CN1276981A - 含有d－泛酸和/或其盐的饲料添加剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了基于一种发酵液的饲料添加剂,所述发酵液通过发酵产D－泛酸的微生物获得并含有选自钠盐、钾盐、铵盐、镁盐或钙盐的一或多种D－泛酸的盐,任选地添加一或多种这些化合物。

Description

含有D-泛酸和/或其盐的饲料添加剂及其制备方法
本发明涉及基于含有D-泛酸和/或其盐的发酵液的动物饲料添加剂，及制备这种添加剂的方法。
泛酸在全世界以每年几千吨的规模生产，所产生的泛酸的大部分是用于饲养经济实用动物如禽类和猪。对泛酸的需求持续增加。
泛酸可通过化学合成制备或经在合适的营养溶液中发酵合适的微生物而经生物工程制备。在化学合成情况下，DL-泛酸内酯(DL-pantolactone)是重要的前体，其从甲醛、异丁醛和氰化物经多步骤方法制备。在进一步的步骤中，外消旋混合物被分离，并且D-泛酸内酯与β-丙氨酸缩合，由此产生D-泛酸。
典型的市售形式是D-泛酸的钙盐，D，L-泛酸的外消旋混合物的钙盐也可以使用。
使用微生物的发酵制备方法的优势是直接形成所需的立体异构形式，即D-型，其不含L-泛酸。
如EP-A-0493060，EP-A-0590857和WO97/10340所示，各种类型的细菌如埃希氏大肠杆菌、Arthrobacter ureafaciens，Corynebacterium erythrogenes，产氨短杆菌以及酵母如Debaromycescastellii在合适的发酵条件下可产生D-泛酸。特别合适的微生物是上述文献中所述的大肠杆菌IFO3547的衍生物，如菌株FV5069/pFV31和FV5069/pFV202。
如EP-A-0493060，EP-A-0590857和WO97/10340所述，在发酵制备D-泛酸过程中，在合适的营养素中培养能产生D-泛酸的微生物，然后以高成本的方式分离D-泛酸，纯化并制备成钙盐。
合适的营养培养基含有碳源如葡萄糖或淀粉水解物或者蔗糖或糖蜜，前体如β-丙氨酸、D，L-泛解酸或D，L-泛酸内酯，氮源如硫酸铵，磷源如磷酸钾或其它盐，微量元素以及维生素，以及任选的复合培养基添加剂如酵母提取物。然后将微生物在pH合适的此培养基中保温，适当曝气和搅拌，这些微生物随即分泌D-泛酸。
根据由WO96/33283和EP-A-0590857代表的现有技术，以昂贵的分离和纯化方式从含泛酸的发酵液中获得D-泛酸的钙盐。经过滤或离心最初分离生物量后，用活性炭或柱层析纯化进行滤液的进一步加工。将以这种方式获得的溶液与氢氧化钙反应后，所需的钙盐结晶出来。
根据WO96/33283，在第一个柱中经活性炭将滤液脱色。用浓盐酸将pH调至3.0，然后用填充有活性炭的另外两个柱连续纯化液体。用甲醇洗脱D-泛酸。在用氢氧化钙粉末中和步骤后，获得一种溶液，从中经在5℃结晶回收D-泛酸钙。
在EP-A-0590857所述的方法中，滤液首先用阳离子和阴离子交换柱纯化。用盐酸洗脱。然后用氢氧化钙中和洗脱的组分，向其中加入活性炭，并过滤混合物。获得的滤液然后抽提进低分子量醇(甲醇、乙醇、异丙醇)中，经结晶获得D-泛酸钙。
以上述方式制备的D-泛酸钙可用作饲料添加剂用于动物营养。
根据现有技术，D-泛酸和D，L-泛酸的盐类通过将经化学合成或发酵制备的酸与所需的盐溶液反应而制备。
本发明的目的在于提供适合用作饲料添加剂的D-泛酸及其盐的新的制备形式。
另外，本发明的目的在于提供比已知的方法更经济和更有效的制备方法。
本发明提供了基于发酵液的动物饲料添加剂，其特征在于其含有a)D-泛酸和/或其盐，特别是碱金属或碱土金属盐，b)发酵中形成的0-100％量的生物量，以及c)至少较大部分的发酵液中的其它溶解成分，以及d)其以固体形式存在，特别是以细碎或颗粒和自由流动的形式存在。
根据要求，添加剂通常以喷雾干燥或冻干、细碎、自由流动的粉末形式提供，或以颗粒形式提供，其可含有不同比例的生物量。体积密度约500kg/m3。该添加剂是储存稳定的。
如果分离生物量，天然地，其它例如无机固体也被除去。另外，本发明的添加剂至少含有大部分所产生的其它物质或溶解在发酵液中的任何添加物质，只要其未被合适的方法所分离。
这些物质可包括在发酵过程中由所用微生物产生和分泌的除D-泛酸之外的有机二级产物。这些物质包括选自L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、或L-色氨酸的L-氨基酸，特别是L-缬氨酸。另外也包括含有多至3个羧基的有机酸如乙酸、乳酸、柠檬酸、马来酸或富马酸。最后也包括转化力弱的糖如海藻糖。如果这些化合物对添加剂价值有贡献，则任选地它们是所希望的。
另外，这些物质可包括所用的可转化糖如葡萄糖或蔗糖的集合。
本发明还提供了用于制备含有D-泛酸和/或其盐的饲料添加剂的方法，其特征在于
a)经发酵制备通常含有钠、钾、铵、镁或钙盐的含D-泛酸发酵液，
b)任选地从其中完全或部分分离生物量，
c)向如此获得的溶液或发酵液中加入碱土金属或碱金属的氢氧化物或氧化物，优选以针对D-泛酸的化学计量的量加入，以及
d)将如此获得的混合物干燥、喷雾干燥、喷雾成粒或粒化。
本发明还提供了从发酵液中制备含有20-80％(干重)的D-泛酸和/或其钠、钾、铵、镁或钙盐的饲料添加剂的方法，其特征在于如下步骤：
a)优选地从发酵液中除去水(浓缩步骤)，
b)任选地，除去0-100％的发酵中形成的生物量，
c)向a)和b)中获得的发酵液中加入一或多种所提到的化合物，其中所加入的化合物的重量是使得其在动物饲料添加剂中的总浓度为20-80％(重量)，特别是50-80％(重量)，
d)干燥c)中获得的发酵液从而以所希望的粉末或颗粒形式获得动物饲料添加剂。
用适合产生D-泛酸的微生物获得的含有D-泛酸和/或其盐的发酵液适用于本发明方法。
微生物可以是真菌或酵母如Debaromyces castellii或革兰氏阳性细菌如棒杆菌属成员或革兰氏阴性细菌如肠细菌科成员。肠细菌科特别提及的是埃希氏杆菌属如大肠埃希氏杆菌种。在大肠埃希氏杆菌种中，可提及的是所谓的K-12菌株如菌株MG1655或W3110(Neidhard等：大肠埃希氏杆菌和沙门氏菌细胞和分子生物学(ASM出版社，华盛顿特区))或大肠埃希氏杆菌野生型菌株IFO3547(发酵研究所，日本大阪)及其突变体。同样，在从IFO3547制备的菌株中，特别提及的是命名为FV5069/pFV31(EP-A-0590857)和FV5069/pFV202(WO97/10340)的菌株。棒杆菌属特别提及的是谷氨酸棒杆菌种。
上述微生物可经分批培养、补料分批培养或重复补料分批培养方法而连续或分批培养用于生产D-泛酸。公知的培养方法的综述见Chmiel的教科书(生物加工技术I：生物方法导论(Gustav FischerVerlag，斯图加特，1991))或者Storhas的教科书(生物反应及外围设备(Viewweg Verlag，不伦威克/威斯巴登，1994)。
所用的培养基必须以合适的方式满足特定微生物的要求。各种微生物的培养基的描述见美国细菌学协会出版的“通用细菌学方法手册”(美国华盛顿特区，1981)。可用作碳源的物质有糖和碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素，油和脂肪如大豆油、葵花子油、核桃油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇类如甘油和乙醇，有机酸如乙酸。这些物质可单独使用或混和使用。含有机氮的化合物如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、豆粉和尿素以及无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵可用作氮源。氮源可以单独使用或混和使用。磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的钠盐可用作磷源。培养基还必须含有金属盐如硫酸镁或硫酸铁，它们是生长所必需的。最后，除上述物质外，还加入促进生长所必需的物质如氨基酸和维生素。另外，D-泛酸的前体如天冬氨酸、β-丙氨酸、酮异戊酸、酮泛解酸或泛解酸以及任选地它们的盐可加入到培养基中。所述的原料可以一个批次的形式加入培养物中，或者可以在培养过程中以合适的方式加入培养物中。
优选使用氨或氨水调节pH。任选地其它碱性化合物如氢氧化钠或氢氧化钾也是适合的。如果需要酸性化合物，则可以适当方式使用磷酸或硫酸。为控制气泡产生，使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯。合适的选择性作用物质如抗生素任选地加入到培养基中以保持质粒的稳定性。为保持有氧条件，将氧气或含氧气体混合物如空气流经培养物。培养温度通常为20-45℃，优选为20-40℃。持续培养直至产生最大量的D-泛酸。这一目标通常在10-160小时内达到。
以这种方式获得的发酵液通常干重为7.5-26％(重量)，所含的D-泛酸浓度为＞0至20％(重量)。在发酵完成后D-泛酸量为干重的2-20％(重量)的发酵方法是特别优选的。还优选的是发酵方法以至少在发酵后期限糖方式进行，更有利的是在至少30％发酵时间内限糖。即在此期间内发酵培养基中的可转化糖浓度保持在≥0至3g/l或低于此浓度。
在一个加入铵离子以制备本发明的添加剂的变化方法中，任选地在开始时以公知的分离方法如离心、过滤、倾到或其组合方法从含D-泛酸的发酵液中完全或部分除去生物量。但是，根据本发明，也可使全部生物量保留在发酵液中。最后，通常将针对D-泛酸为0.8-1.2、优选地0.95-1.1当量的碱金属或碱土金属氧化物或氢氧化物特别是NaOH、KOH、Ca(OH)2或MgO加入到发酵液中。当D-泛酸浓度较低时，有利的是使用更大量的氧化物或氢氧化物如1.2-4当量。以这种方式获得的悬液通常在干燥前被浓缩至干重的60％(重量)。还可以先浓缩发酵液然后加入氧化物或氢氧化物。所获得的浓缩物然后在常规的干燥器中或使用降膜蒸发器或薄层蒸发器或喷雾干燥器或喷雾成粒机或冻干装置转化成可倾到的自由流动的细碎粉末或颗粒。粒化也可在干燥后进行，例如以组合粒化形式进行。
另外，本发明人发现了以快速经济的方式制备含D-泛酸的铵盐、钾盐、钠盐、镁盐或钙盐的粉末或含有这些粉末的提供形式的新方法。为此，用相应的羟基化合物制备含D-泛酸的发酵液，任选地通过公知的分离方法如离心、过滤、倾到或其组合方法首先完全或部分除去生物量。但是根据本发明也可使全部生物量保留在发酵液中。然后，用公知的方法如用旋转式蒸发器或薄层蒸发器或降膜蒸发器将任选地预处理的发酵液浓缩或干燥。然后用喷雾干燥、喷雾成粒或冻干或其它方法将任选地预处理的发酵液加工成可倾到的自由流动的细碎粉末或颗粒。
本发明的新的动物饲料添加剂通常含有相对于总重量20-80％(重量)、优选地30-75％(重量)的D-泛酸和/或其盐。它们通常还含有2.5-25％(重量)的无机成分以及任选地＞0-30％(重量)的有机二级产物。干生物量的比例为0-35％(重量)。水含量优选≤5％(重量)。所需浓度的D-泛酸和/或所述的一或多种盐任选地通过向发酵产生的产物中加入相应的化合物而产生。所需化合物优选地在干燥或喷雾干燥前、特别是在浓缩混合物后以溶液或干物质的形式加入到混合物中并与其混和。以这种方式获得的产物用作饲料添加剂。
D-泛酸的浓度可通过已知方法确定(Velisek；层析科学60，515-560(1992))。
实施例
本发明参照以下实施例更详细地描述。为此，用产生D-泛酸的菌株大肠杆菌5069/pFV31进行实验，该菌株已根据布达佩斯条约保藏在工业科学技术代理机构发酵研究所(Fermentation ResearchInstitute，Agency of Industrial Science and Technology)(1-1-3，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本)，保藏号为FERM-BP 4395。
实施例1
制备含有D-泛酸的发酵液
1、制备接种物
将大肠杆菌FV5069/pFV31样品涂布在补加50μg/ml氨苄青霉素的LBG琼脂上，在37℃保温这一琼脂板培养物17小时，然后在冰箱中于4℃储存。然后在LBG液体中进一步培养所选的几个菌落，LBG液体具有如下组成：10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l NaCl和1g/l葡萄糖。LBG琼脂还含有12g/l琼脂。可从Gibco/BRL(Paisley，英国苏格兰)购买制备为LB液体基质或LB琼脂的制剂，加入1g/l葡萄糖后，获得上述培养基。将10毫升培养物置于100毫升锥形瓶中，在37℃以180rpm在购自Kuhner AG(Birsfelden，瑞士)的ESR培养箱中保温16小时，然后在Beckman(Hannover，德国)的J-6B离心机中将细胞悬液以4000rpm离心15分钟。将细胞沉淀重悬在10毫升补加20％甘油的LBG培养基中，在无菌条件下分成每瓶1毫升的10个等份，在-70℃冷冻。这些培养物用作主细胞库。
为制备实验细胞库，将含有50μg/ml氨苄青霉素的LBG培养基以10毫升的量加入100毫升锥形瓶中，并用100微升上述主细胞库接种。将该混合物在37℃以180rpm在购自Kuhner AG(Birsfelden，瑞士)的ESR培养箱中保温16小时。保温后用来自Dr.Lange Co.(德国柏林)的LP2W光度计在660nm测量波长测定培养悬液的光密度(OD)，其是3.5。然后将细胞悬液在无菌条件下置于来自Greiner公司(Frickenhausen，德国)的无菌30毫升聚乙烯试管中，用Beckman(Hannover，德国)的J-6B离心机在2500rpm离心15分钟。将分离的生物量重悬于补加20％甘油的10毫升LBG培养基中，然后在无菌条件下将细胞悬液以500微升比例加入来自Nalgene公司的1毫升无菌(sic)中，在-70℃冷冻。以这种方式制备的保存部分用作实验细胞库。
2.制备含有D-泛酸的发酵液
为制备含有D-泛酸的发酵液，首先在摇瓶培养扩增实验细胞库，并用其接种预发酵罐。来自预发酵罐的培养物用于接种生产发酵罐。
SKA培养基用于摇瓶培养，如下制备SKA培养基：将7.0g(NH4)2SO4、0.5g KH2PO4、1.0g K2HPO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.01gMnSO4·H2O、0.005g Fe2(SO4)3和已用25％氨水溶液调节pH至6.8的20g玉米浆称重加入1升玻璃烧杯中，然后加入875毫升蒸馏水。在121℃在高压灭菌器中将此含玉米浆的盐溶液灭菌20分钟。另外，经过滤灭菌由125g蒸馏水、28.7g葡萄糖和0.002g盐酸硫胺素组成的溶液。将10g CaCO3称重加入100毫升烧瓶中，并在123℃高压灭菌20分钟。通过将上述两种组分与含玉米浆的盐溶液合并获得SKA培养基。
将此SKA培养基以12.5毫升每份加入100毫升锥形瓶中，然后用0.5ml细胞悬液接种。用无菌生理盐水以1∶100稀释的实验细胞培养物保存部分用作细胞悬液。在购自Infors公司(Bottmingen，瑞士)的RC-1-TK保温箱中以150rpm在32℃保温20小时。之后在660nm测定波长的光密度(OD660)测得为12.5。
用4.5ml生理盐水稀释0.5ml这种摇瓶培养物，用0.7ml稀释液接种已预先置于购自Braun Diessel Biotech GmbH(Melsungen，德国)的BiostatMD型2升实验室发酵罐中的1300毫升培养基。
所述培养基如下制备：用25％氨溶液调整由9.81g(NH4)2SO4、0.7gKH2PO4、1.402g K2HPO4、0.70g MgSO4·7H2O、0.014g MnSO4·H2O、0.014g Fe2(SO4)3和28.04g玉米浆于1300毫升自来水中组成的溶液的pH至6.5，并在高压灭菌器中于121℃灭菌20分钟。在无菌条件下向此含玉米浆的盐溶液中加入单独过滤灭菌的含有40.62g葡萄糖和0.0042g盐酸硫胺素于100g蒸馏水中的溶液。
在37℃发酵16小时，曝气速率为1vvm，溶解氧保持在20％，pH保持在6.5。用25％浓度的氨水溶液作为pH调节剂。光密度为13.1。用90毫升这一培养物接种1144毫升生长培养基用于在2升实验室发酵罐BiostatMD型中进行主发酵程序。
如下制备生长培养基。用25％氨溶液调整由4.14g(NH4)2SO4、0.744g KH2PO4、1.0g K2HPO4、0.83g MgSO4·7H2O、0.0124gMnSO4·H2O、18.87g β-丙氨酸、0.74g Struktol J647和49.72g玉米浆于1144毫升自来水中组成的溶液的pH至6.5，并在高压灭菌器中于121℃灭菌20分钟。在无菌条件下向此含玉米浆的盐溶液中加入单独过滤灭菌的含有35.92g葡萄糖和0.002g盐酸硫胺素于100ml蒸馏水中的溶液。
在37℃发酵40小时，在生长期pH为6.5，曝气速率为1vvm，在生产期pH为6.0，曝气速率为1.5vvm。在两种期间溶解氧均保持在低于2％。用25％浓度的氨溶液作为pH调节剂。在发酵过程中，生产培养基1和生产培养基2分步加入。在培养过程中一次加入玉米浆。生产培养基1含有在584毫升自来水中的465.29g葡萄糖和0.0261g盐酸硫胺素，并已过滤灭菌。生产培养基2含有在140毫升自来水中的37.5g β-丙氨酸并已在121℃高压灭菌20分钟。发酵7.5小时后并接近培养阶段末期时，分步加入生产培养基1。培养10.5小时后，在无菌条件下加入已在121℃高压灭菌20分钟的溶解在100毫升自来水中的49.5g玉米浆。发酵12.5小时后并接近培养阶段末期时，以3.5g/h的添加速率加入生产培养基2。培养41小时后，在发酵液中发现浓度为6.1％(重量)的泛酸。
用购自Knauer(德国柏林)的M321型HPLC(高效液相色谱)装置，用5μm粒径的Hypersil APS2氨基相经RI(折射指数)检测法测定D-泛酸的浓度。
实施例2
在如实施例1相同条件下进行的一个发酵实验中，在培养43小时后在发酵液中检测到浓度为5.4％(重量)的泛酸。L-缬氨酸浓度为8g/l。
实施例3
制备D-泛酸钙
首先从根据实施例1和2所述方法制备的含有约6.1％(重量)D-泛酸的含泛酸发酵液中除去生物量。为此，将1升上述发酵液用实验室离心机即购自Heraeus(Dusseldorf，德国)的Biofuge-Stratos型离心机在4000rpm离心20分钟，上清离心液在一购自ICT有限公司(Bad Homburg，德国)的UF装置中用30kD的MRC聚合物膜经逆流超滤而进一步纯化。
然后搅拌下分批加入10.1g固体Ca(OH)2(96％，MERCK，Darmstadt，德国)，随之pH约为10.3。然后在一购自Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德国)的Rotavapor RE-120旋转蒸发器中在真空下于60℃浓缩如此处理的发酵液至液体含量约50％干重。随后将如此获得的浓缩发酵液喷雾干燥以制备D-泛酸的钙盐。为此，使用购自Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德国)的Buchi-190实验室喷雾干燥器，入口温度107℃、出口温度85℃、压差-40mbar、空气流速600NL/h。
以这种方式制备的含有D-泛酸钙的产物具有68.5％(重量)的泛酸浓度，其是自由流动的，体积密度为460mg/ml。储存5个月后D-泛酸的浓度为67.6％(重量)。
实施例4
制备D-泛酸钠
首先从根据实施例1和2所述方法制备的含有约6.1％(重量)D-泛酸的含泛酸发酵液中除去生物量。为此，将1升上述发酵液以如实施例3相同的方式离心和超滤。
然后搅拌下分批加入10.6g NaOH(99％，MERCK)，随之pH约为10。然后在一购自Buchi-Labortechnik有限公司的Rotavapor RE-120旋转蒸发器中在真空下于50-60℃浓缩如此处理的发酵液至液体含量约50％干重。随后将如此获得的浓缩发酵液在一购自Leybold(Cologne，德国)的LYOVAC GT2冷冻干燥器中冷冻干燥以制备D-泛酸的钠盐。
以这种方式制备的含有D-泛酸钠的产物具有63.8％(重量)的D-泛酸浓度，并且是自由流动的。储存5个月后D-泛酸的浓度为63.0％(重量)。
实施例5
制备D-泛酸镁
首先从根据实施例1和2所述方法制备的含有约6.1％(重量)D-泛酸的含泛酸发酵液中除去生物量。为此，将1升上述发酵液以如实施例3相同的方式离心和超滤。
然后搅拌下分批加入5.4g MgO(97％，MERCK)，随之pH约为9-10。然后在一购自Buchi-Labortechnik有限公司的Rotavapor RE-120旋转蒸发器中在真空下于50-60℃浓缩如此处理的发酵液至液体含量约50％干重。随后将如此获得的浓缩发酵液在一购自Leybold的LYOVAC GT2冷冻干燥器中冷冻干燥以制备D-泛酸的镁盐。
以这种方式制备的含有D-泛酸镁的产物具有64.7％(重量)的D-泛酸浓度，并且是自由流动的。储存5个月后D-泛酸的浓度为64.4％(重量)。
实施例6
制备D-泛酸钾
首先从根据实施例1和2所述方法制备的含有约6.1％(重量)D-泛酸的含泛酸发酵液中除去生物量。为此，将1升上述发酵液以如实施例3相同的方式离心和超滤。
然后搅拌下分批加入17.4g KOH(85％，MERCK)，随之pH约为10-11。然后在一购自Buchi-Labortechnik有限公司的Rotavapor RE-120旋转蒸发器中在真空下于60℃浓缩如此处理的发酵液至液体含量约50％干重。随后将如此获得的浓缩发酵液在一购自Leybold的LYOVAC GT2冷冻干燥器中冷冻干燥以制备D-泛酸的钾盐。
以这种方式制备的含有D-泛酸钾的产物具有63.5％(重量)的D-泛酸浓度，并且是自由流动的。储存5个月后D-泛酸的浓度为62.9％(重量)。
实施例7
制备D-泛酸铵
首先从根据实施例1和2所述方法制备的含有约6.1％(重量)D-泛酸的含泛酸发酵液中除去生物量。为此，将1升上述发酵液以如实施例3相同的方式离心和超滤。
然后搅拌下分批加入5.4g MgO(97％，MERCK)，随之pH约为9-10。然后在一购自Buchi-Labortechnik有限公司的Rotavapor RE-120旋转蒸发器中在真空下于50-60℃浓缩如此处理的发酵液至液体含量约50％干重。随后将如此获得的浓缩发酵液在一购自Leybold的LYOVAC GT2冷冻干燥器中冷冻干燥以制备D-泛酸的铵盐。
以这种方式制备的含有D-泛酸铵的产物具有66.8％(重量)的D-泛酸浓度，并且是自由流动的。
实施例8
从含有生物量的发酵液中制备D-泛酸钙
首先将根据实施例1和2所述方法制备的含有约6.1％(重量)D-泛酸的含泛酸发酵液在一购自Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德国)的Rotavapor RE-120旋转蒸发器中在真空下于60℃浓缩至体积为1.0升，液体含量约30％干重。然后搅拌下分批加入10.1g Ca(OH)2(96％，MERCK，Darmstadt，德国)，随之pH约为10。随后将如此处理和浓缩的含生物量发酵液喷雾干燥以制备D-泛酸的钙盐。为此，使用购自Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德国)的Buchi-190实验室喷雾干燥器，入口温度107℃、出口温度85℃、压差-40mbar、空气流速600NL/h。
以这种方式制备的含有D-泛酸钙的产物具有49.8％(重量)的泛酸浓度，其是自由流动的，体积密度为480mg/ml。生物量含量约30％(重量)。
实施例9
从谷氨酸棒杆菌制备含有D-泛酸钙和生物量的产物
1、制备谷氨酸棒杆菌的产泛酸菌株
美国专利5,188,948描述了产L-缬氨酸的乳发酵短杆菌菌株FERM BP-1763。DE 19855313.7公开了含有来自谷氨酸棒杆菌的panB，panC和panD基因的质粒pND-DBC2(图1)，该质粒以菌株ATCC13032/pND-DBC2的形式保藏在德意志微生物保藏中心(德国不伦瑞克)，保藏号为DSM 12437。通过用质粒pND-DBC2转化菌株FERM BP-1763获得产泛酸的菌株FERM BP-1763/pND-DBC2。
2、制备含泛酸的发酵液
将乳发酵短杆菌FERM BP-1763/pND-DBC2样品涂布在HHK琼脂上。
HHK琼脂由Merck KgaA(Darmstadt，德国)出售的脑/心琼脂补加卡那霉素组成。
在37℃培养这一琼脂平板培养物17小时，然后储存于+4℃冰箱。然后在同一培养基上进一步繁殖所选的菌落。然后从HHK琼脂上取下一个克隆的细胞材料并用接种环转移进置于总体积为1000毫升的摇瓶中的100毫升HHK液体。
HHK液体由Merck KgaA(Darmstadt，德国)出售的脑/心培养基补加葡萄糖和卡那霉素组成。HHK液体的组成见表8b。
      表8a：HHK琼脂
物质     每升的量
脑/心琼脂     52.0g
卡那霉素     25mg
      表8b：HHK液体
物质     每升的量
脑/心琼脂     37.0g
卡那霉素     25mg
葡萄糖     20.0g
在30℃、150rpm保温混合物22小时。培养过程完成后，在660nm波长在光度计中测量的光密度为6.1(OD 660)。用菌株FERM BP-1763/pND-DBC2的这一培养物接种生产发酵罐。
用表8c给出的培养基SK-71进行发酵。SK-71培养基中的所有组分根据工作浓度直接在开始时导入发酵罐并原地灭菌。
      表8c：培养基SK-71
化合物 每升的量
葡萄糖水合物 110.0000g
玉米浆(CSL) 5.0000g
β-丙氨酸 5.0000g
烟酸 0.0050g
1-异亮氨酸 0.1500g
高丝氨酸 0.1500g
硫酸铵 25.0000g
磷酸二氢钾 0.1000g
七水硫酸镁 1.0000g
七水硫酸铁 0.0100g
一水硫酸锰 0.0050g
CaCl2 *2H2O 0.0100g
盐酸硫胺素 0.0002g
D(+)生物素 0.0003g
Struktol 0.60g
用来自B.Braun公司(BBI，德国，Melsungen，型号Biostat E/ED)的10升搅拌式反应器作为发酵罐。
用在上述HHK液体中的100毫升摇瓶预培养物接种1950g发酵培养基SK-71。
在整个发酵时间内在30℃培养混合物，根据氧耗，曝气体积特异性速率为0.75vvm，搅拌速率为800-1700rpm，pH为7.0，氧气部分压力为20％空气饱和度。在上述条件下培养培养物总计49小时，直至达到OD660为26.2。用氨水溶液(25％w/v)作为修正培养基以调节pH。
然后用来自Dr.Bruno Lange有限公司(德国柏林)的LP1W型数字式光度计在660nm测定波长测定光密度(OD)，用HPLC(HypersilAPS 25μm，250×5mm，RI检测)测定D-泛酸浓度。
49小时后在最终发酵样品中测得D-泛酸浓度约为0.2g/l。
3、制备含泛酸产物
用实施例9.2所述方法制备D-泛酸浓度约为0.02％(重量)的含D-泛酸发酵液。1.4升体积的这一发酵液首先在Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德国)制造的Rotavapor RE-120型旋转式蒸发器中在真空下于60℃蒸发成干固体含量约为15％的液体。然后搅拌下按比例加入27.1g固体Ca(OH)2(96％；MERCK，Darmstadt，德国)，随之pH约为10。随后将37.7gD-泛酸钙(＞98％，Euro OTC Pharma有限公司，Kamen，德国)加入到如此处理和浓缩的含生物量发酵液中。使用购自Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德国)的Buchi-190型实验室喷雾干燥器，入口温度107℃、出口温度85℃、压差-40mbar、空气流速600NL/h，进行最终的喷雾干燥程序。
以这种方式制备的含有D-泛酸钙的产物具有约35％(重量)的D-泛酸浓度，其是可倾到的，体积密度为600mg/ml。谷氨酸棒杆菌-生物量的比例约3.5％(重量)。
实施例10
从啤酒糖酵母制备含D-泛酸钙和生物量的产物
1、制备啤酒糖酵母的产泛酸菌株
阅读框架YHR063c的扩增：
从啤酒糖酵母阅读框架YHR063c(登录号U00061，国立生物技术中心，Bethesda，MD，USA)的核苷酸序列起始，合成下述PCR引物(MWG-Biotech，Ebersberg，德国)。该阅读框架的起点和终点以句点(.)表示：·oJD539(5’EcoRI-NotI START)：5’-GCG CGA ATT CAG ATC CGC GGC CGC AAA GAG GAGAAA TTA ACT.ATG ACT GCA CCA CAC AGA AG-3’·oJD540(3’SpeI-PstI STOP)：5’-CGC GAC TAG TCT GCA G.TC AGT CCT TTC TCC AGTCAC-3’
用C.Guthrie和G.R.Fink方法(酵母遗传学和分子生物学指南，酶学方法，194卷，学术出版社，圣地亚哥，CA，1991)分离的啤酒糖酵母菌株JD242的基因组DNA用作模板。这一菌株是基因组已被测序(Goffeau等，科学274，546页，1996)的双倍体菌株SC288C(Winston等，酵母11，53ff.1995)的单倍体分离株。用C.Guthrie和G.R.Fink方法(酵母遗传学和分子生物学指南，酶学方法，194卷，学术出版社，圣地亚哥，CA，1991)进行四分体分析。菌株JD242是亮氨酸(1eu2Δ1等位基因)和尿嘧啶(ura3-52等位基因)营养缺陷型。用Roche公司(Mannheim)的“高可靠性扩增聚合酶”试剂盒在制造商指定的条件下经28个PCR循环扩增约1.2kB的DNA片段。在0.8％浓度的琼脂糖凝胶中经电泳分离确定片段大小。
pJD-YHR063c的结构：
为了在啤酒糖酵母中表达YHR063c阅读框架，将PCR扩增子掺入大肠杆菌-啤酒糖酵母穿梭载体pJDCEX2(图2，Dohmen等，1995，生物化学杂志270，18099-18109)。
首先用EcoRI和SpeI(AGS，Heidelberg，德国)酶切PCR产物，然后将其与已用EcoRI和XbaI处理的pJDCEX2-DNA混合，并用T4-DNA连接酶(Roche，Mannheim，德国)连接。连接混合物转化大肠杆菌菌株XL1-blue(Bullock等，1987，生物技术5，376)，在含有150μg/ml氨苄青霉素(Sigma，Deisenhofen，德国)的LB琼脂上选择转化子。经碱性细胞裂解(Sambrook等：分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版社，1989)从氨苄青霉素抗性克隆制备质粒DNA。然后用NotI和PstI限制消化，随后在0.8％琼脂糖凝胶上分离而测试分离的质粒DNA。具有所需结构的质粒命名为pJD-YHR063c(图3)。
制备菌株JD242/pJD-YHR063c：
用Dohmen等的方法(Dohmen等，酵母7，691，1991)用质粒pJD-YHR063c转化啤酒糖酵母菌株JD242。在使用1.8％琼脂的无亮氨酸最小培养基SD上选择转化子(见表9a和9b)。
表9a：最小培养基SD
化合物 每升的量
(NH4)2SO4 5g
KH2PO4 1g
MgSO4 *7H2O 0.5g
NaCl 0.1g
CaCl2 0.1g
H3BO3 500μg
CuSO4 40μg
KI 100μg
FeCl3 *6H2O 200μg
MnSO4 *H2O 400μg
Na2MoO4 *2H2O 400μg
ZnSO4 *7H2O 200μg
生物素 2μg
叶酸 2μg
肌醇 2mg
烟酸 400μg
p-氨基苯甲酸 200μg
盐酸吡哆醇 400μg
核黄素 200μg
盐酸硫胺素 400μg
表9b：最小培养基SD
添加的物质 每升的量
葡萄糖 20g
尿嘧啶 40mg
CuSO4 24mg
-Leu DO补加剂 650mg
酮泛解酸 100mg
β-丙氨酸 100mg
2、制备含泛酸发酵液
为制备含D-泛酸发酵液，首先将啤酒糖酵母JD242/pJD-YHR063c的单个菌落涂布在具有最小培养基SD的琼脂平板上并在30℃保温3天。为在摇瓶中制备第一预培养物，用5ml最小培养基SD洗下细胞。然后用2.5ml这一细胞悬液接种含50ml最小培养基SD(表9a和9b)的每个摇瓶(总体积500ml)，并在Infors股份公司(Bottmingen，瑞士)的RC-1-TK培养箱中在30℃和130rpm培养6小时，直至在660nm波长处测定的光密度(OD660)为1.9。第二预培养物是在含150ml最小培养基SD(表9a和9b)的1000ml baffle-烧瓶中制备，每个烧瓶接种50ml上述预培养物1。在30℃和80rpm培养20小时，直至在660nm波长处测定的光密度(OD660)为3.8。产生泛酸的主发酵在总体积6000ml圆底烧瓶中的1500ml最小培养基SD(表9a和9b)中进行。为此，用90ml预培养物2接种每个圆底烧瓶，然后在30℃和60rpm培养30小时。
用来自Dr.Bruno Lange有限公司的LP1W型数字式光度计在660nm测定波长测定光密度(OD)。根据DIFCO的“DIFCO手册”中的数据(Michigan，USA，10th版，1100-1102(1984))用菌株Lactobacillus plantarum ATCC确定所获得的D-泛酸的浓度。
光密度(OD660)约为4，D-泛酸浓度约为1mg/l。
3、制备含泛酸的产物
用实施例10.2中的方法制备D-泛酸浓度约为1mg/l的含泛酸发酵液。6.0升体积的这一发酵液首先在Buchi-Labortechnik有限公司(Konstanz，德国)制造的Rotavapor RE-151型旋转式蒸发器中在真空下于60℃蒸发成干固体含量约为16％的液体。然后搅拌下按比例加入15.9g固体Ca(OH)2(96％；MERCK，Darmstadt，德国)，随之pH约为9.2。随后将28.4gD-泛酸钙(＞98％，Euro OTC Pharma有限公司，Kamen，德国)加入到如此处理和蒸发的含生物量发酵液中。使用购自Leybold公司(Cologne，德国)的LYOVAC GT 2型冷冻干燥器冷冻干燥。
以这种方式制备的含有D-泛酸钙的产物具有约26.5％(重量)的D-泛酸浓度，其是可倾到的，体积密度为450mg/ml。啤酒糖酵母生物量的比例约6.8％(重量)。
附图
图1：质粒pND-DBC2图。
图2：质粒pJDCEX2图。
图3：质粒pJD-YHR063c图。
所用缩写如下：图1：rrnBT1T2：rrnB基因的转录终止子Ptac：tac启动子panB：panB基因的编码区panC：panC基因的编码区panD：panD基因的编码区rep-C.g.：谷氨酸棒杆菌中的用于复制的DNA区域oriV-E.c.：在大肠杆菌中的营养转移起点kan：卡那霉素抗性基因BglII：酶BglII的裂解位点ClaI：酶ClaI的裂解位点NotI：酶NotI的裂解位点NruI：酶NruI的裂解位点PvuI：酶PvuI的裂解位点SacI：酶SacI的裂解位点SalI：酶SalI的裂解位点ScaI：酶ScaI的裂解位点SphI：酶SphI的裂解位点XhoI：酶XhoI的裂解位点图2和图3：LEU2：啤酒糖酵母的B-异丙基马来酸脱氢酶基因2μ：啤酒糖酵母的内源性2μ质粒的序列ApR：β-内酰胺酶基因P-CUP1：啤酒糖酵母CUP1基因(金属硫蛋白)的启动子T-CYC1：啤酒糖酵母CYC1基因(细胞色素C)的终止子SD：Shine Dalgarno序列EcoRI：酶EcoRI的裂解位点NotI：酶NotI的裂解位点SpeI：酶SpeI的裂解位点XbaI：酶XbaI的裂解位点

Claims (14)

1、动物饲料添加剂，其含有D-泛酸和/或其盐并基于发酵液，其特征在于含有：
a)D-泛酸和/或其盐，
b)产D-泛酸微生物的发酵过程中产生的0-100％生物量，
c)至少大部分的发酵液中的其它成分，并且
d)其以固体、细碎或颗粒状自由流动的形式存在。
2、权利要求1的动物饲料添加剂，其特征在于其含有一或多种选自D-泛酸的钠盐、钾盐、铵盐、镁盐或钙盐的盐。
3、权利要求1或2的动物饲料添加剂，其特征在于其含有含量为＞0，特别是20-80重量％(干重)的D-泛酸和/或其一种盐。
4、权利要求1的动物饲料添加剂，其特征在于其以喷雾干燥或喷雾颗粒形式存在。
5、前述一项或多项权利要求所述的动物饲料添加剂，其特征在于其还含有一或多种选自L-甲硫氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-苏氨酸或L-色氨酸的L-氨基酸。
6、一种从发酵液制备权利要求1-5的含有D-泛酸和/或其盐的饲料添加剂的方法，其特征在于
a)任选地从含有D-泛酸和/或其盐的发酵液中完全或部分除去生物量和/或一些其它成分，
b)向如此获得的溶液或发酵液中加入碱土金属或碱金属的氢氧化物或氧化物，以及
c)将如此获得的混合物干燥、喷雾干燥、喷雾成粒或粒化。
7、权利要求6的方法，其特征在于选自钠、钾、铵、镁或钙化合物的氧化物或氢氧化物以针对D-泛酸为0.8-1.2、优选地0.95-1.1的化学计量比例加入。
8、制备含有D-泛酸和/或其钠盐、钾盐、铵盐、镁盐或钙盐的权利要求1-5的饲料添加剂的方法，其特征在于
a)任选地用所需的羟基化合物从获得的含D-泛酸盐的发酵液中完全或部分除去生物量和/或一些成分，
b)优选地通过除去水浓缩如此获得的混合物，以及
c)通过干燥、喷雾干燥或喷雾成粒获得固体形式的含有相应的泛酸盐的饲料添加剂。
9、从发酵液中制备含有浓度为20-80重量％(干重)的D-泛酸和/或其钠盐、钾盐、铵盐、镁盐或钙盐的动物饲料添加剂的方法，其特征在于如下步骤：
a)优选地从发酵液中除去水(浓缩步骤)，
b)任选地，除去0-100％的在发酵期间形成的生物量，
c)向步骤a)和b)获得的发酵液中加入一或多种所述化合物，其中所加入的化合物的重量为其在动物饲料添加剂中的总浓度为约20-80重量％，以及
d)干燥步骤c)获得的发酵液从而获得所需粉末或颗粒形式的动物饲料添加剂。
10、权利要求9的方法，其特征在于在优选地进行的浓缩步骤之前或之后向发酵液中加入所述的碱金属或碱土金属的氧化物或氢氧化物。
11、权利要求6-9的方法，其特征在于真菌或酵母用于发酵过程。
12、权利要求9的方法，其特征在于向任选地浓缩的发酵液中加入一或多种选自L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-丙氨酸、L-苏氨酸或L-色氨酸的L-氨基酸。
13、权利要求6-11的方法，其特征在于来自棒杆菌属的细菌用于发酵过程。
14、权利要求6-11的方法，其特征在于来自肠细菌科的细菌用于发酵过程。
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