具体实施方式
试验实例
表1(下文“%”是指“重量/体积%”,除另有说明外)所示的组合物培养液在121℃进行10分钟的热消毒之后,加入预先消毒过滤的水杨酸、α-酮异戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羟基天冬氨酸或O-甲基苏氨酸以达到表2所示浓度。然后将该培养液分配到9厘米直径的陪替氏培养皿。在每一个该琼脂培养液中加入0.1毫升的菌株培养肉汤,该菌株选自大肠杆菌IFO3547、FV5714、FV525、FV814、FV521、FV221、FV6051和FV5069(如表2示),在最少量培养液中培养24小时,接着再培养30小时。生长程度列于表2。
表1
琼脂组合物培养液(pH7.0)
成分 浓度
Na2HPO4 0.6%
KH2PO4 0.3%
NaCl 0.05%
NH4Cl 0.1%
葡萄糖 0.5%
MgSO4 1mM
CaCl2 0.1mM
维生素B1 5μg/ml
琼脂 1.5%
表2
①在水杨酸板上生长程度相似浓度 菌株名称(mg/ml) IFO3547 FV5714 FV525 FV8140.125 - ++ ++ ++0.25 - ± + +0.5 - - ± ±1 - - - -2 - - - -
②在α-酮异戊酸板上生长程度
IFO3547 FV5714 FV525 FV8140.625 ++ ++ ++ ++1.25 + ++ ++ ++2.5 ± + + +5 - ± + +10 - - - -
③在α-氧代丁酸板上生长程度
IFO3547 FV5714 FV525 FV814 FV221 FV6051 FV50690.125 ++ ++ ++ ++ + + ++0.25 ++ ++ ++ ++ + + +0.5 ± + + ++ ± ± +1 - ± ± + ± ± ±2 - - - ± - - ±
④在α-氨基丁酸板上生长程度
IFO3547 FV571 FV525 FV814 FV5210.125 ++ ++ ++ ++ ++0.25 + + ++ ++ ++0.5 - + + + +1 - - ± + +2 - - - - +
⑤在β-羟基天冬氨酸板上生长程度
IFO3547 FV814 FV221 FV6051 FV50690.125 + + ++ ++ ++0.25 + + ++ ++ ++0.5 - - + ± +1 - - ± ± ±2 - - - - -
⑥在O-甲基苏氨酸板上生长程度
IFO3547 FV814 FV221 FV6051 FV50690.0125 ++ ++ ++ ++ ++0.025 ++ ++ ++ ++ ++0.05 + + + ++ ++0.1 ± ± - ++ ++0.2 - - - ++ ++
在表2中符号具有如下含义:
++:生长很好 +:生长良好 ±:生长较差 -:不生长
同时,基于上述D-泛酸的生产方法,本发明人发现,含有包括泛酸或其盐或其部分生物合成的基因区运载的载体科微生物(由特定科微生物的染色体衍生)可高浓度积累D-泛酸和/或D-泛解酸。
本文所涉及的泛酸生物合成中所包括的基因是panB、panC或panD基因,它们分别与酶酮泛酸羟基甲基转移酶、泛酸合成酶和天冬氨酸-α-脱羧酶相对应。
这样的DNA供体微生物包括上述的微生物,优选能生产泛酸的埃希杆菌属微生物。确切地说,如List of Cultures,第8版,1988中,由Institute for Fermentation,Osaks出版中所列的已知菌株,例如大肠杆菌K-12(IFO3301)和大肠杆菌IFO3547。更有效的是使用上述突变体如大肠杆菌FV5714、FV525、FV814、FV521、FV221、FV6051和FV5069。
含有包括泛酸或其盐生物合成基因的DNA片断的制备方法包括用已知方法从一种供体微生物中先萃取染色体DNA的方法(如H.Saito和K.Miura在Biochim.Biophys.Acta,72,619(1963)中所述),或用抑制酶EcoRI分裂后的其类似方法。然后,将上述获得的含有包括泛酸或其盐的生物合成的基因的染色体DNA片断插入载体DNA。
用于本发明的载体DNA可适当选自能在受体微生物中增殖的那些。能在受体微生物中增殖的质粒包括(但不限于)pSC101[Proceedings of the National Academy ofSciences of the USA,70,3240(1973)]和pBR322[Gene,4,121(1978)];甚至能用最新分离或合成的载体DNA,只要能实现本发明的目的。
将含有包括泛酸或其盐的生物合成的基因的DNA片断插入这些质粒中能用公知方法或基于此的一种方法来实现,该公知方法如T.Maniatis等人在Molecular Cloning,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,University ofTokyo Press,1982中所述。
能用一种已知的转化方法或基于此的一种方法将载有包括泛酸或其盐生物合成基因的质粒载体引入受体微生物中,该已知方法如Journal of Molecular Biology,53,159(1979)中所述。受体杆菌的实例包括已知的菌株例如大肠杆菌C600菌株[Bacteriology Review,36,525(1972)]。
含有包括泛酸或其盐生物合成基因运载质粒的转化体可选自通过转化泛酸营养缺陷体作DNA受体和选择一种菌株,转化结果使其变成能在泛酸游离培养液中生长的转化体。当所用培养液使选择的菌株作为质粒DNA标记时这种选择是容易的。如此获得的含有包括泛酸或其盐生物合成基因运载的载体DNA能用于从含有它的菌株中提取重组DNA,并且将它引入另一个受体微生物,或从提取的重组DNA中制备含有包括泛酸或其盐生物合成基因的DNA片断,并将它接到另一个载体质粒上。如此获得的转化体的实例包括如下:
大肠杆菌3547/pFV31菌株(IFO15371)
大肠杆菌5714/pFV31菌株(IFO15372)
大肠杆菌525/pFV31菌株(IFO15373)
大肠杆菌814/pFV31菌株(IFO15374)(FERMBP4401)
大肠杆菌521/pFV31菌株,
大肠杆菌221/pFV31菌株(IFO15524),
大肠杆菌6051/pFV31菌株(IFO15525),和
大肠杆菌5069/pFV31菌株(IFO15526)(FERM BP 4395)
上述大肠杆菌3547/pFV31菌株是通过将从大肠杆菌FV525衍生出的含有包括泛酸或其盐的生物合成运载基因质粒pFV31引入IFO3547而获得的,大肠杆菌5714/pFV31是将pFV31引入FV5714菌株而得到的,大肠杆菌525/pFV31是将pFV31引入FV525菌株而得到的,大肠杆菌814/pFV31是将pFV31引入FV814菌株而得到的,大肠杆菌521/pFV31是将pFV31引入FV521菌株而得到的,大肠杆菌221/pFV31是将pFV31引入FV221菌株而得到的,大肠杆菌6051/pFV31是将pFV31引入FV6051菌株而得到的,和大肠杆菌5069/pFV31是将pFV31引入FV5069菌株而得到的。
在本说明书中,IFO的数值表示在Institute forFermintation,Osaka(2-17-85,Jyuso Honmachi,Yodogawa-ku,Osaka_shi)处的登记号,FERM BP的数值表示在Budapest Treaty Fermentation Research Institute,Agency of Industrial Science and Technology(1-1-3,Higashi,Tsukuba-shi,Ibaraki)处的登记号。
如此获得的菌株能用普通培养方法〖如静置培养、振动培养(旋转振动培养等)和通气旋转器培养〗进行连续或间断的培养。所用培养液为可使所用微生物生长的普通组合物。该微生物能消化的碳源可适当选自单一使用或在组合物中的烃、油和脂肪、脂肪酸、有机酸、和醇。氮源的实例包括有机氮源如胨、大豆粉、棉籽粉、玉米浆、酵母抽提物、肉羹、麦精和尿素,以及无机氮源如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、和磷酸铵按需要单独或混合使用。用磷酸二氢钾或磷酸二钾作磷源也是有利的。该培养液通常可添加生长所需的金属盐(例如硫酸镁)、基本生长因子如氨基酸和维生素、生长促进因子、以及碳源、氮源、和磷源。为控制培养液pH值和泡沫,可适当加入碱性物质如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸铵和碳酸钙,加入消泡剂是有效的。这些物质可以在培养过程中适当地加入。喷入氧气对保持需氧条件的环境也是有效的。通常将培养温度保持在15至45℃、优选25至40℃范围内是有利的。培养连续进行直到泛酸和/或泛解酸的含量已基本达到最高值;一般能在6至120小时内实现本发明的目的。
在D-泛酸的生产中,能通过在菌株开始培养之前、或菌株培养过程中的适当时间加入原料,或通过在适当时间将原料加到加工过的细胞中以使原料β-丙氨酸与细胞相接触。本文所述的已加工过的细胞包括洗涤过的细胞培养液、及包含和固定在丙酮粉、聚丙烯酰胺凝胶或K-角叉菜胶中的细胞。将该原料以溶液形式、或在合适溶剂中(如水)的悬浮液、或以粉末形式,在一定时间或连续地、或在给定时间内间断地加入。
加入的β-丙氨酸浓度最好与加到培养液中该微生物的产率相适应、以经济为原则,所加β-丙氨酸的优选浓度为0.1至5%(重量/体积比),最好是0.5至3%(重量/体积比)。
当从上述培养液或反应产物中分离D-泛酸或其盐时,它能以常规的方法进行收获。例如,D-泛酸或其盐可通过从培养肉汤中去除细胞,随后进行一个或多个公知工序如离子交换树脂处理、用活性碳吸收处理等、结晶、去盐、以及电透析以来进行分离。
通过上述反应获得的游离形式D-泛酸能用普通方法转化成盐;通过该反应获得的D-泛酸盐能用普通方法转化成游离形式。
例如,泛酸钙的分离方法如下:
从含有泛酸或其盐的培养肉汤中去除细胞。使该液体流经阳离子交换树脂柱(例如,DIAION PK-216(H型)或pk-228(H型),二者均由Mitsubishi Chemical Industries生产)以去除阳离子,然后经过阴离子交换树脂柱(例如,DIAION PA-412(OH型)或WA-30(OH型),二者均由Mitsubishi Chemical Industries生产)以去除比无机阴离子和泛酸酸性更大的有机酸。在加入活性碳(如,Shirasagi A,由Takeda Chemical Industries生产),随之进行过滤之后,通过加入氢氧化钙将流出物(pH3±1)调节到近于中性pH值(pH7±2)。浓缩所得滤液,且加入适量低级醇(如,甲醇、乙醇、异丙醇),加入晶种以使D-泛酸钙结晶,然后将所得D-泛酸钙晶体分离并干燥。若这种D-泛酸钙结晶产率不够的话,可在结晶前适当加入氯化钙以得到高产率和高纯度结晶D-泛酸钙和氯化钙的络合盐,按US2957025(由Jonathan O.Brooks,于1960年10月18日申请)和审定公开的日本专利No.49571/1972所述方法进行。虽然为此目的加入的氯化钙可以是无水、二水、六水盐结晶,但最好是无水或二水盐。氯化钙的加入量一般是泛酸钙摩尔比的0.5至5倍,优选为1至3倍。US2957025(由Jonathan O.Brooks,于1960年10月18日提出申请)指出,该泛酸钙和氯化钙的络合盐是不吸湿的,且是有效的动物饲料添加物;英国专利No.933669指出它在片剂中比泛酸钙更稳定。
有关从这样获得的D-泛酸钙和氯化钙络合盐中去除氯化钙以高产率获得D-泛酸钙的方法尚未见报道。本发明人为实现本发明目的进行各种方法的广泛研究之后,设计出了一种非常有效的电渗析方法。确切地说,本发明人发现用一种阴离子可渗透膜〖该膜可使氯离子通过但泛酸不行(例如,一价离子可选择性渗透的膜Neocepter ACS,由Tokuyama soda生产)〗并用硝酸钙水溶液作电极液进行电渗析,可有效地从D-泛酸钙和氯化钙络合盐的水溶液中去除氧化钙。虽然,在水溶液中该络合盐的浓度是可选择的,但通常在1至60%(重量/体积比),优选4至40%(重量/体积比)的正常浓度范围内是可溶的。通过这种电渗析处理所获得的D-泛酸钙水溶液可用普通方法如喷雾干燥得到D-泛酸钙粉末。
因此,D-泛酸钙能有效地从培养肉汤中分离。
D-泛解酸能通过从培养肉汤中去除细胞、用硫酸或盐酸调节该液体的pH为1-2、衍生出泛酸内酯(泛解酸的环化衍生物)、用溶剂(例如,异丙酸乙酯、乙酸乙酯)进行萃取、然后进行浓缩和结晶,以进行分离,从而得到晶体。通过加入氢氧化钠等很容易使这样获得的泛酸内酯还原成泛解酸。
实例
在下文中通过以下实例对本发明进行更详细地描述,这些实例仅是本发明的实施方案,它们不能以任何方式限制本发明范围。
D-泛酸可用高性能液体色谱法进行定量(柱:ShimadzuSCR101H(7.9mm直径×30cm);微生物相:0.008N硫酸;流量:0.8毫升/分钟;检测器:差动式折射计)和/或微生物的生物试验(指示菌株:植物乳杆菌IFO3070;培养液:市售可得的泛酸试验培养液(由DIFCO生产))。泛解酸的定量测定和光学纯度测定是通过离心从培养肉汤中去除细胞后用高性能乙酸乙酯抽提物的液体色谱法进行的(柱:SUMICHIRAL OA-1200;微生物相:n-己烷/1,2-二氯代乙烷/乙醇=90/8/2;流量:1.0毫升/分钟;检测器:UV),将6N盐酸加到该上清液中,接着在水浴中在80℃加热15分钟(该操作使平衡的泛解酸转化成泛酸内酯)。
实例1
在含20ml如表3所示组合物的第一消毒种培养液的200ml锥形瓶中接种得自斜面培养液的白金圈大肠杆菌IFO3547菌株、FV5714(IFO15368)菌株、FV525(IFO15369)菌株、FV814(IFO15370)菌株、或FV521菌株,随后以220rpm的转速在30℃进行20小时的旋转振动培养。将该第一种培养液1ml部分移至含有20ml表4所示组合物消毒培养液的200ml肋状锥形瓶中,然后在38℃下培养20小时,在每个瓶中加入2.5ml、54%含水葡萄糖溶液之后,再培养24小时。在培养完成后所产生的泛解酸量和光学纯度以及积累的泛酸的量在表5中给出。
表3
组合物培养液(pH7.0)
成分 浓度
玉米浸液 0.5%
(NH4)2SO4 0.5%
MgSO4·7H2O 0.01%
KH2PO4 0.01%
K2HPO4 0.03%
CaCO3 1.0%
葡萄糖 5.0%
表4培养液①(pH7.0) 培养液②(pH7.0)成分 浓度 成分 浓度玉米浸液 0.2% 玉米浸液 0.2%(NH4)2SO4 1.5% (NH4)2SO4 1.5%MgSO4·7H2O 0.02% MgSO4·7H2O 0.02%KH2PO4 0.05% KH2PO4 0.05%K2HPO4 0.1% K2HPO4 0.1%CaCO3 2.0% CaCO3 2.0%葡萄糖 9.0% 葡萄糖 9.0%
β-丙氨酸 2.0%
表5
培养液① 培养液②菌株 生成的泛解酸量 光学纯度 生成的泛解酸量
(mg/ml) (%ee) (mg/ml)大肠杆菌IFO3547 未测出 - 0.1FV5714 1.5 100 7.0FV525 2.8 100 11.0FV814 3.0 100 13.0FV521 2.5 100 13.9
实例2
在含有20ml如表3所示组合物的第一消毒种培养液的200ml锥形瓶中接种得自斜面培养液的白金圈大肠杆菌FV221菌株、FV6051菌株,随后以220rpm的转速在30℃进行20小时的旋转振动培养。将该第一种培养液1ml部分移至含有40ml如表6所示组合物的消毒培养液的200ml肋状锥形瓶中,然后在38℃下培养20小时,在每个瓶中加入5ml、54%含水葡萄糖溶液之后,立刻再培养24小时。培养完成后所产生的泛解酸量和光学纯度以及积累的泛酸量,在表5中给出。
表6培养液①(pH7.0) 培养液②(pH7.0)成分 浓度 成分 浓度玉米浸液 2.0% 玉米浸液 2.0%(NH4)2SO4 1.5% (NH4)2SO4 1.5%MgSO4·7H2O 0.02% MgSO4·7H2O 0.02%KH2PO4 0.05% KH2PO4 0.05%K2HPO4 0.1% K2HPO4 0.1%CaCO3 3.0% CaCO3 3.0%葡萄糖 9.0% 葡萄糖 9.0%
β-丙氨酸 2.0%
表7
培养液① 培养液②菌株 生成的泛解酸量 光学纯度 生成的泛解酸量
(mg/ml) (%ee) (mg/ml)大肠杆菌FV221 3.2 100 15.8FV6051 3.9 100 16.3FV5069 4.5 100 17.9
实例3i)DNA染色体的制备将能产生D-泛酸的大肠杆菌FV525菌株接种到1升的L培养液中(1.0%Bactotrypton、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠),随后在37℃下过夜培养。最后,用Saito等人的方法用苯酚[Biochim.Biophys.Acta,72,619(1963)]从该细胞中获得DNA染色体3.3mg。ii)将DNA染色体插入载体质粒pMW118除非另外说明以下实验均按T.Maniatis等人在MolecularCloning中(由University of Tokyo Press,1982出版)所述方法进行操作。
用限制性酶EcoRI(由Nippon Gene生产)分别使在上述第i)项中获得的DNA染色体10μg和pMW118(由Nippon Gene生产)分裂,随后在存在T4噬菌体-衍生的DNA连接酶(由Nippon Gene生产)的条件下进行混合和连接。iii)泛酸生物合成系统基因的克隆
用合适的细胞方法进行转化。确切地说,合适的细胞是用得自大肠杆菌C600菌株的亚硝基胍诱变衍生的D-泛酸营养缺陷体A4C菌株(IFO15251,FERM BP-3677)制备的。在该上清液中加入在上述第ii)项中制备的质粒DNA,从而使它用于转化。然后将含该转化体的悬浮液涂于含M-9琼脂培养液(0.6%磷酸氢二钠、0.3%磷酸二氢钾、0.1%氯化铵、0.05%氯化钠、1mM硫酸镁、0.1mM氯化钙、0.5%葡萄糖、10μg/ml维生素B1、50μg/ml苏氨酸、50μg/ml亮氨酸、1.5%琼脂、pH7.2)的培养板上,添加50μg/ml氨苄青霉素的钠盐,随后在37℃下培养2天。从该板培养液中的克隆生长物中获得耐氨苄青霉素和能生产D-泛酸的转化体。将用从大肠杆菌FV525菌株的DNA染色体插入衍生出的运载质粒转化的A4C菌株命名为A4C/pFV31菌株(IFO15367)。iv)从转化体中提取质粒最后,从1升的该转化体大肠杆菌A4C/pFV31菌株的培养肉汤中获得600μg的质粒,且命名为pFV31。v)质粒pFV31的分析用各种抑制性酶使pFV31分裂,并进行琼脂糖凝胶电泳。从该电泳图中,以λ形噬菌体DNA(由Nippon Gene生产)Hind III消化产物的分子量为基础制备图1所示的限制性酶分裂图。发现pFV31是在pMW118的EcoRI位点载带约2.5kb的DNA片断的重组质粒。vi)重新转化为了证实在pFV31中存在包括泛酸或其盐的生物合成的基因,用上述质粒DNA使α-酮泛解酸营养缺陷体A1B菌株、β-丙氨酸营养缺陷体A17C菌株和泛酸营养缺陷体A4C菌株,(均通过大肠杆菌C600菌株的亚硝基胍诱变衍生的)重新转化。所得到的转化体能在上述M-9琼脂培养液中生长,从而证实在pFV31中存在酮泛酸羟基甲基转化酶、天冬氨酸-α-脱羧酸以及泛酸合成酶基因。
此外,为证实该转化体能生产泛酸,用pFV31使大肠杆菌IFO3547菌株、FV5714、FV525、FV814、FV521、FV221、FV6051和FV5069进行转化。如此获得的转化体分别命名为大肠杆菌3547/pFV31菌株、5714/pFV31菌株、525/pFV31菌株、814/pFV31菌株、521/pFV31菌株、221/pFV31菌株、6051/pFV31菌株和5069/pFV31菌株。
实例4
使如表3所示组合物液体培养液在高压灭菌器中在121℃加热消毒15分钟,并且以每瓶20ml分配到200ml的锥形瓶中。每瓶中接种实例3第iv)项中得自斜面培养液的大肠杆菌3547/pFV31菌株、5714/pFV31菌株、525/pFV31菌株、814/pFV31菌株、或521/pFV31菌株的白金圈,然后以220rpm转速,在30℃进行旋转振动培养20小时。将该种培养液(1ml部分)移至20ml如表4所示的组合物培养液中,随后,在38℃在200ml肋状锥形瓶中培养20小时,每瓶中加入2.5ml、54%葡萄糖含水溶液,立刻再培养24小时以上。在培养完成之后所产生的泛解酸量和光学纯度以及积累的泛酸量,在表8中给出。
表8
培养液① 培养液②菌株 生成的泛解酸量 光学纯度 生成的泛解酸量
(mg/ml) (%ee) (mg/ml)大肠杆菌3547/pFV31 2.2 100 13.05714/pFV31 3.4 100 14.4525/pFV31 7.4 100 25.0814/pFV31 8.5 100 31.5521/pFV31 9.6 100 34.9
实例5
将表3所示组合物的一种液体培养液在高压灭菌器中在121℃加热消毒15分钟,并且以每瓶20ml分配到200ml的锥形瓶中。每瓶中接种实例3第vi)项中得自斜面培养液的大肠杆菌221/pFV31菌株、6051/pFV31菌株、或5069/pFV31菌株的白金圈,然后以220rpm转速,在30℃进行旋转振动培养20小时。将该种培养液(2ml部分)移至40ml如表6所示的组合物培养液中,随后,在38℃在200ml肋状锥形瓶中培养24小时,每瓶中加入5ml、54%葡萄糖含水溶液后,立刻再培养24小时。在培养完成之后所产生的泛解酸量和光学纯度以及积累的泛酸量,在表9中给出。
表9
培养液① 培养液②菌株 生成的泛解酸量 光学纯度 生成的泛解酸量
(mg/ml) (%ee) (mg/ml)大肠杆菌FV221/pFV31 9.8 100 32.6FV6051/pFV31 10.5 100 41.3FV5069/pFV31 11.2 100 45.4
实例6
在含20ml表3所示组合物的第一消毒种培养液的200ml锥形瓶中加入得自斜面培养液的白金圈大肠杆菌814/pFV31菌株,随后以220rpm的转速,在30℃进行24小时的旋转振动培养。将该第一种培养液(20ml部分)移至含有200ml相同组合物的第二消毒种培养液的1000ml锥形瓶中,随后以220rpm的转速,在30℃进行24小时的旋转振动培养。将该第二种培养液(125ml部分)移至5升发酵罐中,其中含有2.3升消毒培养液,该培养液含有250g葡萄糖、12.5g玉米浆、37.5g硫酸铵、1.25g磷酸二氢钾、2.5g磷酸二钾、0.5g硫酸镁、75g碳酸钙、和33gβ-丙氨酸(pH7.0),然后在38℃下培养,同时通气(0.8体积/体积/分钟)并搅拌(800rpm)。16至62小时后开始,连续加入葡萄糖,以保持其浓度在2%至3%之间。培养68小时后,最终液体体积是2.5升,D-泛酸生成量是38.5g/l。
实例7
将2.0升实例6中获得的发酵肉汤(含有77.0gD-泛酸)在80℃加热10分钟,然后过滤以去除细胞和不溶物质。该滤液与洗涤液合并,得到2.4升液体,使其通过填充600ml DIAION PK-216(H型)的柱,然后通过填充340ml DIAION PA-412(OH型)的柱,与水洗脱液相合并得到总共4.1升处理过的液体(pH3.2),加入氢氧化钙将该处理过的液体pH调节到6.8再加入5克活性碳,然后进行过滤。将滤液和洗涤液合并,得到4.2升含有75.1克D-泛酸的液体,从该数值计算得到D-泛酸钙的含量为82.0克。该液体可用作结晶的起始液。
使2.1升如此获得的4.2升起始材料结晶液体(含有41.0克D-泛酸钙)在减压条件下浓缩,从而得到约43%(重量/重量)浓度的最终D-泛酸钙。在该浓缩液中加入410ml甲醇并加入0.5克晶种,随后在30℃缓慢搅拌5小时。然后,使该液体在5℃下静置14小时接着通过过滤分离晶体并干燥,所得晶体重6.3克,纯度为98.5%。
实例8
使2.1升实例7中所得的4.2升起始材料结晶液体(含有41.0克D-泛酸钙)在减压条件下浓缩,从而得到约43%(重量/重量)浓度的最终D-泛酸钙。在该浓缩液中加入100ml甲醇。混合后,加入310ml含有37.94克氯化钙二水合物的甲醇溶液,并加入0.5克晶种,随后在50℃下缓慢搅拌5小时。通过过滤收集晶体并干燥。所得晶体重41.95克,且含有74.3%(重量/重量)D-泛酸、13.6%(重量/重量)Ca和12.1%(重量/重量)C1的组合物。这一发现证明这种晶体是1∶1摩尔比的一种D-泛酸和氯化钙的络合盐。
将40克这样的络合盐溶于约2升的水中,并用电渗析器进行电泳〖TS-2-10型(Tokuyama Soda);阳离子可渗透膜:Neocepter CM-1;阴离子可渗透膜:Neocepter ACS;电极液:0.2N硝酸钙水溶液;流量:0.3升/分钟;电压:10V)。结果,该氯化钙去除出系统外面,且获得含D-泛酸和钙摩尔比为2∶1的D-泛酸钙水溶液(pH7.0)。将该D-泛酸钙水溶液在减压下浓缩,使其浓度约为50%(重量/重量),然后使用喷射干燥器进行喷射干燥,从而得到34.0克D-泛酸钙粉末。该粉末的D-泛酸钙纯度为99.8%(重量/重量)([α]D=+28.1(c=5,H2O)〗。
实例9
在含有20ml如表3所示组合物的第一消毒种培养液的200ml锥形瓶中加入得自斜面培养液的白金圈大肠杆菌5069/pFV31菌株,随后以220rpm的转速,在30℃进行24小时的旋转振动培养。将该第一种培养液20ml移至含有200ml相同组合物的第二消毒种培养液的1000ml锥形瓶中,随后在30℃下进行24小时的旋转振动培养。将该第二种培养液75ml移至3升的发酵罐中,其中含有1.35升一消毒培养液,该培养液含有75g葡萄糖、30g玉米浆、22.5g硫酸铵、0.75g磷酸二氢钾、1.5g磷酸二钾、0.3g硫酸镁、45g碳酸钙、0.75mg维生素B1和15gβ-丙氨酸(pH7.0),然后在38℃下培养,同时通气(0.8体积/体积/分钟)并搅拌(700rpm)。在培养开始之后15、27、和38.5小时间歇加入葡萄糖,以保持5%浓度。在培养开始之后27和46.5小时还加β-丙氨酸以保持1%浓度,和在培养开始之后30和50小时0.75mg维生素B1。在培养72小时后,该最终液体体积是1.58升,D-泛酸量是65.4g/l。