属に、また、Bergey's Manual of Determinative Ba
cteriology9 版(1994)およびInt. J. Syst. Bacteriol.
44, 499(1994) により分類すると、ＴＮ−３株はブレブ
ンジモナス（Brevundimonas)属に属する細菌と同定され
た。
ystematic Bacteriology Vol.1(1984)およびBergey's M
anual of Determinative Bacteriology 9 版(1994)によ
り分類すると、ＫＫ−５株およびＫＫ−９株はバークホ
ルデリア（Burkholderia）属に、ＴＮ−５１株はアシド
ボラックス（Acidovorax）属に、ＴＮ−１３１株はシュ
ードモナス（Pseudomonas)属に、Bergey's Manual of S
ystematic Bacteriology Vol.1(1984)により分類すると
ＫＫ−６株はパラコッカス（Paracoccus）属に、Berge
y's Manual of Determinative Bacteriology 9 版(199
4)およびMicrobiol. Immunol. 34, 99(1990)により分類
するとＴＮ−２８株はスフィンゴモナス（Sphingomona
s）属に、また、Bergey's Manual of Determinative Ba
cteriology9 版(1994)およびInt. J. Syst. Bacteriol.
44, 499(1994) により分類すると、ＴＮ−３株はブレブ
ンジモナス（Brevundimonas)属に属する細菌と同定され
た。
【００２０】生物界に幅広く存在するフマラーゼは、本
反応の基質であるフマル酸をリンゴ酸に水和し、収率を
低下させる要因となるため、使用する菌株のフマラーゼ
活性が弱いか、容易に失活する場合を除いて、除去ある
いは阻害するのが望ましい。例えば、フマラーゼの除
去、阻害方法としては、菌体破砕液からクロマトグラフ
ィー、塩析、電気泳動等の手法で除去する方法、阻害剤
により阻害する方法、菌体のままでフマラーゼを失活さ
せる方法〔I.Umehara et al.,Appl. Microbiol Biotech
nol 20,291(1984)および湯川ら農芸化学59.279(1985)〕
などが知られている。
反応の基質であるフマル酸をリンゴ酸に水和し、収率を
低下させる要因となるため、使用する菌株のフマラーゼ
活性が弱いか、容易に失活する場合を除いて、除去ある
いは阻害するのが望ましい。例えば、フマラーゼの除
去、阻害方法としては、菌体破砕液からクロマトグラフ
ィー、塩析、電気泳動等の手法で除去する方法、阻害剤
により阻害する方法、菌体のままでフマラーゼを失活さ
せる方法〔I.Umehara et al.,Appl. Microbiol Biotech
nol 20,291(1984)および湯川ら農芸化学59.279(1985)〕
などが知られている。
【００２１】本発明で使用される微生物の培養液には何
ら特別の制限がなく、資化しうる炭素源、窒素源、無機
塩、更に微量の有機栄養物などを適当に含有するもので
あれば合成培地、天然培地のいずれでもよい。また、培
養にあたっては培地へのＥＤＤＳ、エチレンジアミン−
Ｎ−モノコハク酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒ
スチジンなどのアミノ酸やフマル酸等の添加は、目的と
する活性の高い菌体が得られることがあり好ましい。培
養条件は菌体や培地により異なるが、培地のｐＨは４〜
１０、好ましくは６〜９の範囲、培養温度は２０〜４５
℃、好ましくは２５〜３５℃の範囲で好気的に行い、活
性が最大となるまで１〜１０日間培養すればよい。
ら特別の制限がなく、資化しうる炭素源、窒素源、無機
塩、更に微量の有機栄養物などを適当に含有するもので
あれば合成培地、天然培地のいずれでもよい。また、培
養にあたっては培地へのＥＤＤＳ、エチレンジアミン−
Ｎ−モノコハク酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒ
スチジンなどのアミノ酸やフマル酸等の添加は、目的と
する活性の高い菌体が得られることがあり好ましい。培
養条件は菌体や培地により異なるが、培地のｐＨは４〜
１０、好ましくは６〜９の範囲、培養温度は２０〜４５
℃、好ましくは２５〜３５℃の範囲で好気的に行い、活
性が最大となるまで１〜１０日間培養すればよい。
【００２２】Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳ生産反応は、フマル酸と
エチレンジアミンを含む水溶液中で、所定の条件下、上
記菌体または該菌体処理物（乾燥菌体、菌体の破砕物、
粗・精製酵素、固定化菌体・酵素など）を接触させるこ
とにより行われるが、菌体培養液に、エチレンジアミン
とフマル酸を直接添加しても行うことができる。
エチレンジアミンを含む水溶液中で、所定の条件下、上
記菌体または該菌体処理物（乾燥菌体、菌体の破砕物、
粗・精製酵素、固定化菌体・酵素など）を接触させるこ
とにより行われるが、菌体培養液に、エチレンジアミン
とフマル酸を直接添加しても行うことができる。
【００２３】基質であるフマル酸およびエチレンジアミ
ンの総仕込み濃度は、それぞれ５００〜２５００ｍＭ、
好ましくは８００〜２０００ｍＭおよび２５０〜１２５
０ｍＭ、好ましくは４００〜１０００ｍＭであり、これ
らは反応開始時に一括添加しても、あるいは反応経過と
共に逐次添加しても構わない。通常、逐次添加が行われ
るが、この場合、反応液中のフマル酸濃度は１０ｍＭ〜
飽和濃度、好ましくは２０〜１３００ｍＭ、およびエチ
レンジアミン濃度は１０〜２０００ｍＭ、好ましくは１
５〜１０００ｍＭの範囲である。また、フマル酸とエチ
レンジアミンの仕込みモル比は、通常２：１である。
ンの総仕込み濃度は、それぞれ５００〜２５００ｍＭ、
好ましくは８００〜２０００ｍＭおよび２５０〜１２５
０ｍＭ、好ましくは４００〜１０００ｍＭであり、これ
らは反応開始時に一括添加しても、あるいは反応経過と
共に逐次添加しても構わない。通常、逐次添加が行われ
るが、この場合、反応液中のフマル酸濃度は１０ｍＭ〜
飽和濃度、好ましくは２０〜１３００ｍＭ、およびエチ
レンジアミン濃度は１０〜２０００ｍＭ、好ましくは１
５〜１０００ｍＭの範囲である。また、フマル酸とエチ
レンジアミンの仕込みモル比は、通常２：１である。
【００２４】微生物等の使用量は基質に対する乾燥菌体
換算で、通常、０．０１〜５重量％である。
換算で、通常、０．０１〜５重量％である。
【００２５】反応液のｐＨ調整は、水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、アンモニア等をフマル酸を含む水溶液
に添加することにより行われるが、これらのアルカリと
フマル酸からなる塩として添加して行うこともできる。
ｐＨは７．５〜９．５、好ましくは８〜９に調整する。
水酸化カリウム、アンモニア等をフマル酸を含む水溶液
に添加することにより行われるが、これらのアルカリと
フマル酸からなる塩として添加して行うこともできる。
ｐＨは７．５〜９．５、好ましくは８〜９に調整する。
【００２６】反応温度は、０〜４５℃の範囲であるが、
反応収率の向上の面からは低温の方がよく０〜３０℃、
好ましくは０〜２０℃である。したがって、反応前期、
例えば、基質の転換率が５０％未満、好ましくは８０％
未満では反応速度の面で有利な高い温度、例えば、３０
〜４５℃で行い、その後は反応温度を０〜３０℃、好ま
しくは０〜２０℃に下げて行うことが、反応速度および
収率の両面で有効である。
反応収率の向上の面からは低温の方がよく０〜３０℃、
好ましくは０〜２０℃である。したがって、反応前期、
例えば、基質の転換率が５０％未満、好ましくは８０％
未満では反応速度の面で有利な高い温度、例えば、３０
〜４５℃で行い、その後は反応温度を０〜３０℃、好ま
しくは０〜２０℃に下げて行うことが、反応速度および
収率の両面で有効である。
【００２７】反応は回分、連続のいずれの方法でも行う
ことができる。また、エチレンジアミン、フマル酸を他
化合物から供給し得る反応系を、本反応系に共存させた
としても、本発明の効果が得られる限り差し支えない。
ことができる。また、エチレンジアミン、フマル酸を他
化合物から供給し得る反応系を、本反応系に共存させた
としても、本発明の効果が得られる限り差し支えない。
【００２８】Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳを塩として反応終了液か
ら回収する場合は、除菌、ｐＨ調整、濃縮などの操作に
より、目的の塩あるいはその水溶液を得ることができ
る。一方、反応終了液からＳ，Ｓ−ＥＤＤＳを遊離のア
ミノ酸として取得するには、除菌後の母液に対し、通
常、鉱酸による晶析を行えばよい。晶析ｐＨは１．５〜
４．５、好ましくは２〜４の範囲である。
ら回収する場合は、除菌、ｐＨ調整、濃縮などの操作に
より、目的の塩あるいはその水溶液を得ることができ
る。一方、反応終了液からＳ，Ｓ−ＥＤＤＳを遊離のア
ミノ酸として取得するには、除菌後の母液に対し、通
常、鉱酸による晶析を行えばよい。晶析ｐＨは１．５〜
４．５、好ましくは２〜４の範囲である。
【００２９】
【実施例】次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。
る。
【００３０】実施例１および比較例１ (1) 培養 Brevundimonas sp. ＴＮ−３株、Sphingomonas sp.ＴＮ
−２８株、Pseudomonas sp. ＴＮ−１３１株を斜面培地
から１白金耳取り、下記の培地に接種し、３０℃、４日
間好気的に振とう培養した。
−２８株、Pseudomonas sp. ＴＮ−１３１株を斜面培地
から１白金耳取り、下記の培地に接種し、３０℃、４日
間好気的に振とう培養した。
【００３１】 培地組成（ｐＨ７．５，１００ｍｌ） エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸 ０．２ｇ グルコース ０．２ｇ 酵母エキス ０．１ｇ ポリペプトン ０．０５ｇ 硫酸マグネシウム・７Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ 硫酸ナトリウム ０．２８ｇ リン酸緩衝液 ２５ｍＭ 金属塩混合物溶液* ０．５ｍｌ ＊金属塩混合物溶液（１００ｍｌ）； 塩化マグネシウム・６Ｈ2 Ｏ ８ｇ， 塩化カルシウム ０．８ｇ，硫酸マンガン・４Ｈ2 Ｏ ０．６ｇ，塩化第二 鉄・６Ｈ2 Ｏ ０．１２ｇ， 硫酸亜鉛 ０．０６ｇ
【００３２】(2) フマラーゼ等を除去した活性画分の取
得 菌体培養液２０ｍｌを遠心管に取り１０，０００ｒｐ
ｍ、５℃、１５分間遠心分離し菌体を集めた後、５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。得られ
た菌体に対し５０Ｗ、５分間の超音波処理を行い、１
０，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により粗酵素液
を得た。さらに、６０％飽和硫安沈殿、透析による脱塩
の後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化さ
れたＤＥＡＥ−セファセル〔ファルマシア〕に吸着さ
せ、同緩衝液から、０．６Ｍ食塩を含む同緩衝液までの
直線勾配法で溶出させた。さらに、必要に応じ、同条件
で、ＤＥＡＥ−セファセルの代わりにＨＰＬＣ〔TSK-ge
l DEAE-5PW（東ソー）〕を用い、フマラーゼ等のフマル
酸減少活性をできるだけ除去した画分を得た。
得 菌体培養液２０ｍｌを遠心管に取り１０，０００ｒｐ
ｍ、５℃、１５分間遠心分離し菌体を集めた後、５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄した。得られ
た菌体に対し５０Ｗ、５分間の超音波処理を行い、１
０，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により粗酵素液
を得た。さらに、６０％飽和硫安沈殿、透析による脱塩
の後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化さ
れたＤＥＡＥ−セファセル〔ファルマシア〕に吸着さ
せ、同緩衝液から、０．６Ｍ食塩を含む同緩衝液までの
直線勾配法で溶出させた。さらに、必要に応じ、同条件
で、ＤＥＡＥ−セファセルの代わりにＨＰＬＣ〔TSK-ge
l DEAE-5PW（東ソー）〕を用い、フマラーゼ等のフマル
酸減少活性をできるだけ除去した画分を得た。
【００３３】(3) 反応 反応液は、表１に記した濃度のフマル酸、エチレンジア
ミン、上記活性画分を含み、６Ｎ水酸化ナトリウムによ
ってｐＨ８．５に調整したものを用い、３０℃、１０〜
３０日間、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生成がほぼ見られなくな
るまで反応させた。また、反応中、１２Ｎ水酸化ナトリ
ウムによりｐＨを８．５に保った。反応終了液中の生成
物であるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの定量は、不溶物を１５，０
００ｒｐｍ、５℃で５分間遠心除去した後、WAKOSIL 5C
8 （和光純薬）〔溶出液；１０ｍＭ 水酸化テトラ−ｎ
−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭ ＣｕＳＯ4 を含む
５０ｍＭリン酸（ｐＨ２）〕およびMCI GEL CRS 10W
（三菱化学）〔溶出液；１０ｍＭ ＣｕＳＯ4 〕による
液体クロマトグラフィーで行った。また、Ｓ，Ｓ−ＥＤ
ＤＳの分離精製は、T, Nishikiori et al., J. Antibio
tics 37, 426 (1984)に記載のイオン交換樹脂を用いる
手法で行い、結晶を取得した後にＮＭＲとマススペクト
ルによる分析で化学構造の確認を行った。結果を表１に
示す。
ミン、上記活性画分を含み、６Ｎ水酸化ナトリウムによ
ってｐＨ８．５に調整したものを用い、３０℃、１０〜
３０日間、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生成がほぼ見られなくな
るまで反応させた。また、反応中、１２Ｎ水酸化ナトリ
ウムによりｐＨを８．５に保った。反応終了液中の生成
物であるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの定量は、不溶物を１５，０
００ｒｐｍ、５℃で５分間遠心除去した後、WAKOSIL 5C
8 （和光純薬）〔溶出液；１０ｍＭ 水酸化テトラ−ｎ
−ブチルアンモニウムと０．４ｍＭ ＣｕＳＯ4 を含む
５０ｍＭリン酸（ｐＨ２）〕およびMCI GEL CRS 10W
（三菱化学）〔溶出液；１０ｍＭ ＣｕＳＯ4 〕による
液体クロマトグラフィーで行った。また、Ｓ，Ｓ−ＥＤ
ＤＳの分離精製は、T, Nishikiori et al., J. Antibio
tics 37, 426 (1984)に記載のイオン交換樹脂を用いる
手法で行い、結晶を取得した後にＮＭＲとマススペクト
ルによる分析で化学構造の確認を行った。結果を表１に
示す。
【００３４】(4) 結果
【００３５】実施例２ (1) 培養 Brevundimonas sp. ＴＮ−３株を実施例１記載と同様の
条件で培養した。
条件で培養した。
【００３６】(2) フマラーゼ等を除去した活性画分の取
得 実施例１と同様。
得 実施例１と同様。
【００３７】(3) 反応 反応液は、１２３２ｍＭフマル酸、６１６ｍＭエチレン
ジアミン、上記活性画分を含み、表２に記したアルカリ
（６Ｎ）によってｐＨ８．５に調整したものを用い、３
０℃、１０〜３０日間、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生成がほぼ
見られなくなるまで反応させた。また、反応中、表２に
記したアルカリ（１２Ｎ）によりｐＨを８．５に保っ
た。反応終了液中の生成物であるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの定
量は、実施例１と同様に行った。結果を表２に示す。
ジアミン、上記活性画分を含み、表２に記したアルカリ
（６Ｎ）によってｐＨ８．５に調整したものを用い、３
０℃、１０〜３０日間、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生成がほぼ
見られなくなるまで反応させた。また、反応中、表２に
記したアルカリ（１２Ｎ）によりｐＨを８．５に保っ
た。反応終了液中の生成物であるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの定
量は、実施例１と同様に行った。結果を表２に示す。
【００３８】(4) 結果
【００３９】実施例３および比較例２ (1) 培養 実施例２と同様。
【００４０】(2) フマラーゼ等を除去した活性画分の取
得 実施例１と同様。
得 実施例１と同様。
【００４１】(3) 反応 反応液は、１２３２ｍＭフマル酸、６１６ｍＭエチレン
ジアミン、上記活性画分を含み、６Ｎ水酸化ナトリウム
によってｐＨ８．５に調整したものを用い、表３に記し
た温度で、１０〜３０日間、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生成が
ほぼ見られなくなるまで反応させた。また、反応中１２
Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．５に保った。反応
終了液中の生成物であるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの定量は、実
施例１と同様に行った。結果を表３に示す。
ジアミン、上記活性画分を含み、６Ｎ水酸化ナトリウム
によってｐＨ８．５に調整したものを用い、表３に記し
た温度で、１０〜３０日間、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生成が
ほぼ見られなくなるまで反応させた。また、反応中１２
Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．５に保った。反応
終了液中の生成物であるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの定量は、実
施例１と同様に行った。結果を表３に示す。
【００４２】(4) 結果
【００４３】実施例４および比較例３ (1) 培養 実施例２と同様。
【００４４】(2) フマラーゼ等を除去した活性画分の取
得 実施例１と同様。
得 実施例１と同様。
【００４５】(3) 反応 反応液は、６８４ｍＭフマル酸、３４２ｍＭエチレンジ
アミン、上記活性画分を含み、６Ｎ水酸化ナトリウムに
よってｐＨ６または８．５に調整したものを用い、３０
℃、１０〜３０日間、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生成がほぼ見
られなくなるまで反応させ比較した。また、反応中、１
２Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．５に保った。反
応終了液中の生成物であるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの定量は、
実施例１と同様に行った。結果を表４に示す。
アミン、上記活性画分を含み、６Ｎ水酸化ナトリウムに
よってｐＨ６または８．５に調整したものを用い、３０
℃、１０〜３０日間、Ｓ，Ｓ−ＥＤＤＳの生成がほぼ見
られなくなるまで反応させ比較した。また、反応中、１
２Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを８．５に保った。反
応終了液中の生成物であるＳ，Ｓ−ＥＤＤＳの定量は、
実施例１と同様に行った。結果を表４に示す。
【００４６】(4) 結果
【００４７】
【発明の効果】反応系の基質を高濃度に仕込み、さらに
諸条件を最適化することにより、フマル酸とエチレンジ
アミンからのＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ製造における酵素反応収
率を飛躍的に改善し、効率的にＳ，Ｓ−ＥＤＤＳならび
にそのナトリウム塩等を製造できる。
諸条件を最適化することにより、フマル酸とエチレンジ
アミンからのＳ，Ｓ−ＥＤＤＳ製造における酵素反応収
率を飛躍的に改善し、効率的にＳ，Ｓ−ＥＤＤＳならび
にそのナトリウム塩等を製造できる。
Claims (4)
- 【請求項１】 リアーゼ活性を有する微生物または該処
理物の存在下、フマル酸とエチレンジアミンの混合物か
らＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸を
酵素反応により製造する方法において、フマル酸および
エチレンジアミンの総仕込み濃度をそれぞれ５００〜２
５００ｍＭおよび２５０〜１２５０ｍＭとすること、水
酸化アルカリまたはアンモニアにより反応液のｐＨを
７．５〜９．５の範囲に調整すること、および反応温度
を０〜４５℃の範囲とすることを特徴とするＳ，Ｓ−エ
チレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。 - 【請求項２】 フマル酸およびエチレンジアミンの総仕
込み濃度が、それぞれ８００〜２０００ｍＭおよび４０
０〜１０００ｍＭである請求項１記載のＳ，Ｓ−エチレ
ンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製造法。 - 【請求項３】 反応液のｐＨが８〜９の範囲である請求
項１記載のＳ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコ
ハク酸の製造法。 - 【請求項４】 反応後期における反応温度を０〜３０
℃、好ましくは０〜２０℃の範囲とする請求項１記載の
Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−ジコハク酸の製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18596297A JP3836952B2 (ja) | 1997-06-27 | 1997-06-27 | Ｓ，ｓ−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18596297A JP3836952B2 (ja) | 1997-06-27 | 1997-06-27 | Ｓ，ｓ−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH119294A true JPH119294A (ja) | 1999-01-19 |
| JP3836952B2 JP3836952B2 (ja) | 2006-10-25 |
Family
ID=16179930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18596297A Expired - Lifetime JP3836952B2 (ja) | 1997-06-27 | 1997-06-27 | Ｓ，ｓ−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3836952B2 (ja) |
-
1997
- 1997-06-27 JP JP18596297A patent/JP3836952B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3836952B2 (ja) | 2006-10-25 |
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